karakterisatie van de geconstrueerde CDK ‘ s. (a) Cyclin e-CDK2/3 complexen, of hun f80a geconstrueerde tegenhangers (aangegeven door asterisken), werden immunoprecipitated van transfected u2os cel lysates via de Ha-markering op de CDK subeenheid en onderworpen aan in vitro kinasesanalyses met 10 µM van of normale ATP of PE-ATP analoog. Fosforylatie van GST-Rb werd gecontroleerd door immunoblotting met een fosfospecifiek anti-pS780-Rb antilichaam (New England Biolabs). De wild-type kinases kunnen PE-ATP niet gebruiken. (b) dunnelaagchromatografie-analyse openbaart hydrolyse van ATP in cellysaat en overdracht aan (links) acceptornuclotiden. De posities van het vrije fosfaat en ATP zijn aangegeven. In tegenstelling, wordt ATP-γ – S niet gehydrolyseerd in cellysaten (rechts). (c) De kinaseanalyses werden uitgevoerd gebruikend wild-type en cyclin a-CDK2 (F80A) complexen gezuiverd van E. coli en GST-Rb in aanwezigheid van 200 µM van ATP, ATP-γ-S en PE-ATP-γ-S bij kamertemperatuur gedurende 2 h. De kinasereacties werden geanalyseerd door SDS-gelelektroforese en gevisualiseerd door coomassie het bevlekken. De omvang van de GST-Rb fosforylering werd gecontroleerd door de elektromobiliteitsverschuiving van GST-Rb.

terwijl de mutante CDK ‘ s in vitro efficiënt PE-ATP gebruikten voor fosforylaat Rb, faalden vergelijkbare experimenten met radioactief gelabeld PE-ATP in cellysaten omdat het gelabelde fosfaat uit PE-ATP werd gesplitst door een ATPase-activiteit in de lysaten (gegevens niet getoond). We schakelden daarom over op de thiofosfaatvorm van het ATP-analoog (PE-ATP-γ-S), dat niet door lysaten werd gehydrolyseerd (figuur 1b). Hoewel kinasen vaak ATP-γ-S minder efficiënt gebruiken dan normaal ATP, heeft thiofosforylatie in dit verband verschillende voordelen. Ten eerste zijn thiofosfaten stabieler en bestand tegen fosfatasen . Ten tweede, aangezien er geen reeds bestaande thiofosforylatiegebeurtenissen in de cellen zijn, verstrekt de etikettering van thiofosfaat unieke tellers voor proteã NEN gefosforyleerd door het mutantkinase. Ten slotte heeft de thiofosfaatgroep vergelijkbare chemische eigenschappen als de sulfhydrylgroep en is ze vatbaar voor chemische modificaties. Wij uitdrukten en zuiverden oplosbare wild-type en cyclin a-CDK2 (F80A) complexen van bacteriën en voerden een gelijkaardige RB-kinaseanalyse uit om hun capaciteit te testen om PE-ATP-γ-S. te gebruiken. Zoals getoond in Figuur 1c, hoewel beide kinases ATP of ATP-γ-s aan fosforylate GST-Rb proteã ne kunnen gebruiken (zoals door zijn elektromobiliteitsverschuiving wordt aangegeven) slechts kan de mutant f80a PE-ATP-γ-S. wij zo PE-ATP-γ-s voor al onze volgende studies gebruiken.

