Abstract
Voltage-gated L-type Cav1.2 calciumkanalen koppelen membraandepolarisatie aan voorbijgaande toename van cytoplasmische vrije Ca2+ concentratie die een aantal essentiële cellulaire functies in werking stelt, waaronder cardiale en vasculaire spiercontractie, genexpressie, neuronale plasticiteit en exocytose. Inactivatie of spontane beëindiging van de calciumstroom door Cav1.2 is een cruciale stap in de regulatie van deze processen. De pathofysiologische betekenis van dit proces manifesteert zich bij hypertensie, hartfalen, aritmie en een aantal andere ziekten waarbij versnelling van het calciumstroomafname een gunstige functie moet hebben. De centrale kwestie van dit artikel is de inactivering van het Cav1.2 calciumkanaal gemedieerd door meerdere determinanten.
1. Inleiding
De voltage-gated inward Ca2 + current () is een algemeen mechanisme van voorbijgaande toename van de cytoplasmatische vrije Ca2+ concentratie veroorzaakt door celdepolarisatie. Deze vorm van het signaleren van Ca2+ activeert essentiële cellulaire processen met inbegrip van hartcontractie , regulering van een vlotte spiertonus , genuitdrukking , synaptische plasticiteit en exocytose . Volledige en snelle beëindiging van Ca2+-instroom wordt gemedieerd door een ingewikkeld mechanisme van spontane calciumkanaalinactivatie, wat cruciaal is voor het voorkomen van Ca2+ – overbelasting van de cel tijdens actiepotentialen en herstel van de rust sub-µM cytoplasmatische vrije Ca2 + – concentratie . Dit artikel zal zich richten op de moleculaire basis en meerdere determinanten van de Cav1.2 calciumkanaalinactivering.
2. Cav1. 2: uitdagingen en oplossingen
2.1. Moleculaire complexiteit
het calciumkanaal Cav1. 2 is een oligomeer complex dat bestaat uit de subeenheden a1C, α2δ en β . De ionenkanaalporiën worden gevormd door het A1C-peptide (figuur 1) dat gecodeerd wordt door het CACNA1C-gen. De auxiliary β en α2δ subeenheden zijn essentieel voor de functionele expressie en plasma membraan (PM) targeting van het kanaal . Ze bestaan in meerdere genomische isovormen gegenereerd door vier CACNB genen (CACNB1–4) en drie CACNA2D genen (CACNA2D1–3). Alle drie de subeenheden zijn onderworpen aan alternatieve splicing. Het toevoegen aan de complexiteit van de Cav1.2 moleculaire organisatie, neigen β-subeenheden om te oligomeriseren . Alles bij elkaar, genomic variabiliteit, alternatieve splicing, en hetero-oligomerization genereren een overvloed van Cav1.2 lasvarianten die in cellen in species -, weefsel -, en ontwikkelingsafhankelijke wijze worden uitgedrukt, terwijl de verandering van hun fijne balans significante pathofysiologische gevolgen kan hebben .
2.2. Uitdagingen bij de selectie van de gastheercel
natuurlijk voorkomende diversiteit van Cav1. 2 compliceert de interpretatie van gegevens verkregen uit inheemse cellen, laat staan de gegevens van één kanaal. Dit ligt ten grondslag aan het belang van Cav1.2 onderzoek in recombinante expressiesystemen waar de moleculaire samenstelling van het kanaal en de structuur van zijn bestanddelen vooraf zijn bepaald. Nochtans, kwam deze experimentele benadering het belangrijkste probleem van de selectie van een aangewezen gastheercel tegen.
