Abstract
HIV-1 transcriptie wordt gereguleerd door CDK9 / cyclin T1, dat, in tegenstelling tot een typische celcyclus-afhankelijke kinase, wordt gereguleerd door associatie met 7SK small nuclear ribonuclear protein complex (snRNP). Terwijl de eiwitcomponenten van dit complex goed worden bestudeerd, wordt het mechanisme van de complexe vorming nog niet volledig begrepen. De associatie van CDK9 / cyclin T1 met 7SK snRNP wordt, gedeeltelijk, geregeld door een omkeerbare phosphorylation CDK9. Hier presenteren we een uitgebreid overzicht van de kinasen en fosfatasen die betrokken zijn bij cdk9 fosforylering en bespreken we hun rol in de regulering van HIV-1 replicatie en het potentieel om gericht te zijn op de ontwikkeling van geneesmiddelen. We stellen een nieuwe route voor van HIV-1 transcriptieregulatie via CDK9 ser-90 phosphorylation door CDK2 en CDK9 ser-175 dephosphorylation door eiwit phosphatase-1.
1. Inleiding
volledige uitroeiing van de HIV-1-infectie vereist nieuwe benaderingen om het geïntegreerde HIV-1-virus te induceren dat niet wordt beïnvloed door de bestaande antiretrovirale geneesmiddelen en dat wordt hersteld na beëindiging van de antiretrovirale therapie . De latentie van HIV-1 kan een gevolg zijn van verscheidene factoren zoals deficiëntie van HIV-1 transcriptional activator protein (Tat) of Cellulaire transcriptional activators, transcriptional interferentie met cellulaire promotors, ongunstige integratieplaats, epigenetica, en waarschijnlijk andere factoren . Aldus, is het beter begrijpen van de mechanismen van HIV-1 transcriptieactivering belangrijk voor het ontwerp van nieuwe therapeutiek gericht op inductie evenals remming van HIV-1 transcriptie. Hier, herzien wij kinases en phosphatases betrokken bij de activering van CDK9/cyclin T1 en bespreken hoe deze enzymen potentieel kunnen worden gebruikt om HIV-1 voor de ontwikkeling van toekomstige therapeutische interventies voor de behandeling van HIV-1 besmettingen te remmen of te activeren.
2. Activering van HIV-1 transcriptie door P-tefb
HIV-1 transcriptie wordt geactiveerd door HIV – 1 Tat eiwit dat bindt aan de bobbel van Tar RNA, een haarspeld-lus structuur aan het 5′-einde van alle opkomende HIV-1 transcripten, en recrueert CDK9/cyclin T1, een component van positieve transcriptie elongatie factor b (P-tefb) aan de HIV-1 promotor (in detail besproken in ; zie ook afbeelding in Figuur 1). Tijdens de transcriptie initiatie, tfiih-geassocieerde cdk7/cyclin h fosforylaten Ser-5 binnen 1ysptsps7 heptapeptide opeenvolging herhaald 52 keer in het C-einddomein (CTD) van RNAPII . Ser-5 phosphorylated RNAPII accumuleert bij 20-40 nucleotiden (nt) stroomafwaarts van de plaats van het transcriptiebegin, gedeeltelijk toe te schrijven aan de acties van het negatief-handelt elongation factorcomplex, zelf, en het DRB-gevoeligheid veroorzakend complex, DSIF . Onlangs werd tfiih-geassocieerde CDK7 getoond aan fosforylaat ook CTD Ser-7 residuen, die Ser-2 fosforylering door P-tefb kunnen primen . De rekrutering van P-tefb aan de hiv-1-promotor die binnen het gebied van U3-R-U5 van 5′ LTR wordt gevestigd wordt vergemakkelijkt door Tat die CDK9/cyclin T1 aan TEERRNA richt waar cyclin T1 aan de G-rijke lijn van TEERRNA bindt . De rekrutering van CDK9 / cyclin T1 bevordert transcriptieverlenging door de polymerase II van RNA (RNAPII) die anders na de synthese van TEERRNA wordt onderbroken . De versie van rnapii van de pauze door Complex p-tefb wordt vergezeld door mRNA het afdekken en verlies van zelf . P-tefb leidt tot verlenging van de transcriptie van RNA-polymerase II (RNAPII) door de negatieve elongatiefactor (NELF) en het DRB-gevoeligheid veroorzakende complex (DSIF/Spt4/Spt5) te fosforyleren, waarbij de versie van NELF en ook fosforylerende ser-2 residuen in RNAPII CTD (herzien in) worden bevorderd. Op de dissociatie van zelf, DSIF wordt een positieve rek factor en verhoogde de processivity RNAPII . Hoewel P-tefb met het elongatiecomplex reist, is zijn CTD-kinase-activiteit niet langer nodig zodra het complex uit de pauze is vrijgegeven .
