Schimmelinfectie host

Filamenteuze schimmels kunnen dienen als gastheer voor een microbiële karmijnzuur de cel als fabriek als ze de capaciteit voor het leveren van een ruim aanbod van acetyl-CoA en malonyl-CoA bouwstenen voor de synthese van de polyketide steiger. Zij bieden ook de noodzakelijke cellulaire infrastructuur aan om het er-membraangebonden C-glucosyltransferase UGT28 op te nemen. Aangezien A. nidulans over een goed ontwikkelde genetische manipulatie toolbox beschikt, hebben we deze soort gekozen als uitgangspunt voor de ontwikkeling van een schimmel-karmijnzuurcelfabriek. Zoals de meeste filamenteuze schimmels, kan A. nidulans een overvloed aan biosynthetisch diverse secundaire metabolites met inbegrip van een significant aantal aromatische polyketiden produceren. Chiang et al. hebben eerder aangetoond dat de deletie van de genclusters die verantwoordelijk zijn voor de vorming van de belangrijkste endogene PKS-producten in A. nidulans11, het potentieel van A. nidulans als celfabriek voor heterologe productie van polyketiden verbeterde. Op deze manier worden de pools van acetyl-CoA en malonyl-CoA bouwstenen verhoogd en worden de daaropvolgende chemische analyses voor de vorming van nieuwe producten vereenvoudigd. Als eerste stap op weg naar een schimmelcelfabriek voor de productie van karmijnzuur, hebben we daarom de biosynthetische routes geëlimineerd voor de dominante aromatische polyketiden die mogelijk de productie van karmijnzuur zouden kunnen verstoren en de analyse en downstream zuivering zouden kunnen bemoeilijken. Specifiek, werden de genclusters voor productie van asperthecin, monodictyphenon, en sterigmatocystine geëlimineerd evenals de genen verantwoordelijk voor groene conidia pigmentvorming, wA en yA, werden geëlimineerd in een niet-homologe endjoining devoldoende A. nidulans achtergrond. Naast het verwachte gebrek aan conidiale pigmenten vertoonde de resulterende stam, NID2252, geen zichtbare effecten op morfologie en fitness (aanvullend dossier, Fig. 1). Daarom hebben wij NID2252 gebruikt als referentiestam en als basis voor de bouw van een schimmelcelfabriek voor de productie van karmijnzuur.

ontwerp van een semi-natuurlijke route voor flavokermesic acid anthron formation

de belangrijkste wegblokkade voor de bouw van een microbiële karmijnzuurcelfabriek was het ontbreken van een natuurlijke PKS die flavokermesic acid anthron, het eerste vermeende tussenproduct in de route, synthetiseert. Om deze beperking te omzeilen, hebben we een alternatieve biosynthetische route gevolgd voor de productie van deze polyketide. Het octaketide flavokermesic zuur anthron, met zijn C7-C12, C5-C14 en C2-C15 cyclisatiepatroon, zou in theorie in één stap kunnen worden gevormd door een schimmel niet-reducerende type I iteratieve PKS die een geschikt product template domein bezit (Fig. 1 links). Dergelijke enzymen zijn echter nog niet beschreven in de literatuur. Een alternatief mechanisme voor het vormen van de flavokermesic zuur anthron is via een twee-staps reactie waarbij een PKS synthetiseert een niet-gereduceerde lineaire octaketide keten, die vervolgens wordt gecycliseerd in de gewenste structuur door trans-acting cyclases/aromatases (Fig. 1 rechts). Reacties van dit type bestaan in de natuur in b.v. de actinorhodin (Act) route in Streptomyces coelicolor12. In dit geval wordt de octaketide backbone gesynthetiseerd door een multi-subunit bacteriële type II PKS-systeem, KSa, KSß en ACP (de act minimal PKS), die wordt verminderd door actKR op positie C9 en vervolgens gevouwen door de aromatase/cyclase, actARO/CYC en cyclase actCYC2, om de tricyclische verbinding 3,8-dihydroxy-1-methylantrachinon-2-carboxylzuur (DMAC)7. DMAC toont dezelfde vouw als flavokermesic zuur anthrone maar wordt verminderd op de C9 positie.

