Abstract
Er zijn verschillende technieken beschikbaar voor de isolatie van Candida in de mondholte. Dergelijke methoden spelen een belangrijke rol bij de diagnose en het beheer van orale candidose. Het groeiende belang van Candida is deels gerelateerd aan de opkomst van HIV-infectie en het meer wijdverbreide gebruik van immunosuppressieve chemotherapie. Samen met de Candida albicans is er een grotere erkenning van het belang van de Nonalbicans Candida soorten in orale candidose. Identificatie van infecterende stammen van Candida is belangrijk omdat isolaten van Candida-soorten sterk verschillen, zowel in hun vermogen om infecties te veroorzaken als ook in hun gevoeligheid voor antischimmelmiddelen. Dit overzicht biedt dus een overzicht van de betrouwbare methoden voor candidaisolatie en identificatie van isolaten uit de mondholte.
1. Inleiding
De term Candida komt van het Latijnse woord candid, wat wit betekent. De sporen van Candida zijn een commensale, onschadelijke vorm van een dimorfe schimmel die invasieve en pathogene pseudohyphae wordt wanneer er een verstoring in het evenwicht van de flora of in verzwakking van de gastheer .
De vertaling van deze endogene commensaal naar de ziekteverwekkende parasiet kan in verband worden gebracht met andere factoren dan de pathogene eigenschappen van het organisme zelf, die vrij uniek zijn in vergelijking met de meeste andere infectieziekten, waarbij de virulentie van de organismen die als de belangrijkste factor in de pathogenese worden beschouwd. Daarom zijn Candida-soorten strikt opportunistisch. Het kan worden gesteld met dat noch de oppervlakkige noch de systemische vormen van Candida-infecties kunnen worden geïnitieerd in de afwezigheid van onderliggende pathologie .
Er zijn vele soorten Candida (Tabel 1), maar de meest voorkomende die uit de mondholte wordt teruggevonden, zowel in commensale toestand als in gevallen van orale candidose, is C. albicans. Geschat wordt dat deze soort goed is voor meer dan 80% van alle orale gistisolaten.
Candida albicans
Candida glabrata
Candida dubliniensis
Candida guilliermondii
Candida krusei
Candida lusitaniae
Candida parapsilosis
Candida tropicalis
Candida kefyr
de afgelopen jaren is er een toegenomen interesse geweest in infecties veroorzaakt door het opportunistische pathogeen Candida. Het groeiende belang van Candida is deels gerelateerd aan de opkomst van HIV-infectie en het meer wijdverbreide gebruik van immunosuppressieve chemotherapie . Identificatie van infecterende stammen van Candida is belangrijk omdat isolaten van Candida-soorten sterk verschillen, zowel in hun vermogen om infecties te veroorzaken als ook in hun gevoeligheid voor antischimmelmiddelen .
samen met de C. albicans is er een grotere erkenning van het belang van de niet-albicans Candida soorten in de menselijke ziekte. C. glabrata en C. krusei zijn soorten die aandacht hebben gekregen vanwege hun verhoogde resistentie tegen bepaalde antischimmelmiddelen. C. dubliniensis is een recent geïdentificeerde pathogene soort, voor het eerst beschreven in 1995 toen het werd gecoïsoleerd met C. albicans van gevallen van orale candidose in HIV geïnfecteerde individuen .
Dit overzicht geeft een overzicht van de betrouwbare methoden voor candidaisolatie en identificatie van isolaten uit de mondholte.
2. Pathogene eigenschappen van Candida
De overgang van Candida van een onschadelijk commensaal naar een pathogeen organisme is complex en houdt verband met subtiele milieuveranderingen die leiden tot de expressie van een reeks virulentiefactoren (Tabel 2). Het is het gecombineerde effect van zowel gastheer als candidale factoren die uiteindelijk bijdragen aan de ontwikkeling van orale candidose .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||
ongeacht het type candidose is het vermogen van Candida-soorten om aan te houden op de mucosale oppervlakken van gezonde individuen een belangrijke factor die bijdraagt tot de virulentie ervan. Dit is vooral belangrijk in de mondholte, waar het organisme moet weerstaan de mechanische wassen actie van een relatief constante stroom van speeksel naar de slokdarm .
