resultaten

Identificatie van de IL-7-Receptor α-keten (CD127) als Marker voor geheugenT-cellen. Tijdens het zoeken naar nieuwe markers om effector en geheugen T cel subsets in de muis te definiëren, analyseerden we oppervlakte-expressie van de IL-7 receptor α-keten / CD127 (Fig. 1 bis). Tijdens primaire reacties op Lm, kunnen de verschillende subpopulaties van antigeen-specifieke milt t celpopulaties worden onderscheiden gebaseerd op CD127 uitdrukkingsniveaus. CD127 cellen met lage expressie (CD127low) overheersen tijdens de acute effectorfase. Tijdens de overgang in de fase van de geheugenT-cel, echter, verdwijnen CD127low-cellen geleidelijk, terwijl populaties die hoge niveaus (CD127high) uitdrukken opmerkelijk stabiel in grootte in de tijd blijven (Fig. 1 a en c). Deze verschillende kinetische waarden suggereren sterk dat CD127 uitdrukking een selectief kenmerk is voor langlevende geheugenT cellen. Tijdens de effectorfase migreren CD127low CD8 + T-cellen bij voorkeur naar nonlymphoid organen, terwijl alleen CD127high CD8 + T-cellen worden gedetecteerd in LN (Fig. 1 ter). De milt vertegenwoordigt een” tussenorgaan ” waar alle verschillende subpopulaties worden gevonden vroeg na immunisatie (22, 23). Later tijdens de geheugenfase, worden antigeen-specifieke T cellen in alle organen gekenmerkt door een CD127high fenotype (Fig. 1 b en c). De vergelijking van de mogelijkheden van CD127low en CD127high antigeen-specifieke T cellen om zich in reactie op stimulatie te verspreiden onthulde opvallende verschillen tussen de twee subsets. Zoals in Fig. 1D, gezuiverde Listeria-specifieke Cd127hoge T-cellen prolifereren snel na anti-CD3 stimulatie, terwijl CD127low T-cellen slecht prolifereren. Het is onwaarschijnlijk dat deze verschillen in proliferatie een voordeel weerspiegelen van CD127-positieve cellen door Ab-gemedieerde il-7R-stimulatie, omdat verschillende mAb-klonen met bekende cd127-activerende of blokkerende activiteit hetzelfde effect vertoonden in kortdurende in vitro stimulatietests (gegevens niet getoond).

om meer direct aan te tonen dat langlevende geheugencellen uitsluitend aanwezig zijn in het CD127 high expression compartiment vroeg na in vivo priming, hebben we adoptieoverdrachtstudies uitgevoerd met behulp van een recent ontwikkelde reversible MHC multimer-kleuring techniek (21) om ex vivo direct antigeenspecifieke T-cellen functioneel te isoleren. Na adoptieve overdracht van CD127high LLO91-99 – specifieke T cellen van muizen die 10 dagen met Lm worden geïnfecteerd, waren de overgedragen cellen nog detecteerbaar enkele weken later in de milt van naïeve ontvanger muizen (Fig. 2a), terwijl de celaantallen na overdracht van CD127low cellen bij de opsporingslimiet waren. Deze observatie was niet te wijten aan verschillen in in vivo migratie van overgedragen CD127 high en CD127low cellen, omdat we vergelijkbare verschillen vonden voor de long (Fig. 2a) en andere organen (LN en lever, gegevens niet weergegeven). Om de interpretatie dat CD127high T-cellen uitsluitend antigeenspecifieke geheugencellen behouden, verder te ondersteunen, werden de ontvangende muizen uitgedaagd na adoptieoverdracht met Listeria-infectie. Opnieuw, slechts in muizen die CD127high T cellen vóór besmetting hadden ontvangen was snelle uitbreiding van overgedragen LLO91-99 – specifieke T cellen detecteerbaar (Fig. 2b). Nogmaals, dit resultaat was niet te wijten aan verschillen in migratie omdat het behoud of de uitbreiding van overgedragen CD127low T cellen niet detecteerbaar was in een ander orgaan (Fig. 2b en gegevens niet weergegeven). Hoewel deze resultaten van adoptieoverdrachtstudies sterk de hypothese ondersteunen dat langlevende geheugenT-cellen uitsluitend aanwezig zijn in het cd127hoge celcompartiment van T-cellen, merkten we ook substantiële beperkingen van deze experimentele benadering op. In het bijzonder, geheugen T cellen met onmiddellijke effector functie lijken vrij gevoelig voor adoptieve overdracht experimenten en sterven snel na zuivering en i.v. toepassing; hoewel ze overleven maanden tot jaren als ze onaangeroerd in vivo (11). Aldus, hoewel onze resultaten van adoptieoverdracht met de interpretatie overeenstemmen dat CD127 een marker voor langlevende geheugenT cellen is, kunnen wij niet uitsluiten dat intrinsieke problemen met betrekking tot overleving van verschillende T-cel subpopulaties ook tot de uitkomst van deze experimenten bijdragen.