enkelvoudige zuivering van thiofosforylated peptiden

het gebruik van geconstrueerde CDK ‘ s en ATP-analogen vergemakkelijkt zeer specifieke fosforylering van substraten: de volgende uitdaging is hoe ze te identificeren binnen een complex lysaat. We hebben geprobeerd om de thiofosfaat tags te gebruiken om thiofosforylated peptiden covalent te vangen en te verrijken na fosforylering en vertering van de lysaten. Nochtans, was een belangrijk probleem om chemisch thiofosfopeptiden en cysteine-bevattende peptiden te onderscheiden. Hoewel een chemoselectieve methode voor het verrijken van thiofosfopeptiden is beschreven, maakt de overweldigende overvloed aan cysteine residuen in een complex eiwitmengsel deze aanpak moeilijk . Wij gebruikten een eenvoudige capture-and-release methode om thiofosforylated peptides binnen trypsinized cel lysates selectief te isoleren (figuur 2a). De proteã nen binnen het lysaat werden in vitro gefosforyleerd met cyclin a-CDK2 (F80A) en PE-ATP-γ-S. het eiwitmengsel werd later verteerd en de resulterende peptiden werden gemengd met Thiopropylsepharose 6B , een geactiveerde disulfidehars die zowel cysteine-bevattende peptiden als thiofosfopeptiden door een reactie van de disulfideuitwisseling vangt. Omdat traditionele dithiothreitol (DTT)-elution beide soorten gebonden peptiden vrijmaakt, gebruikten we de kwalitatieve verschillen tussen harsgebonden thiofosfaatpeptiden en cysteine-bevattende peptiden bij de fosforothiolatesulfide-koppeling en alkyldisulfide-koppeling, respectievelijk. Bij hoge pH-waarden wordt de fosforothiolatesulfideverbinding gehydrolyseerd en blijft de alkyldisulfide intact . Behandeling van de hars met een sterke base (zoals natriumhydroxide) geeft specifiek thiofosfopeptiden af (en zet ze ook om in normale fosfopeptiden), maar niet de cysteïnehoudende peptiden, door de fosforothiolatesulfideverbinding te hydrolyseren (figuur 2b). Omdat peptiden die via cysteïne worden gebonden in de laatste stap niet worden geëlueerd, kunnen we cysteïne-bevattende thiofosfopeptiden niet herstellen. Bovendien resulteert de elutie in verlies van de thiofosfaatsignatuur door het thiofosfopeptide om te zetten in een fosfopeptide. Onze thiofosfopeptide isolatiemethode verschilt bescheiden van die van Blethrow et al. in die zin vangen we de thiofosfopeptiden op met behulp van disulfide-uitwisselingschemie (disulfidehars) in plaats van alkylering (jodoaceetamidehars), en we elueren ze selectief met basishydrolyse in plaats van oxidatie.

enkelvoudige zuivering van thiofosfopeptiden. a) algemeen schema voor isolatie van thiofosfospeptiden. De proteã nen werden geëtiketteerd met cyclin a-CDK2 (F80A) en PE-ATP-γ-S en onderworpen aan tryptic verteren. De resulterende peptiden werden gemengd met disulfideparels, die zowel thiofosfopeptiden als cysteine-bevattende peptiden vangen. De parels werden vervolgens behandeld met basisoplossing om selectief alleen de phosphopeptiden vrij te geven. b) de chemie die ten grondslag ligt aan de selectiviteit van thiofosfopeptide. Zowel thiofosfaat als cysteine delen bevatten reactieve thiol groepen die covalent kunnen worden gevangen door disulfide parels. Bij hoge pH-waarden, worden de fosforothiolatesulfideverbindingen (dichtbij de hogere pijl) gehydrolyseerd om de versie van parel-gebonden peptides toe te staan terwijl de alkyldisulfideverbanden (dichtbij de lagere pijl) stabiel zijn en aldus peptides op de parels worden behouden. Merk op dat tijdens de hydrolyse van de fosforothiolatesulfideverbinding thiofosfaat wordt omgezet in normaal fosfaat.

om de haalbaarheid van deze aanpak te testen, hebben we gefosforyleerd GST-Rb met cycline a-CDK2 (F80A) en PE-ATP-γ-S, en hebben we onze zuiveringsprocedure toegepast op een trypsinedigest van het reactiemengsel. De geà soleerde peptides werden geanalyseerd door electrospray tandem massaspectrometrie (ESI-MS/MS) gebruikend een ionenval massaspectrometer. Peptides werden geà dentificeerd door de spectra van de tandemmassage aan een menselijk eiwitvolgorde (met toegevoegde GST-Rb opeenvolging) aan te passen gebruikend SEQUEST software . Het substraat GST-Rb bevat vijf cysteines evenals zeven SP / TP plaatsen, die plaatsen voor CDK phosphorylation worden begunstigd . We hebben meerdere fosfopeptiden gevonden die alleen en alle verwachte fosforylatieplaatsen bevatten (Tabel 1). Verder hebben we geen cysteine-bevattende peptiden en zeer weinig niet-specifieke peptiden teruggevonden. Dit leverde een proof-of-principle op voor onze grootschalige analyses.

