Case Study: Discovering Inhibitors of Voltage-gated Sodium Channels

als een manier om de problemen met betrekking tot Ion channel drug discovery zoals hierboven beschreven te illustreren, zal de rest van dit artikel een case study beschrijven die zich richt op de identificatie van voltage-gated sodium channel inhibitors voor de behandeling van chronische neuropathische pijn. Behandeling van pijn is een ernstige medische kwestie en er is een grote inspanning in de farmaceutische industrie om nieuwe therapieën voor deze aandoening te ontwikkelen. Met name de behandeling van neuropathische pijn, gedefinieerd als “chronische pijn die het gevolg is van een primaire laesie of disfunctie van het perifere zenuwstelsel” door de International Association for the Study of Pain (IASP), blijft een belangrijke onvervulde medische behoefte.

Het is duidelijk dat spanningsgesloten natriumkanalen (Nav1) een sleutelrol spelen bij het ontstaan en de voortplanting van sensorische zenuwactiepotentialen die nodig zijn voor het signaleren van pijn. Lokale toepassingen van niet-subtype-selectieve natriumkanaalblokkers, zoals novocaine, bieden volledige pijnverlichting door geleidingsblok. Nochtans, is deze benadering van pijnhulp beperkt tot zeer weinig toepassingen, zoals tandheelkundige procedures, aangezien natriumkanalen ook essentieel voor geleiding in het hart, CNS, skeletachtige spier, en nietnociceptive sensorische neuronen zijn. De Nav1 super familie bestaat uit 10 leden (Yu en Catterall, 2004). Zeven van deze subtypes, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 en Nav1.9, zijn aanwezig in het perifere zenuwstelsel (PNS). Nav1.7, Nav1. 8 en Nav1.9 worden voornamelijk uitgedrukt in nociceptieve neuronen en Nav1.3 is overwegend embryonaal, maar is up-gereguleerd in de volwassen PNS na verwonding. Dit beperkte expressiepatroon maakt deze subtypes aantrekkelijk voor de ontwikkeling van nieuwe pijnstillende middelen. Echter, hun relatieve bijdrage aan pijn signaleren, en specifiek aan neuropathische pijn signaleren, is onduidelijk en kan variëren met verschillende etiologieën en zintuiglijke kwaliteiten van pijn.

bij afwezigheid van moleculaire selectiviteit voor één Nav1–subtype is het mogelijk om Nav1-kanalen in een bepaalde conformationele toestand specifiek te richten met behoud van natriumkanaalafhankelijke impulsgeleiding. Dit type van staatafhankelijke remming is de basis voor het therapeutische venster gezien met natriumkanaalblokkerende anticonvulsiva en antiaritmica, zoals lamotrigine en lidocaïne. Deze drugs hebben een hogere affiniteit voor kanalen in de open en / of geïnactiveerde Staten dan voor rustende, gesloten kanalen. Dit mechanisme van remming begunstigt binding in snel afvuren of gedeeltelijk gedepolariseerde weefsels. Neuropathische pijn zou gevoelig moeten zijn voor dit remmende mechanisme, aangezien het wordt verondersteld om uit verwonding-veroorzaakte gebieden van depolarisaties te resulteren, een hypothese die door de klinische doeltreffendheid van lidocaïne wordt gesteund systemisch bij subanesthetische dosissen wordt beheerd. Bovendien kan niet-subtype-selectief, staat-afhankelijk blok de grootste doeltreffendheid bieden, aangezien individuele knockout van Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8, of Nav1.9 leverde geen overtuigend bewijs voor een dominante rol van een van deze kanalen in neuropathische pijnsignalen.

Op basis van deze redenering werd besloten om in eerste instantie niet-subtype selectieve, state-afhankelijke Nav1-remmers te gebruiken, terwijl de moleculaire selectiviteit werd gecontroleerd door relevante verbindingen te testen op Nav1.7, Nav1.5 (het primaire cardiale natriumkanaal) en Nav1.8 parallel.

een membraanpotentiaalanalyse werd gebruikt om 200,000 200.000 verbindingen op Nav1.8 stabiel uitgedrukt in een recombinante cellijn te screenen. Deze HTS-analyse werd gebaseerd op de overdracht van de fluorescentieresonantieenergie (FRET) tussen twee leden van een membraanpotentiaal–gevoelig kleurstofpaar ontwikkeld door Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). Nav1, 8 kanalen werden vooraf geïncubeerd met de teststof en de chemische agonist deltamethrine in afwezigheid van extracellulair natrium. Daaropvolgende toevoeging van natrium resulteerde in membraan depolarisatie en Nav1 blok werd gekwantificeerd als interferentie met dat cellulaire depolarisatie proces.

