screening van humane celoppervlaktemarkers

hESC-en HPSC-RPE-cellen werden gesplitst in afzonderlijke cellen met TrypLE gedurende 5-10 minuten. Optische blaasjes werden losgemaakt in enkele cellen met TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) gedurende 10 minuten, gevolgd door fysieke dissociatie door een 20 G naald. Om de gelijktijdige analyse van deze verschillende populaties in hetzelfde monster toe te staan, werden hESC, HPSC-RPE-cellen en optische vesikelcellen geëtiketteerd met CellTrace™ CFSE (0,25 µM) gedurende 7 min bij 37 °C of CellTrace™ Violet (5 µM) gedurende 20 min bij 37 °C volgens het Protocol van de fabrikant (Thermo Fisher Scientific). Vervolgens werden de drie celtypes bevlekt met behulp van de BD Lyoplate™ Screening Panels (Bd Biosciences) volgens het Protocol van de fabrikant. Het barcoderen van cellen stond toe om gemakkelijk tussen de drie groepen cellen te onderscheiden en steekproefvariabiliteit tijdens het onderzoek te minimaliseren. Monsters werden geanalyseerd op 96-wells platen op een LSRFortessa uitgerust met 405, 640, 488, 355 en 561 nm lasers (Bd Biosciences) of een CytoFLEX uitgerust met 405, 638, 488 en 561 nm lasers (Beckman Coulter). Niet-levensvatbare cellen werden uitgesloten van de analyse met behulp van 7-AAD (7-aminoactinomycine D) nucleïnezuurkleurstof (Biowetenschappen van BD). De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de FlowJo V.10 software (Tree Star). Het markerscherm van de celoppervlakte werd één keer uitgevoerd voor 3D optische blaasjes, en één keer voor HPSC-RPE dag 60.

celkweek

hESC-lijnen HS980 en HS983 werden eerder afgeleid en gekweekt onder xenovrije en gedefinieerde voorwaarden30 (Swedish Ethical Review Authority: 2011/745: 31/3). Donoren hebben hun geïnformeerde toestemming gegeven voor de afleiding en het daaropvolgende gebruik van de hESC-lijnen. De wa09 / H9 hESC lijn werd verkregen uit Wicell en werd aangepast aan feeder-free cultuur op hrLN-521 (10 µg/mL, Biolamina). Cellen werden gehandhaafd door klonen op hrln-521-gecoate platen in NutriStem hPSC XF medium (biologische industrieën), in een 5% CO2/5% O2 incubator, en enzymatisch gepasseerd bij 1:10 verhouding elke 5-6 dagen.

hiPSC lijnen CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I en CTRL-14-II werden vriendelijk verstrekt door de Karolinska Institutet IPSC Core facility (Swedish Ethical Review Authority): 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Donoren gaven hun geïnformeerde toestemming voor de afleiding en het daaropvolgende gebruik van de hiPSC-lijnen. Cellen werden gehandhaafd door klonen op hrln-521-gecoate platen (Biolamina) in NutriStem HPSC XF medium (biologische industrieën), in een 5% CO2/5% O2 incubator en enzymatisch gepasseerd bij 1:10 verhouding elke 5-6 dagen.

voor het passeren werden confluente culturen tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2+ en Mg2+ en gedurende 5 minuten geïncubeerd bij 37 °C, 5% CO2/5% O2 met TrypLE Select. Het enzym werd vervolgens zorgvuldig verwijderd en cellen werden verzameld in vers voorverwarmd NutriStem HPSC XF medium door voorzichtig pipetteren om een eencellige suspensie te verkrijgen. Cellen werden gecentrifugeerd bij 300 × g gedurende 4 minuten, de pellet geresuspendeerd in verse voorverwarmde NutriStem HPSC XF medium, en cellen geplateerd op een vers hrln-521-gecoate schaal. Twee dagen na de passage werd het medium vervangen door verse voorverwarmde NutriStem HPSC XF medium en dagelijks vervangen.

