resultaten en discussie

HANCs komen voort uit de Hoofdepidermis en vereisen lb genfunctie. Eerdere studies (5, 11, 17, 19) hebben de rol van LB genen in de cel lot specificatie processen beschreven. In Drosophila, hebben de aanwinst en het verlies van functieexperimenten geopenbaard dat lb genen de identiteit van een subset van hart en spiercellen specificeren en dat deze functie uit de hoogst beperkte, lijn-specifieke mesodermale uitdrukking van lb voortvloeit. Bovendien, nauwkeurige analyse van de lbe (Fig. 1) en LBL (gegevens niet getoond) expressiepatroon bij het begin van hartfusie bleek een driehoekige cluster van lb-positieve cellen gelegen net anteriorly aan de punt van het hart (Fig. 1 A, pijlpunt). Om een meer nauwkeurige beschrijving van de positie van deze cellen met betrekking tot de hart-geassocieerde lymfeklieren en ringklieren produceren, we dubbel geëtiketteerd embryo ‘ s voor lb en Specifieke klier markers (Fig. 1 b en C). De lymfe klier voorlopers onthuld met anti-slang antilichaam flank aan weerszijden van het hartpunt (Fig. 1B) maar overlappen niet met het gebied gelabeld door lb. Evenzo toont de dubbele kleuring van de l(2)1857 versterkervanger, die specifiek LacZ uitdrukt in de embryonale primordia van de ringklier (15), aan dat lb-positieve cellen zich direct vóór de ringklier bevinden (Fig. 1C).

om de oorsprong van hartgeassocieerde lb-positieve cellen te bepalen, hebben we vanaf het vroege stadium de lb-expressie gevolgd in het voorste deel van de embryo ‘ s. In de embryonale stadia voorafgaand aan de hartfusie, waren we niet in staat om lb expressie te detecteren geassocieerd met het voorste deel van twee hart primordia. Deze bevinding stelde voor dat de lb-positieve cellen oorspronkelijk niet in het hartgebied worden gespecificeerd en cellen van verschillende oorsprong kunnen vertegenwoordigen die in latere stadia met de hartcellen worden geassocieerd. Inderdaad, in het late stadium 11, een groep lb-positieve cellen in de dorsale hoofdepidermis (Fig. 2A) kan worden gedetecteerd. Deze cellen beginnen iets later te invagineren en vormen het leidende deel van gevouwen epidermis (Fig. 2B). De positie en timing van deze invaginatie lijken op een vouwen van de opperhuid van het hoofd, waardoor het achterste deel van de rugzakje de frontale zak wordt genoemd (20). Om te controleren of lb-expressiecellen overeenkomen met de punt van de frontale zak, gebruikten we escargot-LacZ lijn N516 die lacZ uitdrukt in rugzakvormende cellen (20). Double stainings van de etappe 14 (vijg. 2B) en fase 16 (Fig. 2C) N516 embryo ‘ s die anti-LBE-en anti-β-galactosidase-antilichamen gebruiken, tonen duidelijk aan dat lb en esg Coe-expressie hebben in de punt van de invaginerende frontale zak. Een dorsaal zicht op het embryonale hoofdgebied (Fig. 2D) bevestigt dat deze cellen dezelfde driehoekige opstelling vertonen als de eerder getoonde hart-geassocieerde lb-positieve cellen (vergelijk Fig ‘ s. 2D en 1).

samen geven deze gegevens aan dat de lb-expressiecellen die direct voor het hart liggen, afkomstig zijn van de hoofdepidermis en migreren naar de harttip tijdens frontale insaginatie in de zak. Deze observatie roept een extra vraag betreffende de rol van LB genen in de specificatie van deze groep cellen op. We hebben eerder aangetoond dat lb genen een belangrijke rol spelen in de specificatie van een subgroep van cardiale en spiervoorlopers (11, 19). Functionele analyse van de muis lb ortholog lbx1 gen (21, 22) heeft ook zijn implicatie in de controle van specificatie en gerichte migratie van appendiculaire spier voorlopers onthuld. Bovendien geven de meest recente gegevens aan dat lbx1 bij muizen een subpopulatie van cardiale neurale kamcellen specificeert die nodig is voor een normale hartontwikkeling (23).