Er wordt geen enkele overheersende virulentiefactor voor Candida herkend, hoewel er een aantal factoren zijn die betrokken zijn bij het bevorderen van het infectieproces. Deze omvatten kenmerken, betrokken bij de aanhechting van Candida te orale oppervlakken (bijv., relatieve cel oppervlak hydrofobiciteit en de aanwezigheid van specifieke adhesin moleculen), de mogelijkheid om te weerstaan host afweer mechanismen (bv., hoge frequentie fenotypische schakelen en morfologische overgang), en de release van hydrolytische enzymen (bv., afgescheiden aspartyl proteïnasen en fosfolipasen) die schade aan gastheercellen kunnen veroorzaken .
3. Orale candidose
Samaranayake stelde een indeling voor waarbij de orale candidose laesies werden onderverdeeld in twee hoofdgroepen: Groep I, of primaire orale candidose beperkt tot laesies gelokaliseerd in de mondholte zonder betrokkenheid van de huid of andere slijmvliezen; groep II of secundaire orale candidose, waarbij de laesies aanwezig zijn in zowel de orale als extraorale plaatsen zoals de huid (Tabel 3). Groep I laesies bestaan uit de klassieke triade—pseudomembraneuze, erythemateuze en hyperplastische varianten—en sommigen hebben voorgesteld verdere onderverdeling van de laatste in plaque-achtige en nodulaire types .
| primaire orale candidose (Groep I) | secundaire orale candidose (groep II) | |
| de “primaire triade”: | Condition | Subgroup |
| Pseudomembranous (mainly acute) | Familial chronic mucocutaneous candidosis | 1 |
| Erythematous (acute/chronic) | Diffuse chronic mucocutaneous candidosis | 2 |
| Hyperplastic (mainly chronic) | Candidosis endocrinopathy syndrome | 3 |
| (i) Plaque-like | Familial mucocutaneous candidosis | 4 |
| (ii) Nodular/speckled | Severe combined immunodeficiency | 5a |
| Candida-associated lesions | Di George syndrome | 5b |
| Denture stomatitis | Chronic granulomatous disease | 5c |
| Angular cheilitis | Acquired immunodeficiency syndrome | 6 |
| Median rhomboid glossitis | — | — |
| Linear gingival erythema | — | — |
4. Diagnose van orale candidose
diagnose van orale candidose kan vaak worden gesteld op basis van de aard van de klinische presenterende kenmerken, hoewel indien mogelijk microbiologische monsters moeten worden genomen om elke aanwezige Candida te identificeren en te kwantificeren en isolaten te leveren voor antischimmelgevoeligheidstesten.
5. Methoden voor isolatie
beschikbare technieken voor de isolatie van Candida in de mondholte omvatten het gebruik van een uitstrijkje, een gewoon wattenstaafje , een imprintcultuur , het verzamelen van heel speeksel , het geconcentreerde mondspoeling en mucosale biopsie. Elke methode heeft bijzondere voor-en nadelen en de keuze van de bemonsteringstechniek wordt in de eerste plaats bepaald door de aard van de te onderzoeken laesie (Tabel 4). Wanneer een toegankelijke en gedefinieerde laesie duidelijk is, wordt vaak de voorkeur gegeven aan een directe bemonsteringsmethode, zoals het gebruik van een wattenstaafje of een afdruk, aangezien dit informatie oplevert over de organismen die aanwezig zijn bij de laesie zelf. Wanneer er geen duidelijke laesies zijn of wanneer de laesie moeilijk toegankelijk is, is een indirect monster op basis van het kweken van speekselmonsters of een orale spoeling meer aanvaardbaar.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
kwantitatieve schatting van de schimmelbelasting kan worden gedaan aan de hand van afdrukken, geconcentreerde orale spoeling en kweek van orale spoeling, als een middel om onderscheid te maken tussen commensaal vervoer en pathogene aanwezigheid van orale Candida, waarbij hogere ladingen waarschijnlijk worden geacht bij de laatste .
