resultaten

modulatie van cellulaire P107 niveaus door middel van gecontroleerde proteolyse. We hebben eerder aangetoond dat de endogene p107, een lid van het RB familie van eiwitten, die niet een natuurlijk substraat van SCFßTrCP, kunnen worden geëlimineerd in de C33A baarmoederkankercellen door de buitenbaarmoederlijke expressie van een chimerisch ßTrCP eiwitdegradatie–eiwit ligase (ßTrCP-E7N) die draagt een p107-bindende peptiden zijn afgeleid van de N-terminal 35-aa residuen van de HPV-oncoprotein, E7 (E7N) (1). Nochtans, worden de functies van vele cellulaire proteã nen gedicteerd door hun intracellular overvloed, en niet eenvoudig door hun aanwezigheid of afwezigheid. Tot nu toe, is er geen betrouwbare methode geweest om de intracellular eiwitniveaus in zoogdiercellen precies te moduleren.

eerst werd onderzocht of P107 niveaus systematisch konden worden verlaagd door gecontroleerde expressie van verschillende hoeveelheden ßTrCP-E7N. de humane c33a cervicale carcinoomcellen werden geïnfecteerd met toenemende doses recombinant adenovirus die ßTrCP-E7N dragen of het controleadenovirus gedurende 24 uur. De besmetting was 100%, zelfs bij de laagste gebruikte dosis, zoals beoordeeld door de uitdrukking van GFP die door adenovirus in alle ontvangende cellen wordt gedragen (getoonde gegevens niet). Zoals in Fig. 1 (Bovenste), werden de endogene P107-spiegels systematisch verlaagd tot 78%, 25% en 5% van de steady-state-spiegels wanneer C33A-cellen werden omgezet met recombinant ßTrCP-E7N adenovirus bij mois van 10, 35 en 80, maar niet dezelfde doses Ad1-controlevirus. Daarom biedt de gebouwde SCFßTrCP-BP een eenvoudige en reproduceerbare manier aan om de totale hoeveelheden doelproteã nen op bepaalde niveaus te verminderen voor het testen van de doseringseffecten op biologische activiteiten.

P107 associeert stabiel met cycline A en Cdk2 via een bindingsplaats met hoge affiniteit in prolifererende cellen (13-15). Om te onderzoeken of deze P107-geassocieerde proteã nen ook aan gerichte degradatie door ßTrCP-E7N worden onderworpen, werd immunoblotting uitgevoerd in c33a cellen die door het AD-F-TrCP-E7N virus worden besmet. Zoals in Fig. 1, de endogene cyclin A en Cdk2 niveaus bleven ongewijzigd, terwijl p107 dramatisch down-geregeld was. Bovendien werden de niveaus van niet-gerichte β-actine niet beïnvloed door F-TrCP-E7N (Fig. 1). Dit resultaat verstrekte sterk bewijsmateriaal dat de gebouwde ßTrCP-E7N ubiquitin–eiwit ligase specifiek gericht substraat P107 afbreekt, maar niet zijn geassocieerde proteã nen.

selectieve afbraak van een specifieke Posttranslationeel gemodificeerde subpopulatie van doeleiwit. De wijziging van een cellulaire proteã NE op posttranslational niveau, zoals phosphorylation, is een fundamenteel middelencellen gebruiken om de functie te regelen of nieuwe activiteiten van de proteã ne te verlenen. Experimentele instrumenten om de functie geassocieerd met een specifieke posttranslationele modificatiegebeurtenis te ontleden zijn momenteel beperkt. Omdat het eiwit knockout op het posttranslationele niveau werkt dat doelproteã nen direct erkent, is één toepassing om een specifieke E3 te engineeren die een subpopulatie van posttranslationeel gewijzigde proteã nen voor degradatie kan selecteren, in plaats van de volledige bevolking te vernietigen.

HPV16 E7 bleek selectief te binden aan de hypofosforyleerde vorm van RB (16). We onderzochten of de chimerische ßTrCP-E7N ubiquitine-eiwit ligase hypo – en hyperfosforylated RB kon onderscheiden en alleen de hypoform voor degradatie kon selecteren. De menselijke cellen van het u2os osteosarcoom drukken beide vormen van RB uit die gemakkelijk kunnen worden geà dentificeerd, gebaseerd op hun verschillende elektroforetische mobiliteit op SDS/pagina (Fig. 2A, rijstrook 1) (17). De identiteit van deze twee RB species werd verder geverifieerd door immunoblotting met behulp van antilichamen specifiek voor hypo – of hyperfosforylated vormen van RB (Fig. 2A, rijstroken 2 en 3). U2os cellen werden geïnfecteerd met de recombinant Ad-F-TrCP-E7N of de controle Ad1 adenovirussen gedurende 48 uur, en de steady-state niveaus van RB-P en RB werden gelijktijdig geanalyseerd door Western blotting, met behulp van een anti-RB monoklonaal antilichaam dat beide vormen herkent. In overeenstemming met de preferentiële binding van E7N aan hypofosforylated RB, resulteerde de ectopische expressie van F-TrCP-E7N in de eliminatie van hypofosforylated RB, terwijl de hyperfosforylated RB-P intact bleef (Fig. 2B bovenste, vergelijk rijstroken 4-6 met rijstroken 1-3). Dit resultaat benadrukt het vermogen van gebouwde F-TrCP-E7N ubiquitin-eiwit ligase in het selecteren van een specifieke subpopulatie van RB voor degradatie, die op de status van bepaalde posttranslational wijziging van de doelproteã ne werd gebaseerd.