om te testen of Drosophila lb nodig is voor de specificatie van hart-geassocieerde cellen, hebben we de vorming van dorsale pouch geanalyseerd in embryo ‘ s met een tekort aan beide lb-genen (zie materialen en methoden). Met behulp van de ESG RNA-sonde als marker hebben we aangetoond dat bij lbdef-embryo ‘ s de esg-expressie in het distale deel van de frontale zak met de hartgeassocieerde cellen afwezig is (vergelijk Fig. 2 E en G met F en H). Bovendien, zoals blijkt uit de dorsolaterale standpunten van Stadium 14 embryo ‘ s (Fig. 2 G en H), de afstand tussen de dooierzak en de meest distale esg-positieve cellen is aanzienlijk vergroot in lb-deficiënte embryo ‘ s. Deze bevinding, ondersteund door de waarneming van Nomarski optics waaruit blijkt dat het achterste deel van de frontale zak de morfologie heeft veranderd (gegevens niet getoond), wees erop dat de HANCs niet gespecificeerd zijn of niet goed migreren in lbdef-embryo ‘ s. Omdat de geanalyseerde deficiëntie ook aangrenzende BAP-en C15-genen omvat, hebben we frontale sac-vorming getest bij BAP-mutante embryo ‘ s en Arm-GAL4>UAS-RNAiC15-embryo ‘ s. In zowel bap208 als RNAiC15 embryo ‘ s was de esg-bevlekte frontale zak van normale vorm (gegevens niet getoond), waardoor de invloed van BAP en C15 genen op differentiatie of migratie van hart-geassocieerde cellen werd uitgesloten. Deze gegevens suggereren sterk dat het abnormale patroon van distale esg-positieve frontale sac cellen in lbdef embryo ‘ s het gevolg is van het verlies van LB functie.

mesodermale en niet-mesodermale componenten betrokken bij het patroon van de cardiale uitstroom Regio. Onze immunostaining experimenten toonden aan dat de hart-verankerende lb-positieve cellen zeer dicht bij de lb-expresserende cardioblasten liggen (Fig. 1). Omdat de meest anterieure cardioblasten tin (5) uitdrukken, hebben we embryo ‘ s dubbel gelabeld met anti-Tin en anti-LBE antilichamen om de respectievelijke posities van het hartpunt en het meest distale deel van de frontale zak te visualiseren. Verrassend genoeg overlappen deze twee structuren met ongeveer drie cellengtes wanneer waargenomen vanaf de rugzijde (Fig. 3A). Bovendien is de laterale confocale weergave van het voorste hartgebied (Fig. 3B) laat duidelijk zien dat de punt van de frontale zak, die bestaat uit niet-mesodermale lb-expressiecellen, direct aan het hart is gehecht. Meer precies, merkten we op dat het voorste deel van de aorta (gedeeltelijk overlappende de hart-geassocieerde lb cellen) buigt ventraal, de vorming van een morfologisch verschillend gebied dat overeenkomt met de cardiale uitstroom regio. Deze morfologie suggereert dat er een extra cellulaire component ten gunste ventrale buigen van het hart zou kunnen zijn. We besloten om te zoeken naar de aanwezigheid van een ventraal gelegen spier aan de top van de aorta. De zijaanzicht van het embryo, dubbel gekleurd voor myosine zware keten (Myo) en Lbe (Fig. 3C), laat duidelijk zien dat de hartuitstroom inderdaad is bevestigd aan een hoofdspier, die we voorstellen de COM te noemen. Meer nauwkeurige analyse van de confocale secties bleek dat de cardiale primordium is, in feite, verbonden door twee dicht liggende COMs die zich uitstrekken van de slokdarm en hechten aan weerszijden van de cardiale uitstroom regio (open pijlpunten in Fig. 3D). Verrassend genoeg zijn deze embryonale hoofdspieren voor zover wij weten niet eerder beschreven. Het gebrek aan gepubliceerde documentatie voor COMs is waarschijnlijk omdat de morfologie en de oorsprong van somatische hoofdspieren in het embryo van de Drosophila niet systematisch zijn geanalyseerd. Aan de hand van de enige beschikbare beschrijving van de volwassen hoofdspieren van Miller (24) konden we de volwassen hoofdspieren niet identificeren die mogelijk overeenkomen met de embryonale Com ‘ s die hier worden gepresenteerd.