6. Directe microscopie
morfologische kenmerken van Candida-soorten (Tabel 5) moeten worden onderzocht voor identificatie. Een uitstrijkje is van waarde in het onderscheiden tussen gist en hyphal vormen, maar is minder gevoelig dan culturele methoden . Kaliumhydroxide (KOH) bereiding van het monster onthult niet-gepigmenteerde gesepteerde Hyphen met karakteristieke dichotoom vertakking (onder een hoek van ongeveer 45°) . In Koh-Calcofluor fluorescerende-vlek methode schimmel kenmerken zoals hyphae, gistcellen, en andere schimmel elementen fluoresceren .
|
||||||||||||||||||||||
een uitstrijkje dat van de locatie van lesional wordt genomen, wordt gefixeerd op objectglaasjes van de microscoop en vervolgens gekleurd met de gramkleur of de periodic acid Schiff (PAS) – techniek. Met behulp van deze methoden, Candida Hyphen en gisten verschijnen ofwel donkerblauw (Gram-vlek) of rood/paars (PAS) .
in geval van chronische hyperplastische candidose is een biopsie van de laesie noodzakelijk voor de daaropvolgende detectie van binnenvallende Candida door histologische kleuring met behulp van de methenaminezilvervlekken van PAS of Gomori. Demonstratie van schimmel elementen binnen weefsels wordt gedaan als ze diep worden geverfd door deze vlekken. De aanwezigheid van blastosporen en hyphae of pseudohyphae kan de histopatholoog in staat stellen om de schimmel te identificeren als een soort Candida en, gezien de aanwezigheid van andere histopathologische kenmerken, een diagnose van chronische hyperplastische candidose .
7. Laboratoriumkweek
7.1. Wattenstaafje
een wattenstaafje op een bepaalde plaats is een relatief eenvoudige methode om de groei te detecteren en een semiquantatieve schatting van Candida kan worden verkregen. De bemonstering aanpak omvat zachtjes wrijven een steriele wattenstaafje over het lesional weefsel en vervolgens vervolgens inoculeren een primair isolatiemedium zoals sabouraud dextrose agar (SDA) .
7.2. Geconcentreerde orale spoeling
de orale spoeltechniek omvat dat de patiënt gedurende 1 minuut 10 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (0,01 M, pH 7,2) in de mond houdt. De oplossing wordt vervolgens geconcentreerd (10-voudig) door centrifugeren en een bekend volume, meestal 50 µL, geïnoculeerd op een agarmedium met behulp van een spiraalvormig plateersysteem. Na 24-48 uur incubatie bij 37°C wordt de groei bepaald door het tellen van kolonies en uitgedrukt als Candida−kolonievormende eenheden per mL (cfu mL-1) spoeling .
7.3. Imprintcultuur
De imprintmethode maakt gebruik van een steriel schuimkussen van bekende grootte (typisch 2,5 cm2), dat vooraf vlak voor gebruik in een geschikt vloeibaar medium is gedompeld, zoals de bouillon van Sabouraud. Het pad wordt dan geplaatst op de doelplaats (mucosa of intraorale prothese) gedurende 30 seconden en vervolgens overgebracht naar een agar voor cultuur .
8. Kweekmedia
het meest gebruikte primaire isolatiemedium voor Candida is SDA, dat weliswaar de groei van Candida toelaat, maar door zijn lage pH de groei van vele soorten orale bacteriën onderdrukt. Typisch SDA wordt aëroob bij 37°C gedurende 24-48 uur geïncubeerd. Candida ontwikkelt zich als Room, gladde, pasteuze convexe kolonies op SDA en differentiatie tussen soorten is zelden mogelijk . Er wordt geschat dat meer dan één Candida-soort voorkomt in ongeveer 10% van de orale monsters en in de afgelopen jaren is het vermogen om nonalbicans-soorten te detecteren steeds belangrijker geworden .
in de afgelopen jaren zijn andere differentiële media ontwikkeld die het mogelijk maken bepaalde Candida-soorten te identificeren op basis van het uiterlijk en de kleur van de kolonie na de primaire cultuur. Het voordeel van dergelijke media is dat de aanwezigheid van meerdere Candida species in een enkele besmetting kan worden bepaald die belangrijk kan zijn bij het selecteren van volgende behandelingsopties . Voorbeelden hiervan zijn Pagano-Levin agar of in de handel verkrijgbare chromogene agars, namelijk CHROMagar Candida, Albicans ID, Fluroplate, of Candichrom albicans .