Full-length HPV16 E7 kon interageren met de cycline-afhankelijke kinaseremmers p21Waf1 en p27Kip1, maar het bindingsdomein werd toegewezen aan het C-terminaldomein (residuen 40-98), in plaats van het E7N-fragment (residuen 18-20). Om de specificiteit van F-TrCP-E7N verder te onderzoeken, werden dezelfde u2os-celextracten ook onderzocht met antilichamen tegen p21Waf1 en p27Kip1. Zoals te zien in Fig. 2B (Midden) bleven de steady-state niveaus van p21Waf1 en p27Kip1 onveranderd. Samen genomen, demonstreerden de gebouwde F-TrCP-E7N proteolytische specificiteit naar de RB-familieproteã nen, maar niet andere regelgevers van de cel-cyclus zoals Cdk2, cyclin a, p21Waf1, en p27Kip1.

Structuurgebaseerde mutagenese om een zeer specifieke ßTrCP-E7N ubiquitine–Eiwitligase te genereren. De chimerische ßTrCP-E7N is nog steeds in staat om de endogene ßTrCP-substraten te binden, waaronder IkB, β-catenin en ATF4 (3-7). Overexpressie van ßTrCP-E7N kan de afbraak van deze inheemse substraten verstoren. Omgekeerd kan de binding van het endogene substraat aan ßTrCP-E7N de juiste positionering van het beoogde substraat verstoren om ubiquitin van ubiquitin-conjugating enzym te accepteren, en daarom de efficiëntie van gerichte afbraak verminderen (Fig. 3AUpper). Voorts interageert ßTrCP met een pseudo substraat hnRNP-U, dat ßTrCP en zijn derivaten in de kern bindt en hun interactie met de substraten verhindert (21). Door specifieke mutaties van de aminozuurresiduen op ßTrCP in te voeren om de binding ervan aan β-catenine, IkB of hnRNP-U te elimineren, verwachten we niet alleen de specificiteit te verbeteren, maar ook de beschikbaarheid van het geconstrueerde ßTrCP-E7N om het beoogde substraat te rekruteren (Fig. 3ALower).

het substraatbindend domein van ßTrCP bevat zeven WD40-herhalingen in het C-eindgebied, die zich vouwen in de typische zevenbladige β-propellerstructuur die bewaard wordt onder WD40-eiwitten (3-7). Omdat de Algemene integriteit van de β-propellerstructuur van WD40-eiwitten van cruciaal belang is voor hun functies, zal standaard deletie mutagenese-benadering waarschijnlijk Grove structurele veranderingen veroorzaken, en is dus niet van toepassing voor het definiëren van substraatbindingsplaatsen op ßTrCP. Nochtans, kan de bekende kristalstructuur van de proteã nen WD40 worden geëxploiteerd om oppervlakteresidu ‘ s te identificeren betrokken bij het binden van ßTrCP substraten. Een op structuur gebaseerde mutagenese-benadering werd ontworpen om vijf positief geladen residuen (R285, K365, R474, R521 en R524) te identificeren en te muteren, waarvan wordt verwacht dat ze zich op het bovenoppervlak van de WD40 β-propeller bevinden, die betrokken zijn bij de binding aan WD40-geassocieerde eiwitten (Fig. 3B) (22). Deze aanpak is nader uitgewerkt in ondersteunende methoden, die als ondersteunende informatie op de website van de PNAS worden gepubliceerd. Zie ook Fig. 6, die als ondersteunende informatie op de PNAS-website wordt gepubliceerd. Bovendien zullen substituties van deze Lys/Arg residu ‘ s waarschijnlijk de totale ßTrCP structuur niet veranderen.

