resultaten

ALDH1 expressie in embryonale en volwassen Pancreas.

gebaseerd op eerdere studies waarin hoge niveaus van aldh1 enzymatische activiteit in neurale, hematopoëtische en borst epitheliale voorlopercellen (17-19) werden gedocumenteerd, karakteriseerden we temporele en ruimtelijke patronen van ALDH1 eiwitexpressie in embryonale en volwassen muizenpannreas (Fig. 1). Gebruikend E-cadherin als marker van alvleesklierepitheliaale cellen, vonden wij dat ALDH1 proteã ne eerst detecteerbaar binnen het zich ontwikkelende alvleesklierepitheel op E12.5 (Fig. 1 bis). Op dit punt, is de uitdrukking beperkt tot de uiteinden van de vertakkende tubuli, onlangs voorgesteld om een multipotential voorloperdomein te vertegenwoordigen (20). Een vergelijkbaar patroon van expressie is eerder gemeld voor Aldh1a1 transcripten (21). Expressie in de buisvormige uiteinden (en niet in de centrale stammen) blijft door E14.5 (Fig. 1 b en B’), en wordt vervolgens downgereguleerd in het differentiëren van acinaire cellen. Bij volwassen alvleesklier wordt de expressie van epitheliale ALDH1 het vaakst waargenomen in centroacinaire en terminale ductale epitheliale cellen (Fig. 1 C-E). Mesenchymale (e-cadherin-negatief) ALDH1-expressie cellen werden ook gedetecteerd rond endocriene eilandjes en exocriene acini (Fig. S1).

om de ALDH1-expressie en de aldh1-enzymatische activiteit in volwassen terminale ductale/centroacinaire cellen verder te karakteriseren, gebruikten we preparaten van perifere acinaire ductale eenheden die vers zijn geïsoleerd uit de door collagenase verteerde exocriene pancreas van muizen (22). Belangrijk, deze geïsoleerde perifere acinar-ductale eenheden zijn duidelijk uitgeput van grote kanaal en endocriene elementen. Vergeleken met de totale pancreas vertoonden perifere acinar-ductale eenheden een >400-voudige depletie in insulinetranscripten, zoals beoordeeld door RT-PCR (Fig. S2A). Wanneer FACS-analyse werd uitgevoerd op perifere acinar-ductale eenheden geoogst van transgene Ins1:DsRed muizen die rood fluorescerend eiwit in β-cellen tot expressie brengen, waren slechts 3 van de 10.000 cellen (0,03%) van dit preparaat positief voor DsRed.

aanvullende driedimensionale karakterisatie van ALDH1 eiwitexpressie werd bereikt met behulp van whole-mount fluorescente etikettering van geïsoleerde perifere acinar-ductale eenheden. ALDH1 eiwit werd gelokaliseerd in combinatie met E-cadherine als marker van epitheliale cellen, en met ofwel FITC-geconjugeerde Dolichos biflorus agglutinine (DBA) of FITC-geconjugeerde pinda agglutinine (PNA), markers van respectievelijk ductale en acinaire cellen. Multichannel beeldvorming bevestigde een overwegend centroacinaire / terminale ductale locatie van ALDH1-expressie epitheliale cellen in volwassen pancreas (Fig. S3). ALDH1-expresserende cellen werden het vaakst tussen terminaal ductaal epitheel en meer perifere acinaire cellen geplaatst. Daarnaast werden ook enkele epitheliale ALDH1-expressiecellen waargenomen direct naast het terminale ductale epitheel (Fig. S3 A en B). Zowel DBA-positieve als DBA-negatieve ALDH1-positieve cellen werden geïdentificeerd, terwijl ALDH1-positieve PNA-positieve cellen slechts zelden werden geïdentificeerd.

isolatie van CENTROACINAIRE en terminale ductale cellen met ALDH1-expressie.