Pagano-Levin agar maakt een onderscheid tussen Candida-soorten op basis van reductie van trifenyltetrazoliumchloride. Het medium produceert lichtgekleurde kolonies van C. albicans, terwijl kolonies van andere Candida-soorten verschillende gradaties van roze kleur vertonen. Pagano-Levin agar heeft een vergelijkbare gevoeligheid voor SDA maar is superieur voor de detectie van meer dan één soort in het monster , chromagar Candida identificeert C. albicans, C. tropicalis, en C. krusei gebaseerd op kolonie kleur en uiterlijk , terwijl Albicans ID en Fluroplate hebben bewezen gunstig voor de vermoedelijke identificatie van C. albicans . De specificiteit van de identificatie is 95% voor CHROMagar Candida en 98,6% voor Albicans ID en Fluroplate agars . Het gebruik van CHROMagar Candida als primaire isolatieagar is geciteerd als een benadering die onderscheid mogelijk maakt tussen de nieuw beschreven C. dubliniensis en C. albicans. Op CHROMagar Candida ontwikkelt C. dubliniensis zich naar verluidt als donkerder groene kolonies vergeleken met die van C. albicans . Het onderscheid tussen deze twee soorten met behulp van CHROMagar lijkt echter te verminderen bij subcultuur en opslag van isolaten. Het niet groeien van C. dubliniensis op agar media bij de verhoogde incubatietemperatuur van 45°C is onlangs voorgesteld als een alternatieve test om onderscheid te maken tussen deze twee soorten .
9. Identificatie van Candida-soorten
Identificatie van gisten op basis van primaire kweekmedia kan worden bevestigd door een verscheidenheid aan aanvullende tests die traditioneel zijn gebaseerd op morfologische (Tabel 5) en fysiologische kenmerken van de isolaten.
9.1. Morfologische Criteria
De kiembuistest is de standaard laboratoriummethode voor de identificatie van C. albicans. De test omvat de inductie van hypale uitgroei (kiembuizen) wanneer gesubcultureerd in paardenserum bij 37°C gedurende 2-4 uur. Ongeveer 95% van de isolaten van C. albicans produceren kiembuizen, een eigenschap die ook wordt gedeeld door C. stellatoidea en C. dubliniensis .
C. albicans en C. dubliniensis kunnen ook van andere soorten worden geïdentificeerd op basis van hun vermogen om morfologische kenmerken te produceren die bekend staan als chlamydosporen. Chlamydosporen zijn refractiele, sferische structuren gegenereerd op de eindpunten van Hyphen na cultuur van isolaten op een voedingsarm medium zoals maïsmeel agar. Isolaten worden geïnoculeerd in een kruisluikpatroon op de agar en bedekt met een steriele dekslip. Agars worden gedurende 24-48 uur bij 37°C geïncubeerd en vervolgens microscopisch onderzocht op de aanwezigheid van chlamydospore .
9.2. Fysiologische Criteria / biochemische identificatie
de biochemische identificatie van Candida-soorten is grotendeels gebaseerd op het gebruik van koolhydraten. Bij traditionele tests zouden testisolaten zijn gekweekt op een basale agar zonder koolstofbron. Koolhydraatoplossingen zouden dan worden geplaatst in putten van de gezaaide agar of op filtreerpapier schijven op het agar oppervlak. Groei in de buurt van de koolstofbron zou wijzen op gebruik. Commerciële systemen zijn gebaseerd op hetzelfde principe, maar test koolhydraten zijn ondergebracht in plastic putten op een teststrip. Groei in elk putje wordt afgelezen door veranderingen in troebelheid of kleurveranderingen in bepaalde kit-systemen. De uit de testresultaten verkregen numerieke codes worden gebruikt om het testorganisme te identificeren op basis van databankvergelijking .