vanwege het belang van P-tefb moet de regelgeving worden gehandhaafd om een goede werking te verzekeren. Phosphorylation en dephosphorylation van specifieke plaatsen op CDK9 moeten door het transcriptieproces voorkomen en moeten strak worden gecontroleerd. Dit overzicht richt zich op de regulering van CDK9 door fosforyleringswijzigingen.
3. De samenstelling van P-tefb en zijn rol in HIV-1 Transcriptieactivering
P-tefb is een heterodimer die bestaat uit cycline-afhankelijk kinase 9 (CDK9) en een van de C-type cyclinen T1, T2a of T2b waarvan cycline T1 de meest voorkomende partner is . Cyclin K die oorspronkelijk werd gedacht om een minder belangrijke cyclin van CDK9 te zijn wordt nu erkend om een cyclinpartner voor CDK12 en CDK13 te zijn . Slechts vormt de proteã ne van cyclin T1 efficiënt een complex met HIV-1 Tat die aan TEERRNA wordt gebonden . Dit is toe te schrijven aan de aanwezigheid van een cysteine residu in cyclin T1 bij positie 261 eerder dan een asparagine in cyclin T2a en T2B proteã nen wordt gevonden die. Cyclin T1 met mutated Cys-261 bindt aan Tat maar is niet in staat om Tat aan TEERRNA aan te werven. De interactie van Tat met TEERRNA en cyclin T1 is afhankelijk van zinkionen die opnieuw de aanwezigheid van Cys-261 vereist .
Er zijn twee functionele isovormen van CDK9: een 42 kDa-vorm die voornamelijk wordt uitgedrukt in milt, thymus en testis en een 55 kDa-vorm die wordt uitgedrukt in verschillende weefsels, maar op aanzienlijk lagere niveaus, dat is de 42 KD-isovorm . Alle cyclinen associëren met beide isovormen van CDK9 en vertonen kinase-activiteit naar CTD in RNAPII . Ruwweg de helft van P-tefb bevindt zich in een inactief groot complex dat wordt gebonden door 7SK snRNA en verschillende extra eiwitten , waaronder hexamethyleenbisaceetamide-induceerbaar eiwit 1 (HEXIM1), la-gerelateerd LARP7-eiwit en methylfosfatase-capping-enzym MePCE . De lagere molecuulgewichtvorm van P-TEFb bestaat uit CDK9 en cyclin T1 en is enzymatisch actief . Het hoge molecuulgewicht P-tefb is inactief vanwege de HEXIM1 die zijn remmende pynt-sequentie introduceert in de actieve plaats van CDK9 .
het P-tefb-complex met hoog molecuulgewicht dient als bron van CDK9/cyclin T1 voor de rekrutering door HIV-1 Tat . In stress-geïnduceerde cellen, dissocieert het complex CDK9/cyclin T1 van de proteã ne 7 SK RNA/HEXIM1 en bindt dan BRD4 en vormt een transcriptioneel actief klein complex dat aan diverse cellulaire promotors wordt gerekruteerd . Ondanks de inactiviteit van het grote P-tefb-complex in vitro, is het grote complex, en niet het kleine complex, belangrijk voor de activering van HIV-1-transcriptie als HIV-1. Tat concurreert met HEXIM1 voor het binden aan cyclin T1 het bevorderen van dissociatie van P-tefb van het grote complex . Het HIV-1 Tat-eiwit bleek ook een groot p-tefb-complex te rekruteren tot HIV-1-promotor, waar teer-RNA 7 SK-RNA kon verdringen en P-tefb kon activeren .