Identificatie van humane cycline a-CDK2 substraten in cel lysaten

ons doel was om potentiële cycline A-cdk2 substraten op proteoom-brede schaal. Om de monstercomplexiteit te verminderen, hebben we het hele cellysaat van HEK293-cellen gefractioneerd in 11 fracties met behulp van ionenuitwisselingschromatografie en ammoniumsulfaat precipitatie (aanvullend gegevensbestand 1). Vervolgens voerden we in vitro kinase assays uit op elke fractie. Als positieve controle hebben we ook een kleine hoeveelheid GST-Rb aan elke reactie toegevoegd. Na het verteren van het reactiemengsel met trypsine hebben we ons reinigingsprotocol toegepast om de thiofosfopeptiden te isoleren van de peptidemengsels. De teruggewonnen peptides werden onderworpen aan vloeibare chromatografie-analyse van lidstaten/lidstaten en gegevensbestand het zoeken. We hebben variërende aantallen peptiden en minstens één RB fosfopeptide van elk van de lysaatfracties teruggevonden (aanvullend gegevensbestand 2).

cdks fosforylaateiwitten op een Proline-gerichte manier op serine of threonine, en talrijke studies ondersteunen het idee dat het motief S/T-P-X-R/K het CDK-consensusmotief vertegenwoordigt. Uit de phosphopeptides identificeerden wij een totaal van 203 proteã nen: 180 kandidaten werden phosphorylated binnen SP of TP motieven (Proline-gericht; aanvullend gegevensbestand 3). Deze kandidaat-substraten vertegenwoordigen een breed scala van biologische processen, waaronder de controle van de celcyclus, DNA – en RNA-metabolisme, vertaling en cellulaire structuren (Figuur 3). In totaal kwamen 96 van de 222 (43%) Proline-gerichte locaties overeen met de bekende CDK-consensus (met een positief geladen residu in de +3-positie). Interessant is dat ongeveer 24% van de Proline-gerichte sites (53/222) een positief geladen residu in ofwel de +4 of +5 posities, wat suggereert dat dit motief ook kan worden begunstigd door CDK2. Inderdaad, Blethrow et al. merkte ook op dat een substantieel aantal cyclin B-CDK1 substraten niet-consensusplaatsen bevatten. Voor de peptiden die niet op consensus sites, ontdekten we dat ongeveer 50% van de overeenkomstige eiwitten gedragen ten minste één K/RXLφ of K/RXLXφ motief (waar φ is een grote hydrofobe residu en X is een aminozuur) distaal van de fosforylering sites, en bijna alle van hen droeg op zijn minst een minimale RXL-motief (Aanvullende gegevens bestand 3). Dit is consistent met het gevestigde idee dat deze motieven cyclin a-CDK2 band aan substraten bevorderen . Naast het selecteren voor phosphorylations met CDK consensusmotieven, identificeerden wij 28 proteã nen die eerder als CDK-substraten zijn betrokken (vetgedrukt in aanvullend gegevensdossier 3) . Zo is bijna 15% van onze kandidaten eerder gevonden Als CDK-doelwitten, wat het idee ondersteunt dat onze methoden zijn vastgelegd en verrijkt voor CDK2-substraten. Tot slot is 43% van de fosforylaties die we vonden eerder geïdentificeerd in grootschalige, in vivo fosfoproteoomanalyses, wat erop wijst dat deze fosforylaties niet beperkt zijn tot onze in lysaat condities .

classificatie van eiwitten per functionele categorie. De aantallen geven geïdentificeerde proteã nen in elke categorie aan.