van bijzonder belang voor dit onderzoek zijn de ZhuI cyclase en zhuj aromatase van Streptomyces sp. R1128, die twee opeenvolgende cyclisatiereacties van niet-gereduceerde lineaire polyketiden katalyseren in plooien gelijkend op die van flavokermesinezuur en tronen13. Specifiek, is de Zhui cyclase verantwoordelijk voor het sluiten van de eerste ring, C7-C12, en de zhuj aromatase voor het sluiten van de tweede ring, C5-C14. De derde ring, C2-C15, wordt spontaan gevormd. ZhuI en ZhuJ zijn eerder samen tot uitdrukking gebracht in S. coelicolor met de octaketide vormende type II act minimale PKS resulterend in de vorming van flavokermesic zuur, bekend als 3,6,8-trihydroxy-1-methylanthrachinone-2-carboxylzuur (TMAC) in de bacteriële literature14. Helaas kan een identieke strategie moeilijk te implementeren zijn bij A. nidulans, aangezien de type II minimale PKSs niet succesvol zijn geïmplementeerd in heterologe gastheren buiten het Streptomyces genus ondanks verschillende pogingen15. En inderdaad, onze pogingen om de act miniPKS in A. nidulans en Saccharomyces cerevisiae te reconstitueren bleken eveneens niet succesvol (gegevens niet getoond). Een alternatieve manier om de vereiste niet-gereduceerde octaketide te vormen, is het gebruik van PKS-enzymen van type III, die met succes in gist tot expressie zijn gebracht, bijvoorbeeld in verband met flavonoïde biosynthese16. Van bijzonder belang is de aloë arborescens octaketide synthase( OKS), waarvan is beschreven dat het niet-gereduceerde octaketiden produceert die spontaan in SEK4 en SEK4b vouwen in vitro17 (Fig. 2 bis). In Aspergillus is echter niet getest of de producten van type III PKSs, die ACS-onafhankelijke enzymen zijn die carbonzuren afgeven, kunnen worden gevouwen door het Zhui-type cyclase waarvan is beschreven dat het werkt op aan ACS gebonden substraten. In de huidige studie hebben we daarom de Verenigbaarheid van de plant Type III OKS met die van cyclasen/aromatasen uit bacteriële type II PKS-systemen getest, met het doel een kunstmatige de novo biosynthetische route te ontwikkelen voor de vorming van de flavokermesic acid anthron precursor voor de vorming van karmijnzuur.

de Productie van polyketide voor het vervaardigen van karmijnzuur productie in A. nidulans