Tat vergemakkelijkt ook de vorming van super elongatiecomplex (SEC) met actieve P-TEFb en extra elongatiefactoren en transcriptiecoactivatoren . Deze factoren omvatten AFF4, ENL, AF9, en elongation factor ELL2 . De aff4-proteã ne komt als centrale steiger naar voren die andere factoren door directe interactie werft. AFF4 bindt cyclin T1, ELL2, en ENL of AF9 handelend als brug die dit complex aan P-Tefb verbindt . Door de brugfuncties van TAT en AFF4, combineren P-tefb en ELL2 om een bifunctional elongation complex te vormen dat HIV-1-transcriptie zeer activeert . Zonder Tat, AFF4 kan bemiddelen de ELL2-P-tefb interactie, zij het inefficiënt. Tat overwint deze beperking door meer ELL2 naar P-tefb te brengen en ELL2 te stabiliseren in een proces dat actieve P-tefb vereist .
4. CDK9 Phosphorylation
de activiteit van P-tefb is afhankelijk van fosforylation van verscheidene serine en threonine residuen en we zullen dit hieronder bespreken en die in het CDK9/cyclin T1/Tat model in Figuur 2 worden getoond.
structuur van CDK9/cyclin T1/Tat complex (model gebaseerd op PDB 3MIA). Backbone representatie van CDK9 residuen aanwezig in originele PDB structuur wordt getoond in groene kleur, cyclin T1-in violet, en Tat—in rood. Positie van thr-29, Ser-175, Thr-186, en C-terminal ser/Thr cluster is aangegeven. Ook getoond zijn ATP-bindende plaats en Zn ionen die de interactie van Tat-cyclin T1 vergemakkelijken.
4.1. C-terminale Cdk9 fosforylering
Een cluster van CDK9 ‘ s C-terminale residuen (Ser-347, Ser-353, en Ser-357; Thr-350 en Thr-354) is autofosforylated en deze fosforylering is belangrijk voor de binding van CDK9/cycline T1 aan teer-RNA . Dit werd aangetoond door het onvermogen van enzymatisch actieve C-terminaal afgeknotte CDK9 om tar RNA te binden . Recombinant CDK9 / cycline T1 dat in vitro autofosforyleerd was, werd efficiënt gedeshoshoryleerd door eiwitfosfatase 2A (PP2A) maar niet door eiwitfosfatase-1 (PP1) . Ook verhinderde de behandeling met PP2A de binding van CDK9/cyclin T1 aan TAT en Tar RNA in vitro . Deze waarnemingen stelden voor dat PP2A de C-terminus van CDK9 kan richten en potentieel de interactie van P-tefb met TEERRNA kan controleren. Autofosforylering van CDK9 geassocieerd met het pre-initiatiecomplex in vitro werd geremd door TFIIH . PP2A werd later gevonden om essentieel voor basale HIV-1 transcriptie in vitro te zijn, aangezien de uitputting PP2A basale HIV-1 transcriptie inhibeerde en de toevoeging van PP2A aan de uitgeputte extracten de transcriptie herstelde . Men dacht dat het PP2A-doelwit Thr-29 was (zie hieronder), maar dit werd niet met zekerheid bewezen en het effect werd niet gereproduceerd in vivo. In een vroege studie, merkten we een milde inductie van basale maar niet Tat-geïnduceerde HIV-1 transcriptie door PP2A-remmende lage concentraties van okadaic zuur . We zagen ook inductie van basale en niet de Tat-geactiveerde HIV-1 transcriptie met de overexpressie van LIS1 eiwit dat we vonden te binden en te remmen PP2A in vitro en interactie met HIV-1 Tat eiwit . Collectief, wijzen deze studies erop dat PP2A basale HIV-1 transcriptie kan regelen en ook de interactie van P-TEFb met TEERRNA door dephosphorylation het c-Eindpunt van CDK9 kan controleren.