in de hoop om ALDH1-expresserende cellen te isoleren van volwassen muizenpannreas, hebben we gebruik gemaakt van een fluorogeen substraat bekend als “Aldefluor” (StemCell Technologies), dat eerder werd gebruikt in de FACS-gebaseerde isolatie van hematopoëtische, neurale en borst epitheliale stamcellen (17-19). Alvorens FACS-gebaseerde isolatie van ALDH1-uitdrukkende alvleesklier epitheliale cellen te proberen, pasten we eerst dit reagens toe om levende ALDH1-uitdrukkende cellen in perifere acinar-ductale eenheden te visualiseren (Fig. 2). Zoals in Fig. 2 E en F bevestigden deze studies de centroacinaire / terminale ductale locatie van lage abundantie Aldefluor-positieve cellen in volwassen muizenpannreas. Aldefluor-positieve centroacinaire / terminale ductale cellen werden gemakkelijk onderscheiden van aangrenzende acinaire cellen op grond van hun kleine omvang en gebrek aan zymogen-korrels. Aanvullende voorbeelden van levende-celweergave die het aldefluor-reagens gebruiken worden verstrekt in Fig. S4. Deze bevindingen impliceerden dat anti-ALDH1 immunofluorescentie en op Aldefluor-gebaseerde cytofluorescentie een gelijkaardige centroacinaire/eindductale populatie etiketteerden, en stelden verder voor dat deze cellen met succes door FACS zouden kunnen worden geà soleerd.

vervolgens gingen we verder met FACS-gebaseerde karakterisatie en sortering van afzonderlijke cellen gescheiden van perifere acinar-ductale eenheden. Als een eerste middel om specifieke gating van ALDH1-expresserende cellen vast te stellen, gebruikten we een farmacologische remmer van ALDH1 enzymatische activiteit (DEAB). Zoals afgebeeld in Fig. 2 A-D, Deze strategie toegestaan voor de isolatie van een lage abundantie celpopulatie gekenmerkt door hoge niveaus van DEAB-gevoelige ALDH1 enzymatische activiteit, bestaande uit 0,9% ± 0.2% van alle gesorteerde cellen in volwassen muizenpannreas. Gebruikend een e-cadherin antilichaam om epitheliaale cellen gelijktijdig te identificeren, werden de cellen van Aldefluor (+) E-cadherin (+) gevonden om 0,5% ± 0,13% van alle gesorteerde cellen in volwassen muizenpannreas te vertegenwoordigen (Fig. 2D).

met Behulp van de kwantitatieve RT-PCR voor het vergelijken van de Aldefluor-positief, E-cadherin-positief (A+E+), Aldefluor-negatief, E-cadherin-positief (A−E+), Aldefluor-positief, E-cadherin-negatief (A+E−), en Aldefluor-negatief, E-cadherin-negatief (A−E−) populaties geïsoleerd van volwassen muis alvleesklier, we vinden het A+E+ bevolking aanzienlijk verrijkt voor afschriften codering Aldh1a1 en Aldh1a7, en uitgeput van afschriften voor twee andere ALDH1 isoforms, Aldh1a2 en Aldh1a3 (Afb. 3G). Aldh8a1 werd in geen van de monsters gevonden. Vergeleken met de A−E+ populatie waren A+E+ cellen een bescheiden afname van transcripten voor Pdx1 (P < 0,09), Amylase (P < 0,001) en Cytokeratine-19 (P < 0,01) (markers uitgedrukt in gedifferentieerde β-cellen, acinaire cellen, en kanaalcellen, respectievelijk). In tegenstelling, werden de cellen van A+E+ gekenmerkt door uitdrukking op hoog niveau van Ptf1a, ondanks dat zij van zowel amylaseafschriften als amylaseproteã ne werden uitgeput (Fig. 3G en Fig. S5). Bovendien werden deze cellen verrijkt voor afschriften die coderen Sca-1, Sdf1, C-Met, Nestin, Sox9, Hey1, en Hey2, tellers eerder geassocieerd met voorloperpopulaties in alvleesklier en andere weefsels. Gebruikend immunofluorescente etikettering op cytospin preps van FACS-gesorteerde cellen, bevestigden wij duidelijke verrijking voor ALDH1 en Sox9 proteã ne, en uitputting van amylase in a+E+ cellen (Fig. S5). Daarnaast voerden we ook FACS-analyse uit om de frequentie te bepalen waarmee Aldefluor ( + ) cellen ook positief waren voor stamcelmarkers zoals CD133 en Sca-1 proteïne, en merkten we op dat meer dan 90% van de aldefluor (+) cellen bovendien beide stamcelmarkers uitdrukten. Daarentegen was slechts 0,11% van de aldefluor (+) cellen ook positief voor de vasculaire endotheliale marker PECAM, terwijl 0,08% positief was voor de hematopoëtische marker CD45. Wanneer FACS-analyse werd uitgevoerd op perifere acinar-ductale eenheden geoogst van transgene Ins1-DsRed muizen die rood fluorescerend eiwit tot expressie brengen in β-cellen, bleken alle aldefluor (+) cellen negatief te zijn voor dsRed.