door gebruik te maken van de QuikChange multisite-directed mutagenesis kit (Stratagene) hebben we deze residuen gelijktijdig gemuteerd tot Glu. Deze “FLAG-tagged compound mutant”, aangeduid als F-TrCP(m1) – E7N, werd getest op zijn binding aan zowel de endogene (IkB) als de beoogde (p107) knockout targets. HeLa-cellen werden tijdelijk getransfecteerd met F-TrCP (m1)-E7N of F-TrCP-E7N, en hun interacties met IkB en p107 werden bepaald door coimmunoprecipitation. F-TrCP-E7N en F-TrCP vertoonden vergelijkbare affiniteiten met het gefosforyleerde IKB-eiwit, terwijl de mutaties van de samenstelling m1 de F-TrCP(m1)-E7N-binding afschaften (Fig. 3c Midden). In tegenstelling, werden vergelijkbare niveaus van p107 ontdekt in de immunocomplexen van F-TrCP-E7N of F-TrCP (m1) – E7N (Fig. 3c lager), die erop wijzen dat de gebouwde F-TrCP(m1)–E7N ubiquitin-eiwit ligase volledig functioneel is in het werven van de beoogde cellulaire doelen. Deze resultaten stemmen overeen met de structurele voorspellingen in Fig. 3B, en definieer verder de aminozuurresiduen op ßTrCP kritisch voor endogene substraatherkenning.

het geconstrueerde F-TrCP (m1)-E7N werd verder geanalyseerd op zijn potentie bij het afbreken van endogeen p107. C33A cellen werden gecombineerd met F-TrCP, F-TrCP-E7N of F-TrCP (m1)-E7N, samen met een CD19 expressie plasmide. Achtenveertig uren na transfectie, werden de cellen geoogst en verrijkt voor die die de transfected plasmiden ontvangen door de immunomagnetische parels te gebruiken die aan het anti-CD19 monoclonal antilichaam worden geconjugeerd. Endogene P107 spiegels werden vervolgens bepaald door immunoblotting. Zoals in Fig. 3D, ectopische expressie van F-TrCP (m1)-E7N resulteerde in een 95% reductie van endogene P107 spiegels, terwijl een 82% down-regulatie van p107 werd waargenomen voor F-TrCP-E7N (Fig. 3D bovenste, vergelijk rijstroken 4 en 3). Bovendien had de expressie van F-TrCP(m1)-E7N geen waarneembaar effect op de tumor necrosis factor (TNF)-α geïnduceerde afbraak van IkB door de inheemse SCFßTrCP, of op de vernietiging van p27kip1 door de scfskp2 ubiquitine–eiwit ligasen (gegevens niet getoond). Daarom interfereert ectopische expressie van de geconstrueerde F-TrCP(m1)-E7N niet met de totale SCF-ubiquitinatieactiviteit door de kern-SCF-componenten (Skp1, CUL-1 en Rbx1/Roc1) die gedeeld worden door de endogene F-box-eiwitten te squelchen.

gerichte P107-afbraak werd verder beoordeeld in individuele c33a-cellen door middel van een indirecte immunofluorescentietest. Consistent werd p107 grotendeels uitgeroeid in c33a-cellen die F-TrCP-E7N of F-TrCP(m1)-E7N uitdrukken, maar niet alleen F-TrCP (Fig. 3E). Collectief, wijzen deze resultaten erop dat door het elimineren van de bindende plaatsen van de endogene ßTrCP substraten, de gebouwde F-TrCP(m1)-E7N ubiquitin–eiwit ligase verhoogde specificiteit en robuuste proteolytic activiteit naar het beoogde doel toonde.

minimaal bindend domein als Targeting Peptide voor efficiënte Substraatwerving. Om een hoge specificiteit van substraatwerving te bereiken en niet-specifieke targeting van andere cellulaire eiwitten te minimaliseren, hebben we getest of het minimale P107/RB-interactiedomein van E7N (aangewezen E7m), dat residuen 21-29 van E7 omvat die het lxcxe-motief overspannen (23), efficiënte binding en afbraak van p107 kon bereiken. Een chimerische ubiquitin-eiwit ligase werd geconstrueerd waarin ßTrCP en E7m covalent met elkaar verbonden werden door een flexibele 20-aa-afstandhouder die uit 10 exemplaren van gly-Ser herhalingen wordt samengesteld (aangewezen 10GS). De F-TrCP-E7N of F-TrCP-10GS-E7m werden tijdelijk getransfecteerd in c33a cellen, en hun binding aan de endogene p107 werd beoordeeld door immunoprecipitatie in extracten bereid na behandeling met de proteasoomremmer MG132 om degradatie als gevolg van deze interactie te remmen. Zoals in Fig. 4A (rijstroken 2 en 3), had F-TrCP-10GS-E7m lichtjes verhoogde affiniteit aan p107 dan dat van originele f-TrCP-E7N. F-TrCP-E7N en F-TrCP-10GS-E7M werden verder geëvalueerd voor hun efficiency in P107 degradatie door voorbijgaande transfectie in c33a cellen zoals in Fig. 3D. zoals weergegeven in Fig. 4B, F-TrCP-E7N en F-TrCP-10GS-E7m induceerden tot 92% en 95% down-regulatie van p107, wat erop wijst dat de geconstrueerde ßTrCP die het minimale P107-bindende domein draagt zo efficiënt functioneert als de originele F-TrCP-E7N in degraderende doeleiwitten.