4.2. N-terminale thr-29 fosforylering
fosforylering van CDK9 ‘ s Thr-29 bleek te worden geïnduceerd door HTLV-1 Tax proteïne . CDK9 / cyclin T1 wordt aangeworven aan chromatinized HIV – 1 LTR en andere promotors door BRD4 . Deze brd4-werving was gekoppeld aan de fosforylering van CDK9 Thr-29 en de vereiste PP2A-fosforylering door John Brady ‘ s groep . De groep van Qiang Zhou rapporteerde echter dat CDK9 gefosforyleerd moet worden op Ser-175 om te binden aan BRD4 , wat onlangs bevestigd werd door Jonathan Karn ‘ s groep (zie gedetailleerde discussie hieronder). THR-29 van CDK9 is homoloog aan Thr-15 op CDK2, waarin phosphorylation CDK2 activiteit remt . Inderdaad werd phosphorylation van Thr-29 getoond om CDK9 activiteit en HIV-1 transcriptie te remmen . Nochtans, slaagden wij er niet in CDK9 thr-29 phosphorylation in cellen te ontdekken die met okadaic zuur worden behandeld dat zowel PP2A als PP1 gebruikend een combinatie van Hunter 2D dunne laagelektroforese en hoge resolutiemassaspectrometrie inhibeerde die phosphorylation van C-eindser/Thr cluster en ser-175 waarvan slechts ser-175 phosphorylation door okadaic zuur werd veroorzaakt . Aldus, CDK9 Thr-29 phosphorylation kan niet door PP2A worden gecontroleerd en moet verder worden gevalideerd om zijn rol tijdens HIV-1 transcriptie te verduidelijken.
4.3. CDK9 ‘ S T-Loop thr-186 fosforylering
CDK9 T-loop bevat verschillende fosforyleringslocaties, waaronder Ser-175 en Thr-186 (Figuur 2). Phosphorylation van behouden Thr-186 is noodzakelijk voor de enzymatische activiteit van CDK9 . Ook vereist de Vereniging van CDK9/cyclin T1 met 7SK RNA snRNP THR-186 phosphorylation van CDK9 . In CDKs, leidt phosphorylation van de T-lijn tot belangrijke conformational veranderingen die ATP bindende zak en een plaats van de substraatbinding openen die CDKs volledig actief als kinase maken .
onlangs heeft chemisch-genetische analyse met behulp van selectieve chemische remming van CDK7 aangetoond dat het alleen verantwoordelijk is voor CDK9 Thr-186 fosforylering en voor P-tefb-afhankelijke CTD ser-2 fosforylering en Histon H2B ubiquitylering in vivo . Aldus, functioneert CDK7 / cyclin H die eerder als CDK-activerend kinase (CAK) voor CDKs betrokken bij de celcyclus zoals CDK1, 2, en 4 ook als CAK voor CDKs betrokken bij de verordening van transcriptie die CDK8, 9, 12, en 13 (herzien binnen) omvatten werd geà dentificeerd. De globale analyse van kinasen die phosphorylate CDK9 t-lus gebruikend siRNA identificeerde ca(2+)/calmodulin-afhankelijke kinase 1D (CaMK1D) neerhalen door siRNA verminderde thr-186 phosphorylation . Dienovereenkomstig, verminderde de remming van de kleine molecule van ca (2+) signalerende weg thr-186 phosphorylation en remde Tat-geïnduceerde HIV-1 transcriptie maar niet Tax-gemedieerde HTLV-1 transcriptie . Omdat Belastinggemedieerde transcriptie wordt gedreven door P-tefb, moet verder worden onderzocht waarom alleen HIV-1 transcriptie werd beïnvloed.