De meeste studies met calciumkanalen werden uitgevoerd met HEK293-cellen. Deze cellen bieden een hoge expressieefficiëntie van recombinante Ca2+ – kanalen, maar bevatten helaas endogene calciumkanalen met Ca2+ – stromen tot 3 pA/pF . HEK293-cellen laten dus alleen een adequate studie van recombinant Ca2+ – kanalen toe wanneer de amplitude van de stroom groot genoeg is om de bijdrage van de endogene kanalen te negeren. Een correcte beoordeling van de functionele determinanten van Ca2+ kanalen vereist echter het gebruik van gastheercellen die volledig vrij zijn van endogene Ca2+ kanaalsubeenheden. COS1-of COS7-cellen voldoen goed aan deze eis omdat ze geen merkbare calciumstroom genereren, geen endogene Ca2+ – kanaalsubeenheden of hun voorlopers bevatten en geen inductie van endogene Cav1, 2-subeenheden vertonen als reactie op de expressie van de recombinante subeenheden. Kinetische parameters en spanningsafhankelijkheid van activering en inactivering van de Cav1.2-kanaalstromen gemeten in COS1-cellen zijn consistent met gegevens verkregen in andere expressiesystemen . Een belangrijk voordeel van COS-cellen is hun relatief langzame delingssnelheid die een betere controle mogelijk maakt over de efficiëntie van expressie en assemblage van de Cav1.2-kanaalsubeenheden van verschillende grootte.
2.3. Problemen met Fluorescentieetikettering en meting
fusie van GFP-achtige fluoroforen met de N-en/of C-termini van recombinant a1C of met de N-terminus van β verandert de elektrofysiologische eigenschappen van de uitgedrukte kanalen niet merkbaar, maakt de toepassing van fluorescente en FRET (fluorescente resonantie-energieoverdracht) microscopie mogelijk bij de studie van subcellulaire distributie en assemblage van Cav1.2 evenals ingewikkelde aspecten van moleculaire architectuur en dynamiek van het kanaal. Het kanaal behoudt belangrijke elektrofysiologische kenmerken onveranderd wanneer de A1c C-terminale sequentie gecodeerd door distale exons 46-50 (figuur 1, residuen 1833-2138 in A1C,77) wordt vervangen door ECFP. Nochtans, is A1C die door Zijn N – of/en c-termini aan EYFP wordt gesmolten hoogst gevoelig voor photobleaching dat het irreversibel inactiveert. Bekend als fluorophore-bijgestane lichte inactivering( FALI), beperkt deze interessante eigenschap de toepasbaarheid van acceptor photobleaching voor de metingen van lijstwerk in Cav1.2 wegens onzekerheid in de functionele staat van het kanaal . Nochtans, weerspiegelt de ratiometrische analyse van gecorrigeerd lijstwerk tussen fluorophores, die aan de staarten van de subeenheden a1C en/of β worden gesmolten, de omkeerbare die staat-afhankelijke structurele herschikkingen van het kanaal door de veranderingen van transmembrane voltage onder flardklem wordt veroorzaakt .
2.4. Recombinant Cav1. 2: Wat heeft het nodig voor functionele expressie en hoe verschijnt het?
typische eigenschappen van een” wild-type ” recombinant Cav1. 2 worden geïllustreerd in Figuur 2 (A) aan de hand van een voorbeeld van de alomtegenwoordige menselijke a1C,77 isovorm (GenBank nr. z34815). Wanneer de EYFP-geëtiketteerde A1C in COS1 cellen alleen werd uitgedrukt, werd de fluorescente-geëtiketteerde kanaalproteã ne diffusely verdeeld over het cytoplasma en produceerde geen meetbare calciumstroom (Figuur 2(A), paneel a). De kwantitatieve analyse van de verdeling van A1C tussen PM en het cytoplasma (Figuur 2(B)) bevestigde het ontbreken van significante PM targeting door A1C onafhankelijk van de aanwezigheid van α2δ (bars a en b). De expressie van Cavß in de afwezigheid van α2δ stimuleerde PM-targeting van a1C, maar het kanaal bleef stil(Figuur 2 (A), paneel c) tenzij α2δ coexpresseerde (Paneel d). Β-en α2δ-subeenheden zijn dus voldoende voor het functionele kanaal; onder deze experimentele omstandigheden stimuleren β-subeenheden PM-targeting van het kanaalcomplex en vergemakkelijken zij, in aanwezigheid van α2δ, de spanningsdoorgang van het Cav1.2-kanaal.