Pancreatosfeer bepaling van endocriene en exocriene Voorloperfunctie.

als een eerste screening voor progenitor-achtige activiteit, hebben we aldefluor (+) en Aldefluor (–) cellen onderzocht op het vermogen om pancreatosferen te vormen (Fig. 3), vergelijkbaar met de neurosphere-analyse die gewoonlijk wordt gebruikt om neurale voorlopercellen te identificeren (23). In deze analyses, waren a+e+ centroacinar/eindductale cellen uniek in staat om bollen in opschortingscultuur te vormen. A+ E + cellen vertoonden een bolvormende efficiëntie >100 keer die van hun A−E+ tegenhangers (Fig. 3 A en B en tabel S1). Met lagere efficiëntie, waren enkele A+E+ cellen zelfs in staat om bollen te vormen wanneer geplateerd bij klonale dichtheid (één cel per put) in 96-wells platen (tabel S1). Geen van de e-cadherin-negatieve populaties vertoonde significante bolvormende capaciteit. Wanneer gecultiveerd over een periode van 5 tot 7 dagen, toonden pancreatosferes uit A+E+ cellen worden afgeleid sterke uitdrukking van e – cadherin (Fig. 3C), die hun epitheliaale identiteit bevestigen, en individuele cellen binnen de gebieden begonnen aanzienlijke hoeveelheden van of amylase of insuline en insuline C-peptide (Fig. 3 D en E). Na 5 dagen vertoonde ≈50% van de pancreatosferen expressie van amylase, terwijl ongeveer 30% immunoreactiviteit vertoonde tegen insuline C-peptide. Individuele bolletjes waren over het algemeen positief voor insuline of amylase, maar niet voor beide. De kleine deelverzamelingen van cellen binnen de bollen handhaafden ALDH1 uitdrukking tijdens de cultuurperiode, en toonden ook nucleaire uitdrukking van sox9 proteã ne aan (Fig. 3 F en G), wat het mogelijk onderhoud van een zelfvernieuwende stamvader pool suggereert. Deze schijnbare capaciteit voor zelfvernieuwing werd verder ondersteund door het feit dat pancreatosferen gegenereerd door aldefluor (+) centroacinaire/terminale ductale cellen konden worden onderworpen aan seriële enzymatische dissociatie, waarbij hun bolvormende capaciteit gedurende minimaal drie opeenvolgende passages met tussenpozen van 7 dagen behouden bleef. Bovendien, cellen binnen bollen waren zeer proliferatief, zoals beoordeeld door overnight incorporatie van EdU toegevoegd aan hetzij het begin of het einde van de kweekperiode (Fig. 3H).

Op basis van de verschillende voorlopercapaciteiten die door A+E+ cellen worden getoond, hebben we verder gesorteerde celpopulaties onderzocht op expressie van Ngn3, een marker van endocriene voorlopercellen (Fig. S2B). In overeenstemming met eerdere studies (7), waren we niet in staat om significante expressie van Ngn3 te detecteren in de totale volwassen pancreas of een van de vers gesorteerde celpopulaties. Echter, zodra de A+ E + cellen in cultuur werden geplaatst, begonnen ze detecteerbare expressie van Ngn3 direct voorafgaand aan het begin van insuline-expressie te genereren, wat de endocriene voorlopercapaciteit van CENTROACINAIRE en terminale ductale epitheliale cellen met ALDH1-expressie verder bevestigde.

Pancreatosferen afgeleid van Aldefluor ( + ) terminale ductale/Centroacinaire cellen vertonen Glucose-responsieve insulinesecretie.

de detectie van cellen die insuline en insuline C-peptide tot expressie brengen in gekweekte pancreatosferen leidde tot de beoordeling of deze cellen in staat waren tot glucose-responsieve insulinesecretie, een kenmerk van functionele β-cellen. Als positieve controle gebruikten we Ins-1 cellen (clone 832/13) een vereeuwigde β-cellijn die vaak wordt gebruikt voor studies van insulinesecretie in reactie op fysiologische concentraties van glucose. Na een nachtelijke incubatie van pancreatosferen of ins-1-cellen in glucose van 0, 5 en 11 mM werden zowel supernatanten als cellysaten geoogst en getest op uitgescheiden en cellulaire insuline C-peptide met behulp van een ELISA-analyse. Pancreatosferen afgeleid van aldefluor ( + ) centroacinaire/terminale ductale cellen afgescheiden C-peptide op een glucose-afhankelijke manier, met glucose gevoeligheid vergelijkbaar met die weergegeven door Ins-1 cellen (Fig. 3I).