hoewel het eerste scherm op Nav1.8 leverde een verscheidenheid aan hits, slechts een enkele verbinding werd beschouwd als een levensvatbare lead voor medicinale chemie inspanningen. Alvorens middelen aan dit lood te binden, werd de verbinding, een gedisubstitueerd succinimide genoemd BPBTS (n- {methyl}-N’-(2,2′-bithien-5-yl methyl)succinimide), in detail onderzocht door handmatige volledige celspanning klem. BPBTS bleek alle Nav1 subtypes met vergelijkbare potentie te remmen en de remming was afhankelijk van membraanpotentiaal en stimulatiefrequentie. Dit remmende mechanisme kwam overeen met een hogere affiniteit van de verbinding voor kanalen in de open en geïnactiveerde toestand, vergeleken met kanalen in de rusttoestand. Bovendien was BPBTS twee ordes van grootte krachtiger dan de klinisch gebruikte anticonvulsiva en antiaritmische nav1-blokkers, waardoor de geïnactiveerde toestand van Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5 en Nav1.2 werd geremd, met Ki-waarden van 0,09, 0,15, 0,08 en 0,14 µM en de rusttoestand met Kr-waarden van respectievelijk 1,5, 1,3, 0,3 en 1,2 µM (Priest et al., 2004).

als zodanig was BPBTS een aantrekkelijke lead voor medicinale chemie; de belangrijkste verplichtingen zijn een slecht farmacokinetisch profiel. In de loop van het profileren analogen van BPBTS, evenals gepubliceerde Nav1 inhibitors, gebruikend de membraanpotentiaalgebaseerde fluorescentietest, werden structuurgebaseerde discrepanties tussen potenties die in de fluorescente analyse en door elektrofysiologie worden bepaald voor een paar samenstellingen genoteerd. Deze discrepanties werden getraceerd naar een interactie tussen deze verbindingen en de agonist veratridine die werd gebruikt om Nav1.7 kanalen te openen. Vervolgens werd de fluorescentietest zodanig gewijzigd dat Nav1-kanalen vooraf werden geïncubeerd met de teststof in fysiologische extracellulaire natriumconcentraties en Nav1-afhankelijke depolarisatie werd geïnitieerd door agonistische toevoeging (Fig. 1). Kanaalremming potenties gemeten in deze gemodificeerde test correleerden zeer goed met de geïnactiveerde staat remming bepaald door elektrofysiologie over vele structurele klassen van Nav1 remmers (Felix et al., 2004; Liu et al., 2006).

Hoewel analogen van BPBTS mislukt het overtreffen van de eerste voorsprong in potentie, medicinale chemie geslaagd op het verbeteren van de farmacokinetische profiel, uiteindelijk het genereren van trans-N-{methyl }-N-methyl-N’-cyclopentaan-1,2-dicarboxamide (CDA54) met 44% orale biologische beschikbaarheid, een uur half leven, en een klaring van 14 ml/min/kg, die werd geprofileerd uitgebreid in vivo (Brochu et al., 2006). In twee rattenmodellen van neuropathische pijn verminderde CDA54 (10 mg/kg, oraal toegediend) significant de door zenuwbeschadiging geïnduceerde gedragsovergevoeligheid met 44-67%. Dezelfde dosis / plasmaconcentratie van CDA54 had geen invloed op acute nociceptie (test op de rat met de hete plaat), motorische coördinatie (test op de rat met de rotorod) of cardiale geleiding (elektrofysiologische parameters gemeten bij de cardiovasculaire hond). Deze eigenschappen zijn in tegenstelling tot die van de huidige natriumkanaalblokkers die in de kliniek worden gebruikt, die een verminderde motorische coördinatie bij ratten en CZS-bijwerkingen bij de mens bij alle werkzame doses veroorzaken. Interessant is dat na orale toediening de verhouding tussen hersenen en plasma voor CDA54 0,03 was. Daarentegen hopen klinisch gebruikte Nav1-blokkers zich op in het CZS, met een ratio hersenen / plasma hoger dan 10 voor mexiletine. Deze gegevens verkregen met CDA54 suggereren sterk dat remming van PNS-natriumkanalen alleen effectief is in diermodellen van neuropathische pijn en dat het beperken van de blootstelling aan Nav1-remmers aan het centrale zenuwstelsel een haalbare benadering is voor het ontwikkelen van Nav1-remmers met een verbeterde therapeutische index.