de vorm en het uiterlijk van de piekcalciumstroom in Figuur 2(A) (paneel d) zijn vrij typerend voor de β2-gemoduleerde Cav1.2 . De belangrijkste kenmerken zijn de relatief langzame snelheid van verval en een groot deel van de aanhoudende resterende het einde van de depolariserende puls . Het is duidelijk dat dergelijke eigenschappen tijdens langdurige actiemogelijkheden kunnen leiden tot pathogene calciumoverbelasting van de cel als deze niet wordt gecompenseerd door robuuste compenserende mechanismen. Het was de ultieme rol van Cav1.2 in het bepalen van de duur van het actiepotentieel in hartcellen die het onderzoek en de ontwikkeling van calciumkanaalblokkers hebben veroorzaakt, een klasse van geneesmiddelen die nu een miljard dollar markt heeft. Het is deze rol van Cav1.2 die de huidige belangstelling voor de identificatie van moleculaire determinanten van Cav1.2 inactivering stimuleert in de hoop meer specifieke en effectievere geneesmiddelen te vinden.
2.5. Last but Not Least een complicatie: Cav1. 2 Clustering
een enkele ventriculaire myocyt bevat ~300.000 Cav1. 2 kanalen, maar slechts ~3% van de kanalen zijn open op de piek . In tegenstelling tot wat vaak wordt gedacht, zijn Cav1.2 kanalen niet gelijkmatig verdeeld over het plasmamembraan. In inheemse neuronale en hartspiercellen vormen zij grote clusters. Beeldvorming met één molecuul van de functionele recombinante EYFPN-A1C/ß2a/α2δ kanalen uitgedrukt in HEK293 cellen onthulde clusters samengesteld uit ~ 40 kanalen die mobiel waren in het plasmamembraan . Zowel de spectroscopie van de fluorescentiecorrelatie als de fluorescentieterugwinning na photobleaching experimenten leverden een laterale diffusieconstante van µm2 / s op. de functionele betekenis van de Cav1.2 clusters mobiliteit is niet duidelijk. Er wordt aangenomen dat in hartspiercellen dergelijke mobiliteit kan worden beperkt door interacties met andere eiwitten, bijvoorbeeld ryanodine-receptoren . De grootte van Cav1. 2 clusters en hun specifieke dichtheid in het plasmamembraan hangt af van het type β subeenheid uitgedrukt . De afstand tussen de termini van buur A1C-subeenheden varieert van 67 Å met neuronaal/hart ß1b tot 79 Å met vasculair β3. De hoogste dichtheid van Cav1, 2 clusters in het plasmamembraan en de kleinste clustergrootte werden waargenomen met ß1b aanwezig. Inzicht in moleculaire mechanismen die de architectuur en eigenschappen van Cav1.2 clusters definiëren is belangrijk voor een beter begrip van de pathofysiologie van de koppeling tussen de Cav1.2 Activiteit en de geïnduceerde responsen in Ca2+ signaaltransductie.
3. Spannings-en Ca2+ – afhankelijke inactivatie van het Cav1. 2 calciumkanaal
in het geval van Cav1. 2 calciumkanalen zijn er twee verschillende mechanismen die de Ca2+ huidige inactivatie regelen. Het ene mechanisme wordt aangedreven door Ca2 + – ionen op de cytoplasmatische kant van het plasmamembraan, terwijl het andere van transmembraanvoltage afhangt. Experimenteel, vervanging van Ca2+ voor Ba2+ als ladingsdrager elimineert Ca2 + – afhankelijke inactivatie (CDI), zodat de ba2+-geleidende calciumkanalen inactiveren op een spanningsafhankelijke manier door snelle (FI) en langzame (SI) mechanismen . Deze drie mechanismen van inactivering, FI, SI en CDI, en hun belangrijkste determinanten worden geïllustreerd in Figuur 3.