9.3. Serologie
serologische tests worden vaak gebruikt om de klinische significantie van isolaten van Candida-soorten vast te stellen. Stijgende titers van LGG-antilichamen tegen C. albicans kunnen invasieve candidiasis weerspiegelen bij immunocompetente personen. De opsporing van antilichamen IgA en IgM is belangrijk om een scherpe besmetting te identificeren. Immuungecompromitteerde personen vertonen vaak variabiliteit in antilichaamproductie en in dat geval wordt het gebruik van een antigeendetectietest aanbevolen. Tests zoals enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) en radio immuno assay (RIA) voor detectie van candidiaal antigeen, ofwel celwand mannan of cytoplasmatische bestanddelen zijn nu beschikbaar in ontwikkelde landen .
serologische diagnose is vaak vertraagd en de tests hebben nog steeds een gebrek aan gevoeligheid en specificiteit. Bovendien is de antilichaamproductie bij immunogecompromitteerde patiënten variabel, wat de diagnose gecompliceerd maakt . Dit is te wijten aan het feit dat schimmelantigenen en metabolieten vaak snel uit de circulatie worden geklaard en de aanwezigheid van antilichamen betekent niet altijd een Candida-infectie, vooral bij patiënten met een ernstige onderliggende ziekte of die immunosuppressieve geneesmiddelen gebruiken .
serologische tests zijn normaal gesproken geen diagnostisch hulpmiddel voor orale candidose. Dergelijke tests kunnen echter een prognostisch instrument zijn bij patiënten met ernstige orale candidose die slecht reageren op antimycotische therapie .
9.4. Moleculaire identificatiemethoden
identificatie door analyse van genetische variabiliteit is een stabielere benadering dan het gebruik van methoden op basis van fenotypische criteria. Voor de identificatie van Candida die op genetische variatie wordt gebaseerd zijn analyses van elektroforetische karyotype verschillen en de polymorfismen van de lengte van het beperkingsfragment (RFLPs) gebruikend gelelektroforese of DNA-DNA hybridisatie .
soortspecifieke PCR-benaderingen zijn ook gebruikt voor de identificatie van Candida-soorten. Verscheidene doelgenen zijn gemeld voor discriminatie van Candida-species, hoewel die het vaakst worden versterkt de opeenvolgingen van het ribosomal operon van RNA zijn. De identificatie kan worden verkregen op basis van PCR-productgroottes die worden verkregen na de resolutie van de gelelektroforese of de variatie van de PCR-productopeenvolging die wordt bepaald door directe sequencing of door het gebruik van de analyse van het beperkingsfragment na het snijden van PCR-sequenties met beperkingsendonucleases .
fluorescentie in situ hybridisatie met peptide nucleïnezuur methode (PNA Fish) is een nieuwe detectietechniek die zich richt op sterk geconserveerde soortspecifieke sequenties in de overvloedige rRNA van levende C. albicans. De individuele cellen kunnen direct zonder de behoefte aan versterking worden ontdekt . Deze techniek bereikt een gevoeligheid van 98,7-100%, met een specificiteit van 100%, die voor de discriminatie van C. albicans van fenotypisch gelijkaardige C. dubliniensis toestaat .
moleculaire technologie kan ook worden gebruikt om stammen van Candida-soorten te identificeren, hoewel het gebruik van technieken zoals Pulsed-Field gelelektroforese (PFGE), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) analyse en repeat sequence amplification PCR (REP) grotendeels voorbehouden is voor epidemiologisch onderzoek bij onderzoek naar orale candidose .
10. Conclusie
De laatste jaren is meer nadruk gelegd op betrouwbare identificatie van Candida-soorten uit klinische monsters bij de mens. Een schematische weergave voor Candida isolatie en identificatie is weergegeven in Figuur 1. Aangezien Candida de resident microflora is, zijn geschikte isolatiemethoden vereist om de aanwezigheid in de mond samen met hun aantal vast te stellen. Het is ook belangrijk om de infecterende stammen van Candida te identificeren omdat isolaten van Candida-soorten sterk verschillen, zowel in hun vermogen om infecties te veroorzaken als ook in hun gevoeligheid voor antischimmelmiddelen. Verschillende fenotypische technieken zijn beschikbaar voor het identificeren van geïsoleerde Candida met inbegrip van het gebruik van morfologische kweektests, differentiële agarmedia en biochemische assimilatietests. Deze methoden worden aangevuld met recente Moleculaire technieken die grotendeels gereserveerd zijn voor epidemiologisch onderzoek.