zowel onze studies als die gerapporteerd door Blethrow et al. gebruikte gelijkaardige phosphopeptide isolatieschema ‘ s en verwante cyclin-CDKs, en wij verwachtten dat er wezenlijke overlapping in de substraten zou kunnen zijn die door beide studies worden geopenbaard. Inderdaad, vonden wij bijna 50% (30/68) van cyclin B-CDK1 substraten in onze lijst van cyclin a-CDK2 kandidaten; aldus, zijn deze methodes robuust en reproduceerbaar (aanvullend gegevensdossier 4). Nochtans, zijn er ook wezenlijke verschillen tussen de twee lijsten, en deze waarschijnlijk voortvloeiden uit vele factoren, met inbegrip van procedurele verschillen, verschillende celtypes, onvolledige peptide identificatie door lidstaten, en substraatspecificiteit die door cyclin en/of kinasesubeenheden wordt toegekend. Sommige van deze verschillen kunnen de verschillende biologische functies van cyclin a-CDK2 en cyclin B-CDK1 ook weerspiegelen. Bijvoorbeeld, vonden wij negen proteã NEN betrokken bij eiwitvertaling en/of ribosoomfunctie, maar geen van deze proteã nen werden gevonden met cyclin B-CDK1, ondanks hun vrij hoge overvloed.

hoewel we een aantal bekende CDK2-substraten hebben geïdentificeerd, hebben we enkele eerder beschreven CDK2-substraten niet geïdentificeerd. Sommige van de hierboven genoemde factoren kunnen ook verantwoordelijk zijn voor het niet vinden van bekende CDK2-substraten in onze analyses. Bovendien zouden substraten die al gefosforyleerd zijn door endogene CDK ‘ s in vitro Niet thiofosforyleerd zijn. Het is ook mogelijk dat sommige eiwitten niet zijn opgelost tijdens de lysaatbereiding en/of de sonicatiestap en zijn uitgesloten van onze analyses. Tot slot is het mogelijk dat grote eiwitcomplexen verstoord zijn door de fractioneringsprocedures voorafgaand aan de kinasereactie, en dat eiwitten die alleen gefosforyleerd worden door CDK2 in de context van deze complexen niet ontdekt kunnen worden door onze methoden.

we hebben ook vier phosphopeptiden teruggevonden die overeenkomen met cyclin A en CDK2 en 27 extra phosphopeptiden met niet-proline gerichte sites (aanvullend gegevensbestand 5). Wij vermoedden deze phosphopeptides uit auto-phosphorylation van cyclin a-CDK2 en achtergrond phosphorylation door andere kinases resulteerden, en anderen hebben gelijkaardige achtergrond phosphorylation gemeld . Om deze mogelijkheden te testen, voerden wij een reactie van het controlekinase uit gebruikend cyclin a-CDK2 (F80A) en PE-ATP-γ-s zonder toegevoegde cellysaat drie van vier cyclin a-CDK2 peptides (aanvullend gegevensdossier 5) terug. Bovendien, toen wij een gelijkaardige ‘kinase-only’ reactie in aanwezigheid van γ-32P-ATP uitvoerden, merkten wij 32P opname in beide proteã nen op een dosisafhankelijke manier (aanvullend gegevensdossier 6). Deze experimenten bevestigden dat er Achtergrond auto-phosphorylation van cyclin a-CDK2 in de originele analyses was.