3.1. Ca2 + – afhankelijke inactivatie en Calmoduline-Bindingsdomein van a1C
Er zijn verschillende determinanten van CDI, maar pas in 1997 was de Ca2+-sensorplaats van CDI beperkt tot een stuk van de 80-aminozuur C-terminale sequentie van a1C gecodeerd door exons 40-42 (Figuur 2) gemarkeerd door rood blok in Figuur 3(A) (paneel a). Een van nature voorkomende lasvariatie in dit gebied in A1C, 86 (Figuur 3(B)) remde CDI volledig omdat dit blijkt uit het gebrek aan vertraging van de stroom met Ba2+ als ladingsdrager (Paneel c, zwart spoor) in vergelijking met (rood spoor). Een ander kenmerk van het geremde CDI was het ontbreken van de huidige grootteafhankelijkheid van spanning (Figuur 3(B), Paneel d, open symbolen) die in tegenstelling blijft tot de U-vormafhankelijkheid van de tijdconstante van snelle inactivering () op membraanpotentiaal in het wild-type Cav1.2 (zie Figuur 3(A), paneel d). Twee verschillende sequenties, L en K, werden geà dentificeerd binnen deze 80-amino-zuur rek waarvan A1C, 86-achtige mutaties in het wild-type a1C aan dezelfde karakteristieke kenmerken voldoen, die het bestaan van twee aangrenzende CDI sensoren suggereren. Een van hen werd in het K – gebied geschetst als het calmodulin – (CaM -) bindende IQ-motief en, later, de verbinding van het IQ-motief aan CDI als de functionele Ca2+ – CaM bindende plaats werd bevestigd in drie onafhankelijke studies door het gebruik van CaM-mutanten die affiniteit aan Ca2+ontberen. Dienovereenkomstig werd het La-motief gekoppeld aan CDI als apo-CaM bindingsplaats begiftigd door de rusttoestand van het kanaal. Een enkele Cammolecuul die aan dit Ca2+-afhankelijke CaM-bindend domein (CBD) van a1C wordt gebonden is de belangrijkste Ca2+ sensor van het kanaal .
Splice variatie van a1C in CBD regio van a1C, 86 niet alleen volledig remt CDI, maar verwijdert ook SI (Figuur 3 (B), Paneel c) en ontneemt het kanaal van differentiële gevoeligheid voor β-subeenheid modulatie (Figuur 3(B), Paneel e) ondanks het feit dat β geassocieerd blijft met a1C, 86 (Figuur 3(B), Paneel b). Dit geeft aan dat alle drie de eigenschappen van het kanaal—CDI, SI en β-subeenheid modulatie—met elkaar verbonden zijn .
3.2. Langzame inactivatie
Er zijn een aantal aanwijzingen dat aminozuren beperkt tot het distale deel van S6-segmenten in a1C een belangrijke rol spelen bij SI . De systematische studie van dit gebied schetste de “jaarlijkse determinant van langzame inactivering” (ADSI) als structuur samengesteld uit vier hoogst bewaarde aminozuren van vier transmembraansegmenten S6, die het cytoplasmic eind van de porie vormen (Figuur 3(A), paneel a). Hun gelijktijdige mutatie (S405I in IS6, A752T in IIS6, V1165T in IIIS6, en I1475T in IVS6) genereert het A1c,is-IV kanaal. Analyse van de huidige kinetiek van het A1c,is-IV kanaal toonde een enorme versnelling van de snel inactiverende component ( ≤ 10 ms) die ongeveer 50% van de totale (or ) amplitude omvat. De langzame voltage-afhankelijke inactivatie van a1C,is-IV wordt volledig geremd, en het kanaal blijft geleidend voor de duur van depolarisatie. Vervanging van Ca2+ voor Ba2 + als ladingsdrager (Paneel c) veranderde dit patroon van inactivering niet significant, terwijl de analyse van spanningsafhankelijkheid van voor de inactiverende component van door het a1C,is-IV kanaal (Paneel d) bevestigde gebrek aan CDI. De vervanging van ß1a voor ß2a (panel e) veranderde niet de inactivering van de A1C,is-IV kanaalstroom die gebrek aan differentiële β-subeenheid modulatie suggereert, terwijl de co-immunoprecipitatieanalyse (panel b) direct bewijs van associatie tussen a1C,is-IV en β leverde.