Om het testen van de in vivo de performance van OKS in een schimmel gastheer, we geplaatst OKS gecontroleerd door de A. nidulans gpdA promotor in een enkel exemplaar in een bepaalde locus (integratie plaats 5, IS5) in de A. nidulans genome18. Er werden twee stammen geconstrueerd, één die de oorspronkelijke OKS-codeervolgorde uitdrukt en één die een codon geoptimaliseerde versie uitdrukt voor expressie in A. nidulans. Na zeven dagen incubatie op vaste groeimedia, zie de sectie methoden voor details, vertoonden beide stammen een sterke roodbruine kleuring van het mycelium (Fig. 2b). Metabole profilering door HPLC-HRMS van de stammen onthulde geen sporen van een niet-gereduceerd octaketide, maar eerder de verwachte SEK4 en SEK4b samen met flavokermesic zuur en drie andere overvloedige verbindingen met onbekende identiteit (Fig. 2c), die niet aanwezig waren in de nid2252 referentiestam. SEK4 en SEK4b werden geïdentificeerd op basis van grondige HPLC-HRMS/MS-analyse( aanvullend bestand, Fig. 2) en was in overeenstemming met eerder gerapporteerde waarden19, terwijl flavokermesinezuur werd vergeleken met een authentieke referentie geïsoleerd uit D. coccus9 (aanvullend dossier, Fig. 3). De metaboliet eluteren bij 13,0 min. had een pseudomoleculair ion + van m / z 303.0867, overeenkomend met een moleculaire formule van C16H14O6, consistent met het bekende octaketide shunt product mutactine, eerder beschreven in Streptomyces gebaseerde experimenten met de Act gen cluster7. Deze identificatie werd bevestigd door gedetailleerde analyse van het UV-spectrum, en ondersteund door de retentietijd ten opzichte van SEK4 en SEK4b (aanvullend bestand, Fig. 4). De twee extra metabolieten met moleculaire formules van C16H12O6 (- m/z 299.0566) duidden op octaketideproducten, maar kwamen niet overeen met een gemeenschappelijk shuntproduct (aanvullend dossier, Fig. 5). Vandaar dat de metabolieten werden geïsoleerd en structuur opheldering op basis van 1D en 2D NMR experimenten identificeerde hen als dehydro-SEK4 (ook bekend als B26 in de bacteriële literatuur) en dehydro-SEK4b20 (aanvullend dossier, Fig.6-11). Vorming van de zes nieuwe polyketiden waargenomen in de OKS-stam kan worden verklaard door drie verschillende spontane eerste ringsluitingsreacties: C7-C12 (SEK4, dehydro-SEK4 en flavokermesinezuur), C10-C15 (SEK4b en dehydro-SEK4b) en C7-C12 na C9 ketonreductie (mutactine) (Fig. 2a en aanvullend dossier, Fig. 12). Hiervan maakt alleen het eerste type ringsluiting (C7-C12) de daaropvolgende vorming van het gewenste flavokermesic zuur anthron mogelijk via een tweede C5-C14 en derde C2-C15 ringsluiting. Van SEK4 en SEK4b is eerder gemeld dat ze spontaan uitdrogen tot respectievelijk dehydro-SEK4 en dehydro-SEK4b, terwijl de vorming van mutactine afhankelijk is van enzymatische reductie van de C9-positie van de polyketideketen voorafgaand aan het vouwen21. De vorming van flavokermesinezuur, een bekend tussenproduct in de karmijnzuurweg (Fig. 1), was onverwacht omdat niet is gemeld dat deze metaboliet spontaan ontstaat uit niet-gereduceerde octaketideketens. Dit suggereert dat A. nidulans van nature een aantal cyclasen/aromatasen produceert die het gewenste vouwpatroon bevorderen. De metabolite profilering van de twee OKS expresserende stammen toonde geen wezenlijke verschillen in productieniveaus en we besloten ons te concentreren op de stam die de inheemse versie van OKS uitdrukt als basis voor verdere ontwikkelingen van een schimmelcelfabriek voor de productie van karmijnzuur.

Engineering the folding pathway of non-reduced octaketides

promiscue folding of the non-reduced octaketide reduceert de opbrengst van wenselijk flavokermesic acid. We hadden daarom voor ogen dat de productie van flavokermesinezuur zou kunnen worden verhoogd door het vouwproces in de gewenste richting te stroomlijnen door codon geoptimaliseerde versies van ZhuI en ZhuJ uit te drukken. Om te onderzoeken of ZhuI en ZhuJ interfereren met het inheemse metabolisme van A. nidulans, construeerden we eerst stammen die ZhuI en ZhuJ individueel en in combinatie uit gedefinieerde genomische loci (IS6 en IS7) in de A. nidulans nid2252 referentiestam. Metabole profilering door HPLC-HRMS van de drie stammen onthulde geen detecteerbare metabole verschillen (Fig. 3b). Vervolgens construeerden we een stam die OKS met ZhuI codeert, die de cyclasen codeert die de vorming van de C7-C12 eerste ringsluiting katalyseert (Fig. 3a). In vergelijking met de stam die alleen OKS uitdrukt, vertoonde deze stam een 2,5-, 2,2-en 2,1-voudige toename van respectievelijk de flavokermesinezuur -, SEK4-en dehydro-SEK4-spiegels. In overeenstemming met ZhuI begeleiden vouwen in de gewenste richting, deze metabole veranderingen gingen gepaard met verminderde niveaus van metabolieten die de ongewenste eerste ring plooien (Fig. 3b en Tabel 1). Een stam die OKS en ZhuJ mede uitdrukt, die codeert voor de aromatasen die de C5-C14 tweede ringsluiting katalyseren (Fig. 3a), leidde tot een 2,7-voudige toename van de flavokermesic zuurspiegels. Deze toename ging gepaard met een verlaging van de concentraties metabolieten met een eerste ringvouw van C7-C12 (SEK4 en dehydro-SEK4), terwijl, zoals verwacht, het niveau van metabolieten met de ongewenste eerste ringvouw van C10-C15 (SEK4b en dehydro-SEK4b) niet werd beïnvloed (Fig. 3b en Tabel 1). Ten slotte toonde de analyse van de stam die ZhuI, ZhuJ en OKS uitdrukte een 4,1-voudige toename in de productie van flavokermesinezuur in vergelijking met wanneer alleen OKS werd uitgedrukt. Bovendien is deze toename 60% hoger dan wat werd waargenomen bij de stammen die OKS tot expressie brengen in combinatie met respectievelijk ZhuI of ZhuJ (Tabel 1). Dit resultaat geeft aan dat de cyclase en aromatase, op een additieve manier, in staat zijn om de flux in de kunstmatige de novo route naar het gewenste product, flavokermesic zuur (Fig. 3b).