Costaining van Antigeenspecifieke T-celpopulaties met CD127 en CD62L maakt onderscheid tussen geheugenT-cel subpopulaties mogelijk. Verdere karakterisering van de CD127high t-celpopulatie toonde aan dat het in subpopulaties kan worden onderverdeeld die hoge en lage niveaus van CD62L uitdrukken (Fig. 3). Directe ex vivo functionele analyse (21) van gezuiverde T-cellen (10-12 dagen na infectie, wanneer alle subpopulaties gelijktijdig in de milt kunnen worden gedetecteerd) bracht verdere functionele verschillen aan het licht. Terwijl CD62Llow T-cel subsets krachtige en onmiddellijke ex vivo cytolytische activiteit vertonen, vertonen CD127high/ CD62Lhigh T-cellen zeer slechte lysis van peptide-gecoate doelcellen (Fig. 3). Intracellulaire cytokinekleuring van gesorteerde subpopulaties toonde aan dat Cd127hoge/CD62Llow T-cellen, net als de cd127low/CD62Llow subgroep, de effectorcytokines INF-γ en tumornecrosefactor α produceren; daarentegen produceert de Cd127hoge/Cd62lhoge subgroep IL-2, maar niet IFN-γ en tumornecrosefactor α. Aldus, laat de teller combinatie van CD127 en CD62L identificatie van de cel subpopulaties van T met kenmerken toe zeer gelijkend op die eerder in mensen worden beschreven. CD127low / CD62Llow T-cellen vertonen alle bekende kenmerken van een echte effector t-celpopulatie (TE, slechte proliferatieve activiteit, beperkte in vivo overleving en onmiddellijke effectorfunctie). De cd127high / CD62Lhigh subset komt overeen met de kenmerken van TCM, en de CD127high/CD62Llow T cellen passen bij de beschrijving van tem.

genereren van afzonderlijke geheugenT-cel subpopulaties is afhankelijk van CD40L-gemedieerde T-cel hulp. Omdat we vonden dat het problematisch zou kunnen zijn om uitsluitend te baseren op de interpretatie dat CD127 expressie kan worden gebruikt als een marker om onderscheid te maken tussen effector en langlevende geheugen T cellen op adoptieve cel overdracht experimenten, besloten we om muis mutant lijnen met gebreken in de generatie van T cel geheugen te analyseren. Als CD127 inderdaad een” vroege ” geheugenT-celmarker is, zouden we in staat moeten zijn om verschillen tijdens vroege en late tijdpunten binnen de CD127-positieve deelverzamelingen in muizen met geheugendefecten te identificeren.

omdat recente studies het belang van t-celhulp voor het genereren van langdurige geheugenresponsen (2-4) hebben aangetoond, hebben we besloten om te bepalen of de aanwezigheid of afwezigheid van CD4+ T-celhulp tijdens CD8+ T-cel priming leidt tot verschillen in de antigeen-specifieke T-cel subset samenstellingen die in de vroege post-effector fase worden gedetecteerd. MHC II-deficiënte muizen, die conventionele CD4+ T-cellen missen, hebben een defecte CD8 + – geheugenrespons, en de kwaliteit van bescherming daalt na verloop van tijd (2-4). Kleuring voor T cel subpopulaties 10 dagen na primaire infectie bleek dat de CD127high / CD62Llow subset is bijna volledig afwezig in MHC II – / – muizen (Fig. 4a); de andere subpopulaties zijn aanwezig bij frequenties vergelijkbaar met die in WT c57bl/6 muizen. Deze gegevens tonen aan dat de afwezigheid van de celhulp van T efficiënte generatie van een subset van de cel van T met een fenotype van het effectorgeheugen verhindert, die voor snelle in vivo uitbreiding en effectorfunctie essentieel schijnt te zijn.