bij elkaar genomen wijzen de resultaten in Figuur 3 erop dat er sprake is van een cross-talk tussen ADSI, CBD en β, ondersteund door directe interacties tussen hen en/of specifieke conformationele folding van de bestanddelen van de polypeptidebundel die aan de porie ten grondslag ligt. Zowel de interactie van β met CBD als het belang van functionele conformatie werden rechtstreeks aangetoond in levende cellen die recombinant Cav1.2 uitdrukken.
3.3. De rol van de A1c C-tail Folding
kwantitatieve spanningsafhankelijke FRET microscopie gecombineerd met flardklem in de levende cel toonde aan dat de A1C subeenheid C-terminalstaart onderhevig is aan omkeerbare voltage-gated conformationele herschikkingen . De verankering van de A1C C-staart aan de binnenste folder van het plasmamembraan via het pleckstrine homologie (PH) domein gefuseerd aan het c-Eindpunt van a1C (a1C-) schafte deze conformationele herschikking af en remde zowel SI als CDI (Figuur 4(A)) op een manier die zeer vergelijkbaar is met die waargenomen met a1C,IS-IV (Figuur 3(C)). Deze modificatie die de mobiliteit van de A1C carboxyl terminus beperkte, had een belangrijke invloed op de Ca2 + signaaltransductie. CREB-afhankelijke transcriptionele activering geassocieerd met de activiteit van Cav1.2 werd volledig onderdrukt ondanks robuuste gegenereerd door het “C-verankerde” kanaal in reactie op depolarisatie. De versie van de C-staart a1C door activering van PIP2 hydrolyse op activering van phospholipase C volledig herstelt al deze deficiënte functies, met inbegrip van SI, CDI, en de efficiënte koppeling van aan de CREB-afhankelijke transcriptie . Aldus, is het het specifieke functionele vouwen van de C-eindstaart van a1C die voor inactivering cruciaal is. Het is cruciaal voor signaaltransductie omdat het is ontworpen om de doordringende Ca2+ in CaM vast te houden aan CBD en om deze Ca2+ effectief te verplaatsen naar downstream signaaldoelen geassocieerd met CREB-afhankelijke transcriptie of hartspiercontractie . Deze functie treedt vooral op in nauwe coördinatie met extracellulaire stimuli die het kanaal activeren. In termen van signaaltransductie, SI is een slot aan de binnenkant van het kanaal dat wordt vrijgegeven door de doordringende Ca2+ om de sluiting te versnellen en de beweging van de C-terminal staart te initiëren .