interessant is dat de dubbele kleuring van Myo/Lbe ook aantoonde dat de niet-mesodermale HANCs aan beide hartcellen zijn gehecht (Fig. 3E) en de GMO ‘ s (Fig. 3D). Omdat de HANCs lb uitdrukken en selectief associëren met het meest anterieure lb-positieve paar hartcellen (Fig. 3E en 4 D-F), speculeren wij dat de oprichting van dit contact Homofiel-type celinteracties kan impliceren. Het testen van de celadhesiemoleculen die betrokken zijn bij intercellulaire signalering tussen homotypische cellen (25, 26) zal helpen bij het definiëren van mechanismen die ten grondslag liggen aan de totstandbrenging van connectiviteit tussen de lb-expressieve HANCs en hartcellen.

om de ruimtelijke ordening van de punt van de aorta, de COMs en de lb-expressieve HANCs te visualiseren, gebruikten we computergesteunde 3D-analyse en reconstructie van confocale scans. Deze benadering bevestigde volledig onze waarnemingen waaruit bleek dat, naast HANCs, het hart uitstroomgebied nauw verbonden is met een paar Com ‘ s (Fig. 3F). Deze spieren overlappen de punt van het hart van beide zijden en dragen bij aan de ventrale buigen.

om te begrijpen hoe het contact tussen hart, COMs en HANCs wordt vastgesteld tijdens de ontwikkeling, hebben we deze structuren gecontroleerd in het vroege en late stadium 14 embryo ‘ s (Fig. 3 G en H). Onze gegevens geven aan dat zowel de lb-positieve hartcellen als de lb-expresserende HANCs een uitbreiding van COMs aantrekken.

het contact tussen COMs en HANCs lijkt iets vooraf te gaan aan COM ‘ s gehechtheid aan de punt van de aorta en wordt gezien aan het begin van fase 14 (Fig. 3G). Op dat moment, com ‘ s fillopodia uit te breiden in de richting van lb-positieve hartcellen (Fig. 3G) en definitief worden gehecht aan deze cellen in het late stadium 14 bij het begin van hartfusie (Fig. 3H). Omdat de COMs in contact komen met hartcellen en HANCs voordat de HANCs worden gehecht aan het hart, speculeren we dat COMs, naast het buigen van de punt van het hart, het contact met HANCs vergemakkelijken. Het leggen van contact tussen somatische spieren en hun epidermale hechtingsplaatsen (peescellen) is uitgebreid bestudeerd (27), waarbij de sleutelrol van de Zinc finger transcriptiefactor Stripe (28) en een RNA-bindend eiwit How (29) aan het licht is gekomen. We hebben beide markers gebruikt om te testen of de HANCs en hartcellen waaraan de COMs displayeigenschappen van peesachtige cellen hechten. Dubbele etikettering uitgevoerd op WT embryo ’s met anti-Lbe/anti-Stripe en op how-lacZ embryo’ s met anti-LBE/anti-LacZ antilichamen bleek dat de HANCs en de COM-contact hartcellen geen peescel markers uitdrukken (gegevens niet getoond). Dit vinden wijst erop dat lb-positieve cellen COMs aantrekken door een mechanisme te gebruiken dat verschilt van dat dat door peescellen wordt gebruikt. De interessantste kandidaten voor het leiden van de COMs zijn de afgescheiden eiwitspleet die de veelvoudige eiwitbindende motieven en zijn receptoren Robo en Robo2 (30) bezit. Spleet en Robo kwamen onlangs naar voren als cruciale componenten die de aantrek-en afstotingsprocessen tijdens de morfogenese van somatische spieren controleren (31), wat suggereert dat zij ook betrokken zouden kunnen zijn bij COM-aantrekking.