HPSC-RPE monolaagdifferentiatie

een stap-voor-stap-protocol dat het differentiatieprotocol beschrijft, is te vinden bij Protocolwissel36. hESC of hiPSC werden geplateerd met een celdichtheid van 2,4 × 104 cellen / cm2 op laminine-gecoate gerechten (20 µg/mL) met NutriStem HPSC XF medium. Rho-kinase inhibitor (Y-27632, Millipore) bij een concentratie van 10 µM werd toegevoegd tijdens de eerste 24 uur, terwijl de cellen werden gehouden bij 37 °C, 5% CO2/5% O2. Na 24 uur werd HPSC-medium vervangen door differentiatiemedium NutriStem HPSC XF zonder basisfibroblastgroeifactor (bFGF) en transformerende groeifactor-β (Tgfß) (biologische industrieën) en cellen werden geplaatst bij 37 °C, 5% CO2/21% O2. Vanaf dag 6 na het plateren werd 100 ng/mL Activin A (R&D systemen) toegevoegd aan de media. Cellen werden drie keer per week gevoed en gedurende 30 dagen bewaard. Monolagen werden vervolgens trypsinized met TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) gedurende 10 min bij 37 °C, 5% CO2. Het enzym werd zorgvuldig verwijderd en de cellen werden verzameld in vers voorverwarmd NutriStem HPSC XF medium zonder bFGF en TGFß door voorzichtig pipetteren om een eencellige suspensie te verkrijgen. De cellen werden gecentrifugeerd bij 300 × g gedurende 4 minuten, de pellet werd geresuspendeerd, door een celzeef (ø 40 µm, Biowetenschappen van BD), en cellen werden gezaaid op met laminine beklede schalen (hrln-111 en hrLN-521 bij 20 mg/mL) bij verschillende celdichtheden variërend van 1,4 × 106 tot 1,4 × 104 cellen/cm2. Opnieuw afgeplatte cellen werden gedurende de daaropvolgende 30 dagen driemaal per week gevoed met NutriStem HPSC XF medium zonder bFGF en TGFß. Voor HPSC-RPE in vitro differentiatie in 3D suspensie EBs, hebben we ons eerder gepubliceerde protocol10 gevolgd. Kort, pluripotent stamcellen werden gekweekt aan samenvloeiing op rhLN-521 en handmatig geschraapt om EBs te produceren gebruikend een 1000 µL pipetuiteinde. De EBs werden vervolgens gekweekt in suspensie in low attachment plates (Corning) met een dichtheid van 5-7 × 104 cellen/cm2. Differentiatie werd uitgevoerd in op maat gemaakte NutriStem hESC XF medium waarin bFGF en TGFß zijn geëlimineerd met media verandering twee keer per week. Tien micromol Rho-kinase inhibitor (Y-27632, Millipore) werd toegevoegd aan de suspensieculturen slechts tijdens de eerste 24 h. na 5 weken differentiatie, werden gepigmenteerde gebieden mechanisch uit EBs gesneden met behulp van een scalpel. De cellen werden vervolgens gescheiden met TrypLE Select, gevolgd door een 20 G naald en spuit door te spoelen. Cellen werden gezaaid door een celzeef (ø 40 µm, Bd Biowetenschappen) op LN-gecoate gerechten met een celdichtheid van 0.6-1. 2 × 104 cellen/cm2 en tweemaal per week gevoed met hetzelfde differentiatiemedium als hierboven vermeld. Bright field beelden werden verkregen met een Nikon Eclipse TE2000-S microscoop en een Canon SX170 IS camera werd gebruikt om pigmentatie vast te leggen vanaf de bovenkant van de putten.

kwantitatieve real-time PCR

totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van de Rneasy Plus Mini Kit en behandeld met RNase-vrije DNase (beide van Qiagen). Complementair DNA (cDNA) werd gesynthetiseerd met 1 µg totaal RNA in een reactiemengsel van 20 µL, dat willekeurige hexameren en Superscript III reverse transcriptase (Gibco, Invitrogen) bevat, volgens de instructies van de fabrikant.

flowcytometrie

celsortering werd uitgevoerd op HPSC-RPE-culturen na 21 of 30 dagen differentiatie. De cellen werden met de genoemde geconjugeerde antilichamen gedurende 30 minuten op ijs geïncubeerd. FMO controles werden opgenomen voor elke aandoening te identificeren en gate-negatieve en-positieve cellen. Gekleurde cellen werden vervolgens gesorteerd met behulp van een BD FACS Aria Fusion Cell Sorter (Bd Biosciences) met behulp van de FACSDiva Sofware v8.0.1.