3.4. Rol van de A1c N-Terminus
alle bovengenoemde functies hangen ook af van de integriteit van de A1C N-terminus. De inactivatieeigenschappen van het recombinant A1C/β/α2δ kanaal worden niet sterk gewijzigd door structurele veranderingen van het proximale deel van de A1c N-staart, bijvoorbeeld door de fusie van een fluorescerend eiwit, door PH-domein of door alternatieve splitsing van exons 1/1A die de lange isovorm van a1C genereren . De allereerste functionele analyse van het effect van gedeeltelijke deletie van het A1C N-eindpunt toonde aan dat het betrokken is bij inactivatie terwijl β remming van het kanaal door de n-staart verhindert. Gebruikend de microscopie van het lijstwerk met flardklem wordt gecombineerd, vonden wij dat de inactivering sterke wederzijdse heroriëntatie van A1C en ß1a NH2-eindpunten veroorzaakt, maar hun afstand ten opzichte van het plasmamembraan niet merkbaar wordt veranderd . Dit relatieve gebrek aan mobiliteit wordt verleend door β op een manier die de kanaalrespons op spanningsdoorgangen vergemakkelijkt. Experimenten met de ontkoppeling van de n-eindstaart van de A1C-subeenheid van de regeling van het kanaal werden uitgevoerd in afwezigheid van β. Verankering van de A1c N-staart in de binnenste folder van het plasmamembraan via bijgevoegd pH-domein creëerde omstandigheden waarin PHN-a1C en α2δ voldoende waren om een robuuste stroom naar binnen te genereren (Figuur 4(B)). Dit kanaal is echter verstoken van CDI en elke spanningsafhankelijke inactivering. Noch de ba2+ – noch de Ca2 + – stroom vertoont een noemenswaardig verval (zie overlappende sporen). Het vrijkomen van de A1C N-staart na PIP2-hydrolyse door activering van fosfolipase C remde het β-deficiënte kanaal volledig. Vergelijkbare eigenschappen, behalve een veel tragere activering van de stroom, werden waargenomen bij verwijdering van de gehele (maar 4 aminozuren) n-terminale staart van a1C (Figuur 4(C)). Bij een van beide types van ontkoppeling van de staart van de A1c N-terminal—hetzij door een schrapping, hetzij door DEELTJESVERANKERING—lijkt een vertraging in de activering van de gehele celstroom gepaard te gaan met een verlenging van de eerste latentie. Enkelkanaalsopnamen toonden aan dat de verwijdering van de n-staart in wezen de open toestand van het ΔN-A1C/α2δ-kanaal stabiliseerde, die langere openingen vertoonde tijdens langdurige depolarisatie .
CDI wordt dus gemedieerd door CBD-determinanten van de A1c C – staart, door de ADSI in het cytoplasmatische poriegebied en door het vouwen van de A1C C-en N-termini. Calmoduline integreert deze determinanten en zorgt voor een Ca2+-afhankelijke schakelaar die langzame inactivatie beëindigt, de A1c C-staart loslaat en de bijbehorende Ca2+/calmoduline doet shuttelen als een activerende stimulus van de Ca2+ signaaltransductie .
3.5. Expressie en inactivering van Cav1. 2 bij afwezigheid van de β en α2δ
zijn de subeenheden β en α2δ essentieel voor de functionele expressie van het Cav1.2-kanaal? De analyse van de effecten van exogene CaM (CaMex) op de expressie en eigenschappen van Cav1.2 bij afwezigheid van β Of α2δ heeft duidelijk aangetoond dat noch β noch α2δ essentieel is. Overexpressie van CaMex wijzigt slechts in geringe mate het spanningsbereik van het A1C/ß2d/α2δ-kanaal door de spanningsafhankelijkheid van activering en inactivering te verschuiven naar meer negatieve potentialen, waardoor inactivering (maar niet versnelt) wordt vergemakkelijkt en de dichtheid van ongeveer 2-voudig wordt verhoogd . CDI wordt behouden, zoals blijkt uit het effect van de vervanging van Ca2+ voor Ba2+ als ladingsdrager die de inactivatietijd van de stroom aanzienlijk heeft verhoogd (Figuur 5(A)). Een nieuw begrip van de rollen van β en α2δ komt met de bevinding dat CaMex expressie en activiteit van het A1C-kanaal weergeeft in afwezigheid van β (Figuur 5(B)) of α2δ (Figuur 5(C)), maar niet beide ondersteunende subeenheden. Hoewel CaMex structureel niet verwant is aan β en α2δ, ondersteunt het trafficking, CDI en channel gating. Kwantitatieve analyse toonde aan dat CaMex de herverdeling van A1C in PM over het