we voerden ook controlekinasereacties uit met behulp van de lysaatfracties, GST-Rb ‘spike-in’ en PE-ATP-γ-s zonder toevoeging van cycline a-CDK2. Deze’ no-kinase ‘ controle reacties gefosforyleerd 7 van de 27 niet-proline gerichte phosphopeptiden op onze lijst (aanvullend gegevensbestand 5), wat suggereert dat de meeste, zo niet alle, van deze phosphopeptiden het gevolg waren van achtergrondfosforylatie door kinasen die in staat zijn om het ATP-analoog in beperkte mate te gebruiken. Bijvoorbeeld, bevatten de meeste van deze peptides zure residu-geleide phosphorylation plaatsen die caseïnekinase 2 motieven zijn. Caseïnekinase 2 is uniek in die zin dat het GTP evenals ATP kan gebruiken; aldus, kan de actieve plaats de omvangrijke ATP-analogen, zoals PE-ATP geschikt maken . Belangrijk is dat we geen RB fosfopeptiden uit deze controle-experimenten terughaalden, wat erop wijst dat er geen niet-specifieke CDK-activiteit in onze analyses was. We hebben ook 44 ongemodificeerde peptiden gevonden, waarvan 12 cysteïne-residuen bevatten. De meerderheid van deze peptiden is afkomstig uit verscheidene lysaatfracties (aanvullend gegevensbestand 2). We vermoeden dat deze het gevolg waren van een lage niet-specifieke binding van peptiden aan de hars ondanks strenge wassingsomstandigheden, en in het geval van de cysteïnehoudende peptiden, van een kleine hoeveelheid hydrolyse van de alkyldisulfideverbinding tijdens de elutiestap. Samengevat, waren onze methodes hoogst selectief, en onze studies identificeerden een verrassend grote groep kandidaatcyclin a-CDK2 substraten, waarvan de meesten niet eerder als CDK-doelstellingen zijn geà dentificeerd.

validatie van kandidaat-substraten als cyclin a-CDK2-targets

We gebruikten verschillende strategieën om enkele van de nieuwe kandidaten in onze lijst als cyclin a-CDK2-substraten te valideren. Omdat onze eiwitidentificaties op peptide opeenvolgingen werden gebaseerd, begonnen wij door te bevestigen dat cyclin a-CDK2 phosphorylated drie full-length en inheemse kandidaten die immunoprecipitated via epitope markeringen van transfected 293 cellen (EF2, TRF2, en RAP1) waren. Omdat deze proteã nen niet op de lijst cyclin B-CDK1 aanwezig waren , bepaalden wij als zij ook phosphorylated door cyclin B-CDK1 zijn. Elke CDK2-kandidaat werd phosphorylated door zowel cyclin a-CDK2 als cyclin B-CDK1, hoewel EF2 in mindere mate phosphorylated was dan of TRF2 of RAP1 (figuur 4a). We hebben ook TRF2, RAP1 en het ribosomale eiwit RL12 uitgedrukt als GST-fusions en gezuiverd van Escherichia coli. Toen wij cyclin a-CDK2 aan phosphorylate TRF2 en RAP1 in vitro gebruikten, waren de proteã nen hoogst phosphorylated, en de analyses van lidstaten onthulden dat deze phosphorylations op dezelfde plaatsen voorkwamen die wij aanvankelijk identificeerden (figuur 4b). Wij gebruikten ook cyclin a-CDK2 en cyclin B-CDK1 aan phosphorylate GST-RL12, en vonden dat beide CDKs ook phosphorylated RL12 in vitro (figuur 4c). Deze studies bevestigen zo dat peptides in ons scherm worden geà dentificeerd proteã nen vertegenwoordigen die door cyclin a-CDK2, minstens in vitro kunnen worden phosphorylated. Hoewel wij kwalitatieve verschillen in de capaciteit van cyclin a-CDK2 en cyclin B-CDK1 aan phosphorylate specifieke proteã nen vonden, werden in elk geval de kandidaten phosphorylated door beide CDKs. Omdat het enzympreparaat dat wij in deze studies gebruikten een overmaat van vrije CDK2 (F80A) bevatte, beschouwden wij de mogelijkheid dat sommige substraatfosforylations uit de Vereniging van endogene cyclins met CDK2 (F80A) zouden kunnen voortvloeien die of monomeric was, of die van cyclin a tijdens de testvoorwaarden kan hebben losgemaakt. Wij vonden dat de hoeveelheid activiteit van cyclin B-CDK2 (F80A) in deze extracten verwaarloosbaar met cyclin a-CDK2 (F80A) werd vergeleken, en wij konden geen activiteit van cyclin e-CDK2 (F80A) ontdekken (extra gegevensdossier 7). Niettemin, kunnen wij niet de mogelijkheid uitsluiten dat sommige peptides door CDK2 (F80A) in complex met endogene cyclin phosphorylated kunnen zijn, en de specificiteit van om het even welk kandidaatsubstraat voor cyclin A versus andere cyclins die CDK2 activeren moet worden gevalideerd zoals hieronder beschreven.