verrassend en zeer bemoedigend bleek uit verdere metabole analyse van de stam die OKS, ZhuI en ZhuJ mede uitdrukt dat de verhoogde vorming van flavokermesic acid gepaard ging met de productie van kermesic acid (Fig. 4). Vandaar A. nidulans levert de noodzakelijke mono-oxygenase voor het omzetten van flavokermesinezuur in kermesinezuur, dat kan dienen als het laatste tussenproduct in de karmijnzuurroute (Fig. 1).

productie van karmijnzuur in A. nidulanen

de laatste stap in de vorming van karmijnzuur bestaat uit C-glucosylering van kermesinezuur (Fig. 5a). Het enzym dat verantwoordelijk is voor deze stap in de biosynthetische route van karmijnzuur is eerder geïdentificeerd in D. coccus en gekarakteriseerd door heterologe expressie in S. cerevisiae8. Daarom hebben we het UGT2-coderingsgen, geoptimaliseerd voor expressie in A. nidulans, ingebracht in de is4-locus van de nid2252 referentiestam, en om de semi-natuurlijke biosynthetische route van karmijnzuur in A. nidulans te voltooien, in dezelfde locus in de stam die ZhuI, ZhuJ en OKS mede uitdrukt. De expressie van UGT2 alleen in de referentiestam had geen invloed op het uiterlijk van de kleur van het groeimedium, noch op het metabole profiel van A. nidulans in vergelijking met de nid2252 referentiestam (Fig. 5b, c). In tegenstelling, co-expressie van OKS, ZhuI, ZhuJ, en UGT2 gaf aanleiding tot een rode kleuring van het medium, wat suggereert dat een meer wateroplosbare kleurstof (s) werd gevormd (Fig. 5b). Gerichte LC-HRMS-analyse van deze stam bevestigde de vorming van karmijnzuur22 (aanvullend dossier, Fig. 13), samen met dcII9, 23 en een dcii-isomeer (aanvullend bestand, Fig. 14), waaruit blijkt dat UGT2 functioneel was in A. nidulans en kon met succes de biosynthetische weg voltooien (Fig. 5c). De positieve identificatie van karmijnzuur en dcII was gebaseerd op gelijkaardige retentietijden, UV-spectra, ms en MS/MS fragmentatiepatronen voor zuivere normen van de twee samenstellingen. Drie isomeren van karmijnzuur zijn in de literatuur beschreven (karmijnzuur, DCIV en DCVII) door Stathopoulou et al.23, alle drie tonen verschillende behoudtijden in LC-MS/MS gebaseerde analyse. In onze Analyse ontdekten we alleen karmijnzuur en niet DCIV en DCVII op basis van retentietijd en fragmentatiepatroon van authentieke karmijnzuurstandaard geïsoleerd uit D. coccus (aanvullend bestand, Fig. 13). Samen tonen onze gegevens duidelijk aan dat het mogelijk is om karmijnzuur te produceren in A. nidulans op basis van een semi-natuurlijke route.