CDK9 Thr-186 fosforylering kan ook worden gecontroleerd door cellulaire fosfatasen. Onze studies van het afgelopen decennium richtten zich op PP1 dat we in eerste instantie observeerden om Tat-afhankelijke HIV-1 transcriptie in vitro te stimuleren . Toen we een van de belangrijkste nucleaire regulerende subeenheden van PP1, NIPP1 (nuclear inhibitor of PP1) overexpresseerden, zagen we PP1-specifieke remming van HIV-1 transcriptie en virale replicatie . We merkten op dat Tat een sequentie bevat die vergelijkbaar is met een geconserveerd PP1-bindend rvxf-motief en toonden aan dat dit motief Tat-binding aan PP1 in vitro en in vivo bemiddelt en dat mutatie van residuen in het PP1-bindend motief (V36A en F38A) Tat verhinderde om HIV-1-transcriptie te induceren . CDK9 dat gefosforyleerd was in gekweekte cellen, verrijkt met (32P)orthofosfaat en behandeld met okadaïnezuur, werd in vitro efficiënt gedefosforyleerd door PP1 maar niet door PP2A, in tegenstelling tot de in vitro autofosforyleerde CDK9 die gedefosforyleerd was door PP2A en niet door PP1 . Deze resultaten suggereerden dat PP1 cdk9 phosphorylation tijdens HIV-1 transcriptie kan controleren. De Alfa – katalytische subeenheid van PP1, PP1a, bleek inderdaad coöperatief en sequentieel te werken met (Ca2+)-calmoduline-eiwitfosfatase 2B (PP2B) in met UV bestraalde of hexamethyleenbisaceetamide (HMBA) behandelde cellen waarin P-tefb wordt afgegeven uit het 7SK snRNP-complex . Terwijl PP2B een conformational verandering in 7SK snRNP veroorzaakt, pp1a DEPHOSPHORYLATES CDK9 Thr-186 en vergemakkelijkt de releases van P – tefb van 7SK snRNP . CDK9 bleef gedefosforyleerd terwijl het geassocieerd werd met BRD4 en werd gerekruteerd voor het pre-initiatiecomplex, waar het gereactiveerd kan worden door met TFIIH geassocieerd CDK7. Overeenkomstig deze studie, merkten wij verhoogde cdk9 thr-186 phosphorylation in de cellen die stabiel een PP1-inhibitory peptide, het centrale domein van NIPP1 uitdrukten, en ook waargenomen verhoogde Vereniging van CDK9 / cyclin T1 met 7SK RNA . De stabiele uitdrukking van cdNIPP1 verstoorde de interactie tussen Tat en PP1 en remde HIV-1 transcriptie , die voorstelt dat een evenwicht tussen phosphorylation en dephosphorylation van CDK9 Thr-186 moet worden gehandhaafd en dat het verschuiven van dit saldo naar phosphorylation remmend voor HIV-1 transcriptie is. Expressie van cdNIPP1 op een fysiologisch relevante manier als onderdeel van het HIV-1 genoom in plaats van NEF sterk geremde HIV-1 replicatie , verder suggereren dat PP1-gerichte remmers van nut kunnen zijn als potentiële anti-HIV-1 therapeutiek. Terwijl PP1 een kandidaat voor thr-186 dephosphorylation is, vonden wij ook dat het CDK9 Ser-175 dephosphorylates (zie hieronder). Een extra cdk9 thr-186 phosphatase, magnesium-afhankelijke eiwitfosfatase 1A (voorheen 2C) (PPM1A) werd geà dentificeerd gebruikend een phosphataseuitdrukkingsbibliotheek en Thr-186-phosphospecific antilichamen . Ppm1a de overexpressie verminderde thr-186 phosphorylation en siRNA-bemiddelde uitputting verhoogde het, en P-tefb en ppm1a ook coprecipitated samen die voorstellen dat CDK9 een fysiologisch substraat voor PPM1A kan zijn . Een recentere studie toonde aan dat cdk9 ‘ s thr-186 phosphorylation in rust CD4(+) T cellen wordt verminderd die voor HIV-1 replicatie niet permissive zijn en dat deze daling met de overvloed van ppm1a en beperkte rekrutering van CDK9 aan het grote P-tefb complex correleerde . Deze bevinding ondersteunt verder de noodzaak van het grote complex voor HIV-1 transcriptie en de kritische rol van PPM1A in de hiv-1 onderdrukking in rustende T cellen. Omdat de expressie van PPM1A niet werd veranderd bij de activering van T-cellen , kunnen nog onbekende regulerende factoren betrokken zijn bij de regulering van de ppm1a-activiteit.