de hartcellen met de meest anterieure lb-expressie spelen een centrale rol in het patroon van de cardiale uitstroom Regio. De observatie dat zowel COMs als HANCs kozen om zich te hechten aan de meest anterieure lb-positieve hartcellen heeft ons gevraagd om te testen of de deregulering van LB expressie in het hart het patroon van de cardiale uitstroom regio zou kunnen beïnvloeden. Om deze test uit te voeren, gebruikten we het gal4/UAS-targeted expression system (16). Twee verschillende gal4 effector lijnen, 24B-GAL4 en Tin-GAL4, werden gebruikt (Fig. 4 A en C). De 24B-GAL4 lijn maakt gerichte expressie in alle hart-en spiercellen mogelijk (Fig. 4A) met een uniform en hoog expressieniveau in de meest voorste hartcellen (pijl in Fig. 4A). De Tin-GAL4 lijn (vriendelijk verstrekt door R. Bodmer) induceert selectief de UAS transgenexpressie in vier cardioblasten in elk hemisegment (deze omvatten de lb-positieve cellen), maar het niveau van inductie in de meest voorafgaande hartcellen is lager (pijl in Fig. 4C) dan die van lijn 24B-GAL4. Om cardiale lb expressie uit te breiden, zijn beide gal4 effector lijnen gekruist met de UAS-LBE lijn. De ectopische lb cardiale expressie gedreven door de Tin-GAL4 lijn was zwakker dan de endogene lb expressie in het hart, en er zijn geen duidelijke, door functieversterking geïnduceerde veranderingen in het patroon van het cardiale uitstroomgebied waargenomen (gegevens niet getoond). De 24B-GAL4>UAS-lbe embryo ‘ s vertoonden daarentegen een duidelijke expansie van de lb expressie in het hart (Fig. 4G), wat leidt tot het abnormale contact van de COMs met de punt van het hart. We ontdekten dat Com ‘ s zich direct hechten aan de voorste hartcellen die de cardiale uitstroom vormen (sterretje in Fig. 4G) en niet aan het tweede paar hartcellen zoals in het WT (Fig . 4D). De veranderde verbinding van COMs is waarschijnlijk het gevolg van de ectopische aantrekkelijke signalen gegenereerd door de vergrote cardiale expressie van lb. Als gevolg hiervan was de ventrale buiging van het meest voorste deel van het hart meer uitgesproken (vergelijk Fig. 4 D en G). We hebben ook een veranderde morfologie van COMs (open pijlpunt in Fig. 4 D en G), die het gevolg kan zijn van de 24B-GAL4-gedreven ectopische spieruitdrukking van lb. Het contact tussen HANCs en hartcellen werd niet beïnvloed door de experimentele misexpressie. Om te testen of cardiale lb expressie nodig is voor de aantrekking van Com ‘ s, hebben we gebruik gemaakt van de eerder beschreven negatieve regulerende invloed van even-overgeslagen (eve) die in staat is om lb specifiek te onderdrukken in hartcellen (5). Nogmaals, de 24B-GAL4 en de Tin-GAL4 effector lijnen werden gebruikt om Eva expressie in het hart te drijven. We vonden dat beide van deze bestuurders gekruist met UAS-eve lijn (Tin-GAL4 met lagere penetrantie) leiden tot de onderdrukking van LB activiteit in het hart (Fig. 4 H en I). Ondanks de misspecificatie defecten, worden cardiale primordia normaal gevormd in UAS-eve gain van functie embryo ‘ s (ref. 5 en Fig. 4B), waardoor we COMs en HANCs kunnen monitoren in een context waarin hartexpressie van lb is uitgeput. Onze gegevens tonen aan dat in dergelijke lb-uitgeputte embryo ‘ s (zie de afwezigheid van cardiale lb expressie in Fig. 4 H en I) de Com ‘ s hechten niet aan de punt van het hart. Wij merkten op dat Com ‘ s zich naar voren uitstrekten en vasthielden aan invaginerende HANCs (Fig. 4 H en I), die niet meer in staat zijn om de punt van het hart goed te verankeren. De belangrijkste COM-tak die zich normaal aan het hartafvoergebied hecht (vergelijk Fig. 4 E en F met H en I) was afwezig of versmolten met de HANC-bevestigende tak. Zo geloven wij dat de abnormale vorm van COM en een volledig verlies van zijn contact met het uiteinde van het hart worden veroorzaakt door cardiale lb uitputting. Deze aanname wordt ondersteund door het feit dat dezelfde fenotypen werden waargenomen bij embryo ‘ s met ectopische cardiale (Tin-GAL4-gedreven) en cardiale plus spier (24B-GAL4-gedreven) expressie van eve (vergelijk Fig. 4 H en I). Het veranderde contact en de gewijzigde positionering van COMs verscheen in laat stadium 14 embryo ‘ s wanneer myosine zware keten nog niet detecteerbaar is in cardioblasten (Fig. 4 E en H). De analyse van Stadium 15 embryo ‘ s bleek bovendien dat het verlies van cardiale lb expressie gepaard gaat met de down-regulatie van β3-tubuline (vergelijk Fig. 4 F en I) in de cardiale uitstroom Regio, wat aangeeft dat lb expressie in het hart een belangrijke invloed heeft op de uiteindelijke cardiale morfogenese. Deze gegevens vormen een aanvulling op recente rapporten die de morfogenetische rollen beschrijven van een lid van de COUP-TF-receptorfamilie, zevenvoudig, uitgedrukt in het achterste paar cardioblasten in elk segment en vereist voor de vorming van ostia in de abdominale segmenten A5–A7 (32, 33). In deze context, de demonstratie van de rol van lb in het patroon van het hart uitstroomgebied stijgt een mogelijkheid dat in abdominale segmenten lb een gelijkaardige rol in het vestigen van contact tussen hartcellen en de hart-verankerende alariespieren speelt. Deze hypothese moet nog worden onderzocht.