direct na het sorteren werden 70.000 cellen verdund in 100 µL van 2% FBS en 1 mM EDTA (Sigma) gedurende 5 minuten bij 400 r.p.m. op glazen objectglaasjes cytospinned. De glaasjes werden ‘ s nachts bij kamertemperatuur laten drogen, gevolgd door fixatie met 4% methanol-vrije formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en immunofluorescentiekleuring.

immunofluorescentie

histologie en weefselimmunostaining

onmiddellijk na euthanasie door intraveneuze injectie van 100 mg / kg pentobarbital (allfatale vet. 100 mg / mL, omnidea), waren de ogen enucleair en het injectiegebied van de bleb gemarkeerd met groene Weefselmarkeringskleurstof (TMD) (Histolabproducten). Een intravitreale injectie van 100 µL fixatieoplossing (FS) bestaande uit 4% gebufferd formaldehyde (Solvenco AB) werd uitgevoerd vóór fixatie in FS gedurende 24-48 uur en inbedding in paraffine. De vier-micrometer seriële secties werden geproduceerd door het TMD-geëtiketteerde gebied en om de vier secties werden bevlekt met hematoxylin–eosine.

voor immunostaining werden de objectglaasjes gedeparaffiniseerd in xyleen, gedehydrateerd in gesorteerde alcoholen en gespoeld met Ddh2o en Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS, pH 7,6). De antigeenwinning werd bereikt in 10 mM citraatbuffer (trinatriumcitraatdihydraat, Sigma-Aldrich, pH 6,0) met 1:2000 Tween-20 (Sigma-Aldrich) bij 96 °C gedurende 30 min, gevolgd door 30 min koeling bij kamertemperatuur. De glaasjes werden gewassen met TBS en gedurende 30 minuten Geblokkeerd met 10% normal donkey serum (Abcam) verdund in TBS met 5% (g/v) IgG en protease-vrije runderserumalbumine (Jackson Immunoresearch) in een bevochtigde kamer. Primaire antilichamen verdund in blokkeringsbuffer werden ‘ s nachts bij 4 °C geïncubeerd: humaan nucleair mitotisch apparaateiwit (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnologie sc-432) en CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnologie sc-7326, kloon ) (aanvullende gegevens 2). Secundaire antilichamen (donkey anti-rabbit IgG (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 en donkey anti-mouse IgG (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, beide van Thermo Fisher Scientific) (aanvullende gegevens 2) verdund 1:200 in blokkeringsbuffer werden 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Secties werden gemonteerd met vector Vectashield met DAPI ((4’,6-diamidino-2-phenylindol)) montagemedium (Vector laboratoria) onder een 24 × 50 mm2 coverslip.

Voor immunohistochemistry, dia ‘ s waren deparaffinized gevolgd door antigen retrieval (ER2 oplossing, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) en kleuring (IHC Protocol F) voor CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) en CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, kloon ) antilichamen (Aanvullende Gegevens 2) op Bond RXm instrument (Leica Biosystems).

beelden werden genomen met Olympus ix81 fluorescentie omgekeerde microscoop of Zeiss lsm710-NLO punt scanning confocale microscoop. Post-acquisitie analyse van de foto ‘ s werd uitgevoerd met behulp van de ImageJ software.

fagocytose assay

fluoresceïne-isothiocyanaat-geëtiketteerde boviene POSs werden geïsoleerd en vriendelijk toegediend door Dr. E. F. Nandrot van het Institut de la Vision, Paris37. HPSC-RPE cellen werden gekweekt op transwell membraan (0,33 cm2, Corning) gecoat met hrln-521 20 µg/mL gedurende 1 maand na het zaaien. Cellen werden geïncubeerd bij 37 °C of 4 °C gedurende 16 uur met 2,42 × 106 ontdooide POS / Transwell verdund in DMEM (Dulbecco ’s modified Eagle’ S medium) of CO2-onafhankelijke media (beide van Thermo Fisher Scientific), respectievelijk. Na incubatie werden de cellen geblust met Trypan Blue oplossing 0.2% (Gibco, Invitrogen) gedurende 10 min bij kamertemperatuur, gefixeerd met 4% methanol-vrije formaldehyde (Polysciences) bij kamertemperatuur gedurende 10 min, en permeabilized met 0,3% Triton X-100 in D-PBS gedurende 15 min. Rhodamine phalloidin kleuring (1: 1000, 20 min bij kamertemperatuur, Biotinum 00027) (aanvullende gegevens 2) werd gebruikt om de celgrenzen te visualiseren. Kernen werden gekleurd met Hoechst 33342 (1: 1000, 20 min bij kamertemperatuur, Invitrogen).