cytoplasma niet stimuleerde, maar significant verbeterde plasmamembraan gericht op A1C/α2δ kanalen. Anderzijds versterkte CaMex de relatieve verdeling van de A1C/ß2d-en a1C/ß2d/α2δ-kanalen in het plasmamembraan over het cytoplasma niet. Afhankelijk van de aanwezige hulpsubeenheid is de CaMex-ondersteunde kanaalactiviteit van a1C/ß2d en A1C/α2δ dus onder controle van verschillende mechanismen. Desondanks vertonen de door CaMex gefaciliteerde kanalen met één hulp-subeenheid vrij vergelijkbare eigenschappen, waaronder beduidend langzamere inactivatiekinetiek van de calciumstroom en een sterke verschuiving van de spanningsafhankelijkheid van activering en inactivatie naar meer negatieve potentialen. Net als bij de conventionele A1C/ß2d/α2δ kanalen behouden deze kanalen CDI en een hoge gevoeligheid voor dihydropyridine calciumkanaalblokkers . Echter, alleen het A1C/β/CaMex kanaal geeft een versoepeling van de calciumstroom door een sterke depolarisatie prepulse (gegevens niet weergegeven).
omdat CaM geassocieerd met CBD betrokken is bij CDI, is het duidelijk dat het effect van CaMex wordt gemedieerd door verschillende CaM-bindingsplaatsen. Een van de potentiële kandidaten van een dergelijke site is aanwezig in het distale deel van de A1C n-terminal staart . Het valt nog te bezien of deze site inderdaad een integrerende rol speelt in de regulerende bundel van verschillende moleculaire determinanten die Cav1.2 inactivering ondersteunen. Een andere mogelijkheid beperkt de rol van CaMex tot de activering van stille Cav1.2 binnen de grote clusters, waar de beperkte lokale beschikbaarheid van CaM de oorzaak kan zijn van de lage fractionele activiteit zoals beschreven in paragraaf 2.5. Wat de mechanismen ook zijn die verbonden zijn aan regulering van Cav1.2 Door CaM, ze lijken weinig praktische gevolgen te hebben voor gebruik in de geneeskunde op dit moment precies omdat CaM een alomtegenwoordige en multifunctionele peptide is die vele andere cellulaire functies reguleert, terwijl zijn aanwezigheid in Cav1.2 essentieel is voor CDI.
4. β – subeenheid modulatie van Cav1.2
opmerkelijke moleculaire variabiliteit van β-subeenheden, weerspiegeld in gewijzigde inactivatie-eigenschappen van de differentieel gemoduleerde Cav1.2 , zoals geïllustreerd in Figuur 3(a) (panel e), biedt een nieuwe kans voor de ontwikkeling van innovatieve benaderingen voor de behandeling van de ziekten die verband houden met Ca2+ verkeerd gebruik. Verschillende recente observaties vormen de basis voor een dergelijke optimistische visie. Ten eerste, β – subeenheden vertonen een tendens om homo-en heterooligomeren te vormen die direct door een verscheidenheid van biochemische technieken in zowel inheemse cellen als in recombinant uitdrukkingssysteem werd aangetoond. Terwijl een toename van β-homooligomerisatie de dichtheid van significant verhoogt, kan heterooligomerisatie van β2-lasvarianten met andere β-subeenheden ook de spanningsafhankelijkheid en inactivatiekinetiek van Cav1.2 veranderen . De β-oligomerisatie wordt gemedieerd door verschillende moleculaire determinanten en heeft dus meerdere interventies nodig die beheerd moeten worden, bijvoorbeeld in geval van pathogene overexpressie van β2. De moleculaire determinant van β2-specifieke langzame en onvolledige inactivatie(zie Figuur 2 (a), panel d) werd geïdentificeerd als de 40-aminozuur C-terminale determinant (ß2CED) aanwezig in alle 7 bekende van nature voorkomende β2 splice varianten. De ontkoppeling van zijn Ca2+-en CaM-onafhankelijke interactie met CBD (Figuur 3(a), panel a) herstelt de inactivatie-eigenschappen die kenmerkend zijn voor ß1b/β3-gemoduleerde Cav1.2 die een snelle en volledige inactivering van vertonen , zoals aangetoond in deletie-experimenten. Naar mijn mening is een dergelijke selectieve loskoppeling van ß2CED van de binding aan zijn receptor in CBD een nieuwe aantrekkelijke strategie om Ca2+ – overbelasting te beheren omdat andere β-subeenheden niet worden beïnvloed. Bovendien zal een cross-talk tussen Cav1.2 en het dichtstbijzijnde doel Ca2+/CaM-afhankelijke proteïne kinase II behouden blijven.