omdat belangrijke mechanismen van CD4 + T-celhulp worden gemedieerd door de interactie van CD40 en CD40L (24-26), hebben we onderzocht of CD40L–/– muizen een fenotype vertonen dat vergelijkbaar is met dat van MHC II–/– muizen. In overeenstemming met andere recente studies (27) vertonen CD40L–/– muizen geen verschillen in bacteriële belasting of bacteriële klaring na primaire Listeria-infectie (gegevens niet getoond) en vertonen ze een normale primaire CD8+ T-celrespons op een subletale dosis Lm (Fig. 4c). Echter, hun vermogen om snel te reinigen herinfectie met een hogere dosis Lm (≈10 × LD50) wordt verminderd (Fig. 4b), correlerend met verminderde CD8 + geheugen T cel reacties (Fig. 4c) en een sterk gereduceerde CD127high/CD62Llow subset (Fig. 4 e en f) tijdens de eerste fase van de post-effector. Tijdens herinfectie met Listeria is de proliferatie van reagerende T– cellen in CD40L–/ – muizen gelijkwaardig aan die van celpopulaties in WT-muizen, wat erop wijst dat het fenotype niet te wijten is aan een algemeen defect in de proliferatieve capaciteit van geheugenT-cellen (Fig. 4d) maar eerder aan verminderde aantallen geheugenT cellen geschikt om onmiddellijk aan antigeen reencounter te reageren. Dit fenotype werd aangetoond door in vivo-labeling experimenten waarin BrdUrd werd opgenomen tijdens de gehele expansiefase (Fig. 4d) en door in vivo brdurd pulse–chase studies die het verlies van etiket op proliferatie monitoren (gegevens niet getoond).

verminderde generatie van T-Celsubverzamelingen met een Effectorgeheugenfenotype, vroeg na Priming, wordt overgebracht naar de T-Celgroep met Laat geheugen. Onze gegevens tonen aan dat bij afwezigheid van CD4+ T-cellen of CD40L, de cd127high/CD62Llow T-cel subset vroeg na priming aanzienlijk wordt verminderd. Verder hebben wij (Fig. 4b) en anderen (3-5) toonden aan dat de verminderde hulp van de T-cel tijdens het primen van de T-cel tot veranderingen in de kwaliteit van beschermende immuniteit naar herinfectie met LM of lymfocytic choriomeningitisvirus leidt. Om het waargenomen defect in de vroege generatie van CD127high/ CD62Llow T-cellen duidelijker te koppelen aan de kwaliteit van het daaropvolgende t-celgeheugen in deze muizen, analyseerden we de antigeen-specifieke t-celpopulaties tijdens de geheugenfase (5 wk na primaire Listeria-infectie) in meer detail. Op dit tijdstip, moet de analyse van antigeen-specifieke T cellen op cellen worden uitgevoerd die van verschillende weefsels wegens hun verschillend migrerend gedrag worden afgeleid. Naast de milt kozen we LN als representatief weefsel voor lymfoïde organen en de long als een typisch perifeer, niet-lymfoïde compartiment. Op dit tijdstip, zijn de antigeen-specifieke T cellen in deze organen bijna alle CD127high (Fig. 1b); de cellen in de longen zijn CD62Llow (gegevens niet getoond), terwijl de meeste antigeen-specifieke geheugen T cellen in de LN zijn CD62Lhigh (Fig. 5b). Om de aantallen van antigeen-specifieke geheugenT cellen met duidelijke onmiddellijke effectorfunctie in de verschillende organen te bepalen, voerden wij intracellular cytokine kleuring voor IFN-γ uit. Zoals in Fig. 5a, CD40L – / – muizen worden gekenmerkt door substantieel verminderde aantallen antigeen-specifieke geheugenT cellen met onmiddellijke effector functie in vergelijking met WT muizen. Dit resultaat geldt voor het niveau van de frequenties (percentage) binnen het CD8+ T-celcompartiment en in absolute aantallen (Fig. 5a). MHC-tetrameerkleuring van LN-afgeleide lymfocyten (Fig. 5b) onthulde bijna identieke aantallen antigeen-specifieke T cellen met een CD62Lhigh fenotype. Sommige CD62Llow antigeen-specifieke T cellen zijn ook detecteerbaar in LNs van WT muizen, correlerend met de frequenties van IFN-γ-producerende cellen (Fig. 5a). Deze populatie is in principe afwezig in LNs van CD40L – / – muizen; de volledige CD8 + / CD62Llow subset wordt verminderd in CD40L – / – muizen, wat een algemeen defect in de generatie van deze T cel subset suggereert. Samenvattend tonen onze gegevens aan dat de afwezigheid van CD40L-afhankelijke CD4+ T-celhulp tijdens de priming periode resulteert in kwantitatieve verschillen in antigeen-specifieke CD8+ T-cel subpopulaties, met sterk verminderde aantallen cellen die een effectorgeheugenfenotype vertonen (CD127high/CD62Llow). Deze kwantitatieve verschillen in cellen met onmiddellijke vroege effectorfunctie worden overgebracht in de geheugenfase en beïnvloeden de kwaliteit van beschermende immuniteit.