beelden werden verkregen met Zeiss lsm710-NLO point scanning confocale microscoop. Post-acquisitie analyse van de foto ‘ s werd uitgevoerd met behulp van Imaris (Bitplane) en POS kwantificeringen werden gedaan met de CellProfiler 2.1.1 software. Gebruikte Modules: load images, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, MeasureObjectSizeShape, SaveImages, en ExportToSpreadsheet. Objecten werden geïdentificeerd door een typische diameter van 10-40 pixel eenheden met behulp van twee klassen, Global, Otsu, gewogen variantie drempelwaarde methode met 0.01 en 1.0 onder-en bovengrenzen, en 2.1 correctiefactor, met samengeklonterde objecten onderscheiden door intensiteit.

Enzyme-linked immunosorbent assay

HPSC-RPE cellen werden gekweekt op Transwell membranen (0,33 cm2, Millipore) gecoat met verschillende substraten. De supernatanten van zowel de apicale als de basale zijde van hPSC-RPE (wat respectievelijk betekent dat de bovenste en onderste compartimenten van de transwell) werden verzameld 60 uur nadat het medium werd veranderd. PEDF-secretiespiegels werden gemeten in drievoud voor elke aandoening met commercieel verkrijgbare humane PEDF ELISA-Kits (BioVendor RD191114200R) werden, overeenkomstig de instructies van de fabrikant, na 60 dagen kweek gebruikt. De optische dichtheidssreading werd gemeten met behulp van SpectraMax 250 Microplaatlezer (moleculaire apparaten). De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM.

Teer metingen

Transepitheliale elektrische weerstand RPE-cellen op Transwells (0,33 cm2, Millipore) werden gemeten met behulp van de millicell Electrical Resistance System volt-ohm meter (Millicell ers-2, Millipore), volgens de instructies van de fabrikant. 60-daagse culturen werden geëquilibreerd buiten de incubator bij kamertemperatuur gedurende 15-20 minuten voor het experiment. Metingen werden uitgevoerd in onveranderde kweekmedia in drievoud voor elke aandoening, op drie verschillende posities van elk putje. Voor verdere analyse werden gemiddelden gebruikt. De achtergrondweerstand werd bepaald van een blanco kweektussenvoegsel in dezelfde media die met het overeenkomstige substraat maar zonder cellen worden bedekt, en van de respectieve experimentvoorwaarde worden afgetrokken. Metingen worden gerapporteerd als weerstand in ohm maal het oppervlak in vierkante centimeters (Ω × cm2). De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM.

Scanning elektronenmicroscopie

hPSC-RPE-cellen werden gedurende 60 dagen gekweekt op transwell-inserts gecoat met LN521 (20 µg / mL). Ze werden gefixeerd door onderdompeling in 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4. Het transwell membraan werd uitgesneden en gewassen in MilliQ water voorafgaand aan stapsgewijze ethanoldehydratie en kritische puntdroging met behulp van kooldioxide (Leica EM CPD 030). Inserts werden gemonteerd op specimen stubs met behulp van carbon zelfklevende tabs en sputter gecoat met een dunne laag platina (Quorum Q150T ES). Scanning elektronenmicroscopie beelden werden verkregen met behulp van een Ultra 55 veld emissie scanning elektronenmicroscoop (Zeiss, Oberkochen, Duitsland) bij 3 kV en de se2 detector.