in vitro validatie van selectieve kandidaat-CDK2-substraten. (a) HEK293 cellen werden tijdelijk getransfecteerd met vectoren die vlag-tagged EF2, TRF2, en RAP1 uitdrukken. Anti-vlag antilichaam immunoprecipitaten werden in vitro gefosforyleerd met cycline a-CDK2 of cycline B-CDK1 in aanwezigheid van γ-32P-ATP (linkerbovenpanelen). In parallelle reacties, was histone H1 phosphorylated als controle om de activiteiten van cyclin a-CDK2 en cyclin B-CDK1 (juist paneel) te normaliseren. “C” betekent “alleen kinase” – reacties zonder getransfecteerde substraten (linkerpaneel) en “geen kinase” – reactie (rechterpaneel). De eiwitsteekproeven werden gescheiden door SDS-pagina en de gels werden overgebracht op PVDF-membranen. Fosfosignalen werden gevisualiseerd door autoradiografie. Het membraan werd vervolgens gesondeerd met anti-vlag antilichaam (Sigma-Aldrich) om de identiteit van de fosfo-signaal lagerband (linkeronderpanelen) te bevestigen. Het sterretje vertegenwoordigt een niet-specifieke band van de commerciële cyclin B-CDK2 voorbereiding. (b) De Kinasereactie werd uitgevoerd gebruikend γ-32P-ATP, en GST-TRF2, GST-RAP1, GST-Rb (positieve controle) en GST (negatieve controle) als substraten in aanwezigheid of afwezigheid van wild-type cyclin a-CDK2 kinase. Reacties werden gevisualiseerd door SDS pagina gevolgd door coomassie kleuring en autoradiografie (linker paneel). Een gelijkaardige kinaseanalyse werd uitgevoerd gebruikend wild-type cyclin A/CDK2 en ATP-γ-S, en later onderworpen aan een phosphopeptideisolatieschema. MS-analyse bevestigde dat TRF2 en RAP1 elk gefosforyleerd waren op de exacte locaties die we op het scherm identificeerden met één extra locatie voor RAP1 (rechterpaneel). (c) De kinaseanalyse werd uitgevoerd gebruikend γ-32P-ATP, cyclin a-CDK2 of cyclin B-CDK1 met stijgende hoeveelheden gezuiverd GST-RL12. Monsters werden gescheiden door SDS pagina en de gel werd gekleurd met Coomassie (Onderpaneel) gevolgd door autoradiografie (bovenpaneel). “C” betekent “alleen kinasereacties” zonder getransfecteerde substraten.

validatie van RL12 als een in vivoCDK2-substraat

bovenstaande studies valideerden verschillende nieuwe kandidaten die in ons scherm in vitro als CDK2-substraten werden geïdentificeerd. Echter, om te bepalen of een nieuw substraat ook gefosforyleerd wordt door CDK2 in vivo, hebben we een uitgebreidere analyse uitgevoerd van het ribosomale eiwit RL12. Wij eerst gemengde immunoprecipitates van epitope-geëtiketteerd cyclin a-CDK2 en RL12 uitgedrukt in menselijke cellen in aanwezigheid van γ-32P-ATP en vonden dat cyclin a-CDK2 phosphorylated rl12 in vitro (figuur 5a). De fosforylering werd grotendeels afgeschaft in een mutant RL12 waar de geïdentificeerde fosfoserine S38 werd vervangen door een alanine, en het werd hersteld toen S38 werd vervangen door een threonine (figuur 5b). Wij gebruikten toen phosphopeptide mapping om peptide die S38 bevatten te identificeren, en bevestigden dat het direct phosphorylated door CDK2 in vitro was (figuur 5c). Om te testen als RL12 ook phosphorylated in vivo op een CDK2-afhankelijke manier bij dezelfde plaats is, labelden wij metabolisch cellen met 32P-orthophosphate, en immunoprecipitated wild-type of RL12-S38A van cellen overexpressie of cyclin e-CDK2, katalytisch inactieve cyclin e-CDK2, of de CDK-inhibitor p21 (om endogene CDKs te remmen) . Omdat we endogene rl12 fosforylering niet kunnen bestuderen vanwege het ontbreken van een geschikt anti-RL12 antilichaam, werd in deze studies de fosforylering van ectopische RL12 in vivo onderzocht (deze transfectieomstandigheden leidden tot een ongeveer vijf – tot tienvoudige overexpressie van rl12 mRNA (aanvullend gegevensbestand 8). We vonden dat wild-type RL12, maar niet RL12-S38A, gefosforyleerd was in vivo (figuur 5d). Deze phosphorylation werd verbeterd in cellen overexpressie cyclin E-CDK2, maar niet inactieve cyclin e-CDK2, en was verminderd in cellen overexpressie de P21 CDK inhibitor (die endogene cyclin-CDKs remt; Figuur 5d). Tot slot gebruikten wij phosphopeptide mapping en phosphoaminozuuranalyses van rl12 eiwit immunoprecipitated van de geëtiketteerde cellen en bevestigden dat rl12 phosphorylation door cyclin e-CDK2 in vivo ook op S38 (figuur 5e) voorkwam. Rl12 S38 fosforylering in vivo is ook gemeld in fosfoproteoomstudies .