een UHTS-campagne, met behulp van de membraanpotentiaal-gebaseerde assay beschreven om te screenen op remmers van Nav1. 7, ontdekte de nieuwe 1-benzazepine-2-eenkanaals remmers (Hoyt et al., 2007; Williams et al., 2007). Deze klasse van remmers toonde een gedefinieerde structuur–activiteit relatie en, wanneer geëvalueerd in vivo, leden van deze serie waren oraal effectief in knaagdier neuropathische pijn en epilepsie modellen. Belangrijk, sommige leden van deze klasse weergegeven moleculaire selectiviteit voor Nav1. 7 kanalen (Williams et al., 2007). Bijvoorbeeld, verbinding 2 van Fig. 2 was sterk staatsafhankelijk en ∼10-voudig selectief voor Nav1, 7 boven Nav1, 8 en Nav1, 5. Het meest krachtige, zij het niet subtype-selectieve, lid van deze klasse van Nav1. 7-remmers (verbinding 1, BNZA; Fig. 2) werd getritiseerd. BNZA bindt met hoge affiniteit (KD van 1,6 nM) aan recombinant Nav1, 7 kanalen. Dit is de eerste demonstratie van ligandbinding met hoge affiniteit aan Nav1. 7 en biedt een waardevol screeningsinstrument om Nav1.7-selectieve verbindingen te zoeken. Gegevens verkregen met de 1-benzazepine-2-one structurele serie suggereren dat Nav1.7-selectieve analogen kunnen worden geïdentificeerd, en met de juiste farmacokinetische en drugmetabolisme eigenschappen, dergelijke verbindingen kunnen worden ontwikkeld als pijnstillende middelen, potentieel vertonen verbeterde verdraagbaarheid ten opzichte van bestaande geneesmiddelen gebruikt voor de behandeling van neuropathische pijn. Ondersteuning voor de haalbaarheid van het ontwikkelen van subtype-selectieve natriumkanaalremmers als nieuwe analgetica komt uit het recente rapport van een hoge affiniteit Nav1. 8-selectief agens, dat intraperitoneaal werd toegediend, effectief was in een breed scala van knaagdierpijnmodellen (Jarvis et al., 2007).

een mogelijke alternatieve benadering voor het zoeken naar subtype-selectieve natriumkanaalinhibitors zou zijn om te screenen op verbindingen die gericht zijn op kanalen gating mechanismen. Verscheidene peptides zijn eerder getoond om gating van natriumkanalen te wijzigen, maar weinig kleine molecules, vooral inhibitors, zijn beschreven om op deze manier te functioneren. Een dergelijke agent is ProTx-II, een 30-aminozuurpeptide gezuiverd uit tarantula GIF; dit peptide blokkeert natriumkanalen en toont selectiviteit voor Nav1. 7 (Smith et al., 2007). ProTx-II bindt aan de rusttoestand van natriumkanalen en verschuift de spanningsafhankelijkheid van kanaalactivering naar meer gedepolariseerde potentialen. De sterke depolarisaties overwinnen kanaalremming, die een keurmerk van dit type van gating modifierpeptide is. Een mogelijke strategie om kleine molecule mimetica van een gating modifier peptide te identificeren is om ProTx-II in biologisch actieve vorm radioactief te labelen, en om een bindende analyse met Nav1.7 kanalen heteroloog uitgedrukt in een cellijn te ontwikkelen. Het onderzoek voor kleine molecules die de band van ProTx-II moduleren kon nieuwe klassen van kanaalinhibitors onthullen die in het membraan verdelen en in beweging van de gating peddel interfereren, waardoor kanaalopening wordt verhinderd. Een bijkomend voordeel van dit type van UHTS is dat de hoge concentraties van testsamenstellingen zouden kunnen worden aangewend, een situatie die in kleurstof-gebaseerd onderzoek wegens fluorescentieinterferentie wordt uitgesloten die typisch met hoge concentraties van vele kleine organische molecules voorkomt. Aangezien sommige Peptides van de gating modifier aan gebieden binden die aan specifieke kanalen binnen een superfamilie uniek zijn, zouden de subtype-selectieve inhibitors kunnen worden geà dentificeerd gebruikend een dergelijke strategie.