Transmissieelektronenmicroscopie

hPSC-RPE-cellen werden gedurende 60 dagen gekweekt op transwell-inserts gecoat met LN521 (20 µg / mL). Ze werden gefixeerd door onderdompeling in 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4. Het transwellmembraan werd uitgesneden en in dunne stroken gespoeld in 0,1 M fosfaatbuffer, gevolgd door postfixatie in 2% osmiumtetroxide in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4, bij 4 °C gedurende 2 uur. De membraan strips werden onderworpen aan stapsgewijze ethanoldehydratie en uiteindelijk plat ingebed in LX-112. Ultrathine secties (~50-60 nm) werden bereid met behulp van een Leica EM UC7 en contrasteerden met uranylacetaat, gevolgd door loodcitraat. De beeldvorming van de transmissieelektronenmicroscopie werd gedaan op een Hitachi HT7700 transmissieelektronenmicroscoop (Hitachi High-Technologies) die bij 80 kV in werking werd gesteld en digitale beelden werden verworven gebruikend een Veleta CCD camera (Olympus Soft Imaging Solutions).

eencellige RNA-sequencing bioinformatische analyse

60-daagse HPSC-RPE-cellen werden gescheiden met TrypLE Select en door een celzeef (ø 40 µm, Biowetenschappen van BD) gevoerd. Ze werden geresuspendeerd in een concentratie van 1000 cellen / µL in 0,04% BSA in PBS. Cellen werden bij 4 °C getransporteerd naar de eukaryotische eencellige Genomicafaciliteit (ESCG, SciLifeLab, Stockholm, Zweden) waar een 3′ cDNA-bibliotheek werd voorbereid voor eencellige RNA-sequencing met het 10x Genomicsplatform (10x Genomics) met behulp van de NovaSeq 6000-software. Cell Ranger 2.1.1 (10x Genomics) pipeline werd gebruikt om Illumina base call bestanden te converteren naar fastq-formaat, uitlijnen sequencing leest naar de hg19 transcriptome met behulp van de ster aligner38, en het genereren van functie-barcode matrices. Cell Ranger quality-control gefilterde cellen (718, 810, 931, en 1129 cel-bevattende druppels werden gevangen voor CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, replaced 1:20 en hESC monsters, respectievelijk) werden geanalyseerd in R versie 3.5.1 (R Core Team)39,met behulp van Seurat suite versie 2.3.440, 41. Als verdere kwaliteitscontrolemaatregel werden RPE-cellen met uniek tot expressie gebrachte genen (≥2000 tot ≤5000), UMIs (≥10.000 tot ≤30.000) en het percentage UMI-mapping naar MT-genen (≥0,025 tot ≤0,10) geselecteerd. Evenzo, hESC met uniek uitgedrukte genen (≥2000 tot ≤8000), UMIs (≥10.000 tot ≤80.000), en percentage van UMI mapping aan MT-genen (≥0,025 tot ≤0,10). Deze filtratiestap resulteerde in een definitieve dataset van 616, 725, 779 en 905 cellen voor respectievelijk CD140b + GD2 -, CD140b+CD184 -, opnieuw geplakte 1: 20 en hESC-monsters. Vóór dimensionaliteitsreductie door hoofdcomponent (PC) analyse, werden de cel–celvariatie in genuitdrukking gedreven door UMIs, mitochondrial genuitdrukking, en de stadia van de cel-cyclus regressed uit tijdens gegevens het schalen proces42. Variabele genen binnen RPE monsters werden geselecteerd op basis van hun genormaliseerde gemiddelde expressie en dispersie (expressie cut-off = 0,0125–5, en bottom dispersion cut-off = 0,5). Voor PC-selectie werden bevindingen van PCHeatmap, jackStraw, PC-standaarddeviaties en Clustree-analyse beoorded43. De eerste 15 PC ‘ s werden gebruikt voor de tSNE-projectie44 en clustering-analyse (resolutie = 0,1, perplexiteit = 40).

celclusters werden geanalyseerd door twee benaderingen. De hoogste differentiële genen werden eerst geà dentificeerd voor elke cluster gebruikend de rang-somtest van Wilcoxon. De secundaire, expressie van het handtekeningengen (modulescores) werd berekend voor ongedifferentieerde hESC en verscheidene celtypes huidig in menselijk netvlies. De cellen die mesoderm tellers uitdrukken werden handmatig onderverdeeld in een afzonderlijke cluster gebruikend interactieve het plotten eigenschappen van Seurat. Gegevens worden geüpload in ArrayExpress (EMBL-EBI) – Zie details hieronder.