4.4. CDK9 ‘ S T-Loop ser-175 fosforylering
zodra CDK9 / cycline T1 van het grote P-tefb-complex loskomt, kan CDK9 gefosforyleerd worden op Ser-175. Terwijl Thr-186 dephosphorylation CDK9 / cyclin T1 kinase activiteit totaal remde, werd geen verschil gevonden in de kinase activiteiten van CDK9 S175A en cdk9 s175d mutanten door David prijs en collega ‘ s . Qiang Zhou en zijn groep toonden aan dat de CDK9 S175A mutant inactief was, terwijl de CDK9 S175D mutant actief was als kinase . Zij toonden ook aan dat ser-175 phosphorylation band van CDK9/cyclin T1 aan Brd4 bevordert . Men stelde voor dat phosphorylation van Ser-175 een conformational verandering in CDK9 kan veroorzaken, toestaand BRD4 om aan cyclin T1 te binden . In onze recente studie, vonden wij dat de dynamische remming van PP1 tot exclusieve phosphorylation van CDK9 Ser-175 leidde zoals bepaald door een combinatie van Hunter 2D peptide mapping en LC-MS analyse in vivo . Remming van PP1 leidde in vitro en in vivo tot de remming van CDK9-activiteit en vermindering van rnapii-fosforylering . We vonden dat CDK9 S175A mutant enzymatisch actief was en HIV-1 transcriptie induceerde . Interessant, terwijl CDK9 s175d mutant minder actief was als kinase, vormde het eerder klein p-tefb complex vooral wanneer PP1 werd geremd. Aldus concludeerden wij dat PP1 HIV-1 transcriptie door CDK9 ser-175 residu te dephosphorylating activeert. Wij merkten ook op dat de phosphorylation activiteit van Ser-175 veel overvloediger was dan de activiteit van Thr-186 in celuittreksels die suggereren dat de activiteit van CDK9 natuurlijk door de overphosphorylation van Ser-175 kan worden onderdrukt. Een recente studie door Jonathan Karn ‘ s groep toonde aan dat de activering van T-cellen door T-celreceptor (TCR) of phorbolester (PMA) het signaleren sterk veroorzaakte phosphorylation van CDK9 Ser-175 . Gebaseerd op de moleculaire modellering stelden zij voor dat phosphorylated Ser-175 een waterstofband met Tat Lys-14 vormt die de band van Tat aan CDK9/cyclin T1 versterken en HIV-1 transcriptieactivering bevorderen . Ook in overeenstemming met de vroege waarnemingen, werd cdk9 s175a mutatie gevonden om de binding aan BRD4 af te schaffen . Ook, in overeenstemming met onze observaties, bleek CDK9 s175a mutant sterk induceren Tat-afhankelijke latente HIV-1 reactivering, die Jonathan Karn en zijn collega ‘ s toegeschreven aan het onvermogen van deze mutant om BRD4 te binden terwijl het in staat om te binden aan Tat . Zij vonden ook dat cdk9 phosphorylated bij Ser-175 van het complex 7SK RNP wordt uitgesloten, die onze vroegere observatie parallellen dat cdk9 s175d phosphomimetic mutant in klein complex p-tefb werd gevonden . Aldus, wijst deze recentste studie aan Ser-175 als belangrijk doel voor HIV-1 reactivering en potentiële ontwikkeling van kleine moleculetherapeutics.
We ontwikkelden onlangs PP1-gerichte kleine moleculen die werden gemodelleerd om de rvxf-accommoderende holte op PP1 te passen . We hebben ongeveer 300.000 verbindingen gescreend en vervolgens fysiek ongeveer 1000 verbindingen gescreend en één hitverbinding geïdentificeerd, 1H4, die HIV-1 transcriptie en replicatie inhibeerde bij niet-cytotoxische concentraties . 1H4 verhinderde PP1-gemedieerde dephosphorylation van een substraatpeptide die een rvxf opeenvolging in vitro bevatten, verstoorde de Vereniging van PP1 met Tat in gekweekte cellen, en verhinderde de translocatie van PP1 aan de kern . Wij zijn momenteel in het proces van het verfijnen van de hit samenstelling en ook het ontwikkelen van PP1-gerichte samenstellingen voor de activering van latente proviruss.