fosforylering van RL12 in vitro en in vivo. (A) HA-tagged RL12 or vector control (‘vec’) werden tijdelijk getransfecteerd in u2os-cellen en immunoprecipitated gebruikend 12ca5 antilichaam. Cyclin a-CDK2 complexen werden ook tijdelijk afzonderlijk uitgedrukt in u2os cellen en immunoprecipitated gebruikend een antilichaam tegen cyclin A. De kinaseanalyses werden uitgevoerd gebruikend rl12 (of controle) immunoprecipitate met of zonder cyclin a-CDK2 immunoprecipitate in aanwezigheid van γ-32P-ATP. (b) gelijkaardige analyses werden uitgevoerd gebruikend cyclin a-CDK2 en rl12 immunoprecipitates die wild-type (wt) en de aangewezen rl12 fosfosite mutanten bevatten. Het sterretje geeft de lichte keten van het antilichaam aan. C) Phosphopeptide mapping en fosfo-aminozuuranalyse van het radioactief gelabelde wild-type (linkerpaneel) en s38t-mutant (rechterpaneel) van RL12. (d) Wild-type RL12, RL12-S38A, of vectorcontrole werd tijdelijk mede-transfected met cyclin e-CDK2, katalytisch inactieve (DN) cyclin E-CDK2, of p21. Alle cellen werden onderworpen aan 32P orthofosfaatetikettering. RL12 werd immunoprecipitated uit cel lysaten en gevisualiseerd door SDS pagina gevolgd door autoradiografie. e) de analyse van het in kaart brengen van Fosfopeptiden werd ook uitgevoerd op het radioactief gelabelde RL12 zoals aangegeven onder d). De onderste pijl toont een tweede en minder belangrijke phosphorylation plaats ontdekt in vivo.

hoewel we elk van de nieuwe kandidaten die we tot nu toe hebben getest hebben gevalideerd door aan te tonen dat de volledige proteïnen gefosforyleerd zijn door CDK2, zullen sommige kandidaten op onze lijst waarschijnlijk niet fysiologisch relevante cycline a-CDK2-substraten blijken te zijn. Bijvoorbeeld, werden de kinasereacties uitgevoerd in lysates, en subcellular compartmentalization in vivo kan de toegang van CDK2 aan sommige kandidaten beperken. Bovendien is het mogelijk dat andere cellulaire kinasen redundant zijn met, of belangrijker dan, CDK2 met betrekking tot individuele substraten in vivo. Het is dus van cruciaal belang dat kandidaten in een zo fysiologische context als mogelijk nauwkeurig worden beoordeeld. Naar dit eind, gebruiken wij in lopende studies een gen het richten benadering om een subset van deze phosphorylation plaatsen in de endogene genen te muteren om hun fysiologische betekenis te bestuderen.