Bovendien zijn de gepresenteerde fenotypen (Fig. 4) suggereren dat de lb expressie experimenteel uitgeput in het hart beïnvloedt de emissie of ontvangst van aantrekkelijke signalen door hartcellen en bijgevolg leidt tot de verstoring van het contact met COMs. De zelfde of gelijkaardige spier lokstof zal waarschijnlijk door lb-positieve HANCs worden geproduceerd of ontvangen, waarbij lb voorstelt uitdrukking van genen betrokken bij cel–celcontact regelt. Interessant is dat in homoloog lb van muizen, het lbx1 gen nodig bleek te zijn voor gerichte migratie van een subgroep van spiervoorlopers (21, 22), wat erop wijst dat de behouden cel-bewegingsmechanismen kunnen bestaan die worden gecontroleerd door LB genen.

door analyse van embryo ‘ s waarbij de cardiale lb expressie werd uitgebreid of experimenteel werd uitgeput, hebben we aangetoond dat de lb nodig is voor de juiste hechting van HANCs en COMs en bijgevolg voor het juiste patroon van de cardiale uitstroom regio. Dit vinden verstrekt inzicht in functionele betekenis van anterior–posterior diversificatie van hartprecursoren binnen elk segment van het hart van Drosophila.

kan HANCs een Drosophila-Prototype van neurale Kamcellen voorstellen? De morfogenese van het gewervelde hart impliceert twee verschillende celtypes, de mesodermale hartprimordia en een subpopulatie van neurale kamcellen die van het hoofdgebied migreren. In dit artikel hebben we aangetoond dat in Drosophila een groep van niet-mesodermale cellen afkomstig van de hoofdepidermis (die we de HANCs hebben genoemd) bijdraagt aan de uiteindelijke morfogenese van het hart. Net als in gewervelde neurale kamcellen, ondergaan de HANCs gerichte bewegingen, gaan in contact met hartcellen, en nemen deel aan het patroon van het hart uitstroomgebied. We hebben aangetoond dat de homeobox genen lb waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij de diversificatie van cardiale precursoren (5, 11) worden uitgedrukt in HANCs en zijn vereist voor hun specificatie. Ook de ortholog van lb, het lbx1 gen, werd onlangs gevonden om nodig te zijn voor de specificatie van een subset van cardiale neurale kamcellen in muis (23), wat erop wijst dat lb/lbx1 genen een behouden rol spelen in de specificatie van niet-mesodermale componenten van het hart. In deze visie, kunnen de HANCs inderdaad worden vergeleken met gewervelde neurale kam cellen. Echter, onze gegevens geven ook aan dat de HANCs ten minste twee kenmerken vertonen die alleen specifiek zijn voor Drosophila: (i) ze bewegen als een deel van gevouwen hoofd ectoderm en niet als delaminated neurale kamcellen; en (ii) ze vormen een functioneel complex met COMs, die geen homologe structuren hebben in gewervelde dieren. Aldus, worden de verdere analyses vereist om de nauwkeurige rol van HANCs en hun potentiële neurale kamcel-als functies te verduidelijken.