5. Conclusies
dit document heeft aangetoond dat we weten hoe we de inactivatie van Cav1, 2 kunnen versnellen tot minder dan 10 ms (Figuur 3(C)), de inactivatie volledig kunnen ontzeggen (Figuur 4(B) en 4(C)), of de afhankelijkheid van de expressie van β Of α2δ kunnen elimineren zonder significante gevolgen voor de inactivatie. We schetsten de uiteindelijke rollen van de A1C termini en CaM voor inactivatie, en toch heeft geen van deze studies ons dichter bij het uiteindelijke doel gebracht om calciummishandeling geassocieerd met Cav1 te beheren.2 behalve van oude en, helaas, niet te selectieve calciumantagonisten. Het enige nieuwe haalbare doel is pathogene β2 modulatie van Cav1. 2, waar effector-receptor interactie is vastgesteld.in termen van moleculaire biologie behoort Cav1.2 zeker tot de meest gecompliceerde regulerende systemen die bekend zijn. Opmerkelijke moleculaire diversiteit van elk van de Cav1.2 constituenten geeft aanleiding tot meerdere genetische / splice varianten van het kanaal die onderworpen zijn aan segregatie in grote en diverse clusters en aan continue functionele verandering door homo – en heterooligomerisatie van β en andere signalerende componenten, om nog maar te zwijgen van species, weefsel, en ontwikkelingsvariabiliteit. We zijn verrast door de redundantie van de eigenschappen van meerdere Cav1.2-isovormen en zijn nog meer verrast wanneer sommige ervan, die slechts “conventionele” elektrofysiologische eigenschappen vertonen, geassocieerd blijken te zijn met een ziekte . Bij het zoeken naar een verklaring moet ons inzicht niet intuïtief gericht zijn op de kenmerken van de calciumstroom-spanningsafhankelijkheid, amplitude en duur. De eindrespons, zoals de ruimtelijke en temporele organisatie van CREB-signaleringsgebeurtenissen geassocieerd met specifieke Cav1.2-isovormen , en de concurrentie met andere (bijvoorbeeld cAMP-afhankelijke) signaleringsmechanismen, of andere aanwezige Cav1.2-isovormen, kunnen nieuwe ideeën opleveren en nieuwe grenzen openen voor onderzoek naar de rollen van individuele cav1.2-splitsingsvarianten in normale en zieke cellen en weefsels.
Abbreviations
| ADSI: | Annual determinant of slow inactivation |
| CaM: | Calmodulin |
| CBD: | Calmodulin-binding domain |
| CDI: | Ca-dependent inactivation |
| ECFP: | Enhanced cyan fluorescent protein |
| EYFP: | Enhanced yellow fluorescent protein |
| FALI: | Fluorophore-assisted light inactivation |
| FI: | Fast inactivation |
| FRET: | Fluorescent resonance energy transfer |
| GFP: | Green fluorescent protein |
| SI: | Slow voltage-dependent inactivation. |