4.5. CDK9 ‘ s ser-90 fosforylering
wij en anderen hebben eerder aangetoond dat HIV-1 transcriptie geactiveerd wordt door Tat in de G1 fase, maar niet in de G2 fase . Aldus veronderstelden wij dat Tat een regelgevend kinase van de celcyclus zou kunnen in dienst nemen, die wij om CDK2/cyclin e toonden te zijn . HIV – 1 wordt geremd in de cdk2-neerhalingscellen en ook in macrofagendifferentiatie van veroorzaakte pluripotent stamcellen met CDK2 neerhalingscellen , die verder voorstellen dat CDK2 voor HIV-1-transcriptie en replicatie belangrijk is. Het functionele verband tussen CDK2 en CDK9 werd gevonden toen we de remming van HIV-1 door ijzerchelatoren analyseerden. HIV-1-transcriptie werd geremd in T-cellen die werden behandeld met ijzerchelatoren 311 en ICL670, wat ook de cellulaire activiteit van CDK2 en CDK9 remde . Meer krachtige DI-2-pyridylketon-thiosemicarbazon-gebaseerde tridentaat-ijzerchelatoren remde HIV-1-transcriptie en virusreplicatie bij veel lagere concentraties dan 311 of ILC670 en remde ook de CDK2-en CDK9-activiteit . Hoewel het mechanisme van CDK2-remming nog niet is opgehelderd, zal het waarschijnlijk inductie van p21 omvatten door de upregulatie van hypoxie-geïnduceerde factor 1 (HIF-1) aangezien ijzerdepletie ijzer uit prolylhydroxylase verwijdert en HIF-1-en HIF-2-eiwitniveaus verhoogt die het effect van hypoxie nabootsen . Wij analyseerden cdk9 phosphorylation door CDK2 in vitro en identificeerden een motief (90SPYNR94) dat een consensus cdk2 phosphorylation plaats vertegenwoordigde en die efficiënt phosphorylated was . Phosphorylation van CDK9 op Ser-90 werd ontdekt met phosphospecific antilichamen en het werd verminderd na het neerhalen van CDK2. De mutantassociatie van CDK9 S90A met het grote P-tefb-complex was verminderd en de overexpressie remde de HIV-1-transcriptie. Daarentegen vertoonde de CDK9 s90d-mutant een onveranderd verband met grote en kleine p-tefb-complexen en geïnduceerde Tat-afhankelijke HIV-1-transcriptie. De fosfomimetische S90 vertoonde echter een algehele afname van de CDK9-expressie, wat erop wijst dat een fosforylering/defosforylatiebalans moet worden gehandhaafd om de grote en kleine p-tefb-complexen te vormen. De moleculaire modellering toonde aan dat ser-90 van CDK9 op een flexibele lijn werd gevestigd die aan oplosmiddel wordt blootgesteld, die suggereert dat het phosphorylation zou kunnen ondergaan (ook gezien op Figuur 2). Aldus identificeerden onze recente studies een nieuwe regelgevende phosphorylation plaats op CDK9 die voor activering of remming van HIV-1 transcriptie kan worden gericht.
5. Conclusie
fosforylering en defosforylering van specifieke plaatsen op CDK9 vindt plaats gedurende het transcriptieproces en moet streng gecontroleerd worden. Wijzigingen aan bepaalde threonine / serine residu ‘ s bepalen of CDK9 associeert met groot P-tefb complex om beschikbaar te komen voor rekrutering en of de dissociatie van het grote complex efficiënt zal plaatsvinden. Phosphorylation van Thr-186 in de T-lijn van CDK9 en Ser-90 die buiten de T-lijn ligt bepaalt of CDK9 in het inactieve grote complex wordt afgezonderd en ook of het kinase enzymatisch actief is zodra het van 7SK snRNP wordt gescheiden. Dephosphorylation bij één van deze plaatsen leidt tot destabilisatie van het grote complex en versie van CDK9/Cyclin T1, daardoor beperkend Tat rekrutering aan HIV-1 LTR. De wijzigingen in het c-Eindpunt van CDK9 staan voor cyclin T1 toe : de teerband en dephosphorylation bij deze plaatsen verhindert het binden toTAR RNA. Fosforylering bij thr-29 of ser-175 remt daarentegen CDK9. Het zich ontwikkelende beeld van de regulering van CDK9 door fosforylering lijkt dus complex te zijn en komt deels overeen met wat voor andere CDK ‘ s bekend is. De recent geà dentificeerde cdk9-gerichte kinasen, CDK7, CDK2, en fosfatasen, PP1, en PPM1A zullen waarschijnlijk naar voren komen als nieuwe doelstellingen voor anti-HIV-1 en kankertherapeutics.
belangenconflict
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.
Dit project werd ondersteund door het District of Columbia Developmental Center for AIDS Research (P30AI087714), RCMI-NIH 2G12RR003048 van het Research Centers in Minority Institutions (RCMI) Program (Division of Research Infrastructure, National Center for Research Resources, NIH), Russian Foundation for Basic Research (no. 12-04-91444-NIZ) en het Russische Ministerie van Onderwijs en Wetenschap (no. 2012-1.5-12-000-1001-030). De auteurs willen ook de leden van het Nekhai lab bedanken voor hun suggesties en hun excuses aanbieden voor degenen wier werk niet werd geciteerd vanwege ruimtegebrek.