Dieren

na goedkeuring door het Northern Stockholm Animal Experimental Ethics Committee (DNR N25 / 14) werden in dit onderzoek 10 Nieuw-Zeelandse witte albinokonijnen (verstrekt door Lidköpings rabbit farm, Lidköping, Zweden) van 5 maanden oud, met een gewicht van 3,5 tot 4,0 kg gebruikt. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring voor het gebruik van dieren in oog-en Gezichtsonderzoek.

subretinale transplantatie

HPSC-RPE monolagen werden gewassen met PBS, geïncubeerd met TrypLE en gedissocieerd aan eencellige suspensie. Cellen werden geteld in een Neubauer hemocytometerkamer met 0,4% Trypan blue (Thermo Fisher Scientific Corp.), gecentrifugeerd bij 300 × g gedurende 4 minuten, en de celpellet werd geresuspendeerd in vers met filter gesteriliseerde PBS tot een uiteindelijke concentratie van 1000 cellen/µL. De celsuspensie werd vervolgens aseptisch aliquoteerd in 600 µL eenheden en op ijs gehouden tot de operatie.

dieren werden onder algehele narcose gebracht door intramusculaire toediening van 35 mg / kg ketamine (Ketaminol, 100 mg/mL, Intervet) en 5 mg/kg xylazine (Rompun vet. 20 mg/mL, Bayer Animal Health), en de pupillen werden verwijd met een mengsel van 0,75% cyclopentolaat/2,5% fenylefrine (APL). Microchirurgie werd uitgevoerd op beide ogen met behulp van een 2-poorts 25 g transvitreale pars plana techniek (Alcon Accurus, Alcon Nordic) zoals eerder beschreven 45. De celsuspensie werd opgezogen in een 1 mL spuit die verbonden was met een verlengbuis en een 38G polytip canule (MedOne Surgical Inc). Zonder voorafgaande vitrectomie, werd de canule ingebracht door de bovenste temporale trocar. Na de juiste tip positionering, vastgesteld door een focale retinale flare, 50 µL celsuspensie (gelijk aan 50.000 cellen) werd langzaam subretinaal geïnjecteerd ~6 mm onder de inferieure marge van de oogzenuw hoofd, de vorming van een uniforme bleb die duidelijk zichtbaar onder de operationele microscoop was. Er werd voor gezorgd dat de punt tijdens de injectie binnen de bleb bleef om terugvloeiing tot een minimum te beperken. Na het verwijderen van het instrument werd lichte druk uitgeoefend op de zelfdichtende hechtingsloze sclerotomieën. Twee microgram (100 µL) intravitreaal triamcinolon (Triescence, Alcon Nordic) werd 1 week voorafgaand aan de operatie toegediend en er werden geen postoperatieve antibiotica gegeven.

statistieken en reproduceerbaarheid

voor statistische analyses werden tweerichtingsanalyses van variantie en post hoc meervoudige vergelijkingen met behulp van Tukey ‘ s testcorrectie uitgevoerd om de in vitro verschillen te beoordelen van de verschillende gemeten dichtheden en sorteeromstandigheden in teer-en PEDF-secretieanalyses.

alle kwantificeringen werden ongeblindeerd uitgevoerd. Statistische parameters met inbegrip van de definities en de exacte waarde van n (bv. totaal aantal experimenten, replicaties, enz.), afwijkingen, P-waarden, en de soorten van de statistische tests worden gerapporteerd in de cijfers, de overeenkomstige figuur legendes, en in deze sectie. Statistische analyse werd uitgevoerd met Prism 7 (GraphPad Software, Versie 7.0 c). In alle gevallen werd statistische analyse uitgevoerd op gegevens van ten minste drie biologisch onafhankelijke experimentele replicaten. Vergelijkingen tussen groepen werden gepland voordat statistische tests werden uitgevoerd en de omvang van het beoogde effect was niet vooraf bepaald. De op de grafieken weergegeven foutbalken geven het gemiddelde ± SEM van ten minste drie onafhankelijke experimenten weer. Alle getoonde micrografen zijn representatieve beelden van drie onafhankelijke experimenten, tenzij anders vermeld (bijv., Fig. 1c).

Rapporteringssamenvatting

nadere informatie over de opzet van het onderzoek is beschikbaar in de aan dit artikel gekoppelde samenvatting van de Nature Research Reporting.