Aldefluor (+) volwassen terminale ductale / Centroacinaire cellen kunnen bijdragen aan embryonale endocriene en exocriene lijnen.

als een nog strengere test voor de activiteit van pancreasvoorlopercellen hebben we geïsoleerde aldefluor (+) en Aldefluor (–) cellen in micro-verspreide dorsale pancreasknoppen geïsoleerd uit E12, 5 muizenembryo ‘ s, geà soleerd en getest op een vermogen om productief bij te dragen aan de zich ontwikkelende endocriene en exocriene lijnen (Fig. 4). Deze benadering werd onlangs gebruikt om voorloperactiviteit voor Ngn3-uitdrukkende cellen te documenteren die na alvleesklierkanaal ligatie ontstaan (7). Om het geslacht van volwassen-afgeleide donorcellen te traceren en te onderscheiden van hun embryo-afgeleide tegenhangers, hebben we aldefluor (+) en Aldefluor (–) cellen geïsoleerd uit de alvleesklier van muizen die een alom uitgedrukt pcag:mCherry transgene, zoals schematisch weergegeven in Fig. 4A (pCAG: mcherry muizen werden vriendelijk verstrekt door Michael Wolfgang, Johns Hopkins University). In vergelijking met Aldefluor (–) cellen, droegen aldefluor (+) cellen een dramatisch verhoogd potentieel om bij te dragen aan opkomende endocriene lijnen binnen de rijpende dorsale knoppen, zoals aangetoond door coexpressie van mCherry met beide C-peptide (Fig. 4 B–E) of glucagon (Fig. 4 F-I). Gebruikend gesuperponeerde e-cadherin etikettering om het tellen van individuele mCherry-positieve cellen toe te staan, evalueerden wij kwantitatief de capaciteit van volwassen aldefluor (+) en aldefluor (−) cellen om in embryonale lijnen in te gaan. Zeven dagen na micro-injectie van aldefluor ( + ) cellen in E12.5 dorsale knoppen, werd expressie van glucagon waargenomen in 11,7% van de resterende mCherry-positieve cellen, met insuline C-peptide expressie waargenomen in nog eens 11,6% (Fig. 5N). 2,4% van de residuele mcherry-positieve aldefluor ( – ) cellen daarentegen gaf glucagon tot expressie en slechts 0,2% tot expressie van insuline C-peptide. Interessant is dat de aldefluor ( + ) en Aldefluor ( – ) populaties gelijkwaardige mogelijkheden vertoonden om niet – endocriene epitheliale lijnen binnen te gaan, misschien als gevolg van het feit dat het grootste deel van de aldefluor ( – ) populatie bestond uit reeds gedifferentieerde acinaire cellen. Vergelijkbare frequenties van e-cadherine, amylase en PNA-positiviteit werden waargenomen in residuele mcherry-positieve cellen afgeleid van de aldefluor ( + ) of aldefluor ( – ) populaties (Fig. 4 J-N).

Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.

om het in vivo gedrag van CENTROACINAIRE en terminale kanaalcellen met ALDH1-expressie te evalueren, hebben we patronen van ALDH1-expressie beoordeeld in de setting van chronische ontsteking en regeneratieve metaplasie geïnduceerd door sequentiële toediening van lage doses caeruleïne. Zoals eerder gemeld (15), veroorzaakte de behandeling van volwassen muizen met drie injecties caeruleïne (50 µg/kg) per week gedurende 3 opeenvolgende weken een toestand van chronische pancreatitis gevolgd door bijna volledige regeneratie en herstel. Dit proces wordt gekenmerkt door inflammatoire infiltraten, stromale expansie en de vorming van regeneratieve metaplastische buiscomplexen, waaronder Type-1 buiscomplexen waarvan eerder is aangetoond dat ze acinaire cel-afgeleide zijn, en type-2 buiscomplexen (TC2), waarvan eerder is aangetoond dat ze niet-acinaire afgeleide zijn en vermoedelijk voortkomen uit prolifererende eindkanaalcellen (15). In tegenstelling tot de relatief lage abundantie van ALDH1-expressie eindkanaal en centroacinaire cellen waargenomen in normale volwassen pancreas (Fig. 5 A en B), ALDH1-terminaal kanaal (Fig. 5 C en D) en centroacinar (Fig. 5 E en F) cellen werden duidelijk uitgebreid in de setting van caerulein-geïnduceerde chronische pancreatitis. Van nota, type-2 tubulaire complexen bestonden voornamelijk uit ALDH1-expresserende cellen (Fig. 5H), terwijl type-1 buiscomplexen geen bewijs van ALDH1-expressie vertoonden (Fig. 5G).