Retroviral-Mediated Delivery of the Engineered ßTrCP for Sustained Degradation of Endogen Targets. Vervolgens onderzochten wij of de gebouwde ubiquitin-eiwit ligases stabiel konden worden uitgedrukt om duurzame degradatie van het beoogde doel te bereiken. De HL-60 promyelocytic leukemiecellen werden getransduceerd met de recombinante retrovirussen die PBMN-GFP, F-TrCP(m1)-E7N, of de controle F-TrCP-E7N(ΔDLYC) uitdrukken, waarbij de RB/p107-bindingsplaats werd verwijderd (1). De besmette cellen met chromosomaal geïntegreerde chimerische F-TrCP transgenen werden geà soleerd door FACS Sorteren, gebaseerd op de uitdrukking van GFP van de virussen, en degradatie van endogene P107 werd beoordeeld van besmette HL-60 cellen of onmiddellijk na besmetting (Fig. 5A), of na 3 maanden kweek in groeimedium (Fig. 5B). Verder, omdat twee andere leden van de RB familie eiwitten, RB en p130, ook tot expressie komen in HL-60 cellen, hebben we onderzocht of één enkele F-TrCP-E7N gelijktijdig degradatie kan richten van de gehele RB familie van eiwitten die interageren met hetzelfde lxcxe motief van E7N. ectopische expressie van retroviraal transduced F-TrCP-E7N veroorzaakte dramatische down-regulatie van de hypofosforylated vorm van RB, evenals p107 (Fig. 5A) en p130 (gegevens niet getoond) in HL-60 cellen, hetzij onmiddellijk na infectie en FACS Sorteren (Fig. 5A), of 3 maanden na infectie en continue kweek (Fig. 5B, rijstrook 3). In tegenstelling, had de stabiele uitdrukking van F-TrCP-E7N(ΔDLYC) in HL-60 cellen geen effect op het veranderen van p107, RB (Fig. 5A, rijstrook 3), en P130 niveaus (gegevens niet weergegeven). In overeenstemming met de observatie dat f-TrCP-E7N bij voorkeur hypofosforyleerde RB in u2os-cellen afbreekt (Fig. 2), vermindering van hyperfosforylated RB species door stabiele expressie van F-TrCP-E7N was minder uitgesproken, vergeleken met die van de hypofosforylated vorm in HL-60 cellen (Fig. 5A, vergelijk rijstrook 2 van pRB en pRB-P).

bij behandeling met all-trans retinoic acid (ATRA) verlaten HL-60 cellen de celcyclus en ondergaan terminale differentiatie. Er werd een accumulatie van hypofosforyleerde RB waargenomen, die eerder bijdroeg aan atra-geïnduceerde groeistilstand, terwijl de hyperfosforyleerde RB niet detecteerbaar was (24, 25). Om te onderzoeken of de scfßtrcp-machines ook kunnen worden gebruikt tijdens het verlaten van de celcyclus, werden HL-60-cellen die F-TrCP-E7N of F-TrCP(m1) – E7N stabiel uitdrukken behandeld met 1 µM ATRA gedurende 72 uur, en degradatie van de RB-familieproteïnen geëvalueerd. HL-60 cellen die stabiel F-TrCP-E7N uitdrukken resulteerden in 95%, 98%, en 85% daling van RB, p107, en p130 niveaus respectievelijk, vergeleken met cellen die met het controlepbmn-GFP virus worden besmet (Fig. 5B, rijstrook 2). Omdat ATRA ook transcriptie van genen onder de controle van Moloney murine leukemia virus LTR van pBMN-GFP activeert (26), droeg de verhoogde uitdrukking van F-TrCP-E7N op atra behandeling waarschijnlijk verder bij aan de efficiënte down-verordening van p107, p130, en hypofosforylated RB (Fig. 5B).

het effect van de eiwitten van de RB-familie op de normale progressie van de celcyclus is onderzocht in fibroblasten van muizenembryo ‘ s met verstoringen in de genen RB, p107 en p130, en bleek niet te reageren op signalen die G1-arrestatie induceren, zoals het terugtrekken van groeifactoren of DNA-schade (27, 28). Nochtans, zijn de collectieve gevolgen van de familieleden van RB in tumorcelproliferatie niet bestudeerd, wegens het gebrek aan efficiënte omgekeerde genetische hulpmiddelen. De stabiele HL-60 cellen die F-TrCP(m1)-E7N uitdrukken uit deze studie lieten ons toe om te beoordelen hoe tumorcellen deficiënt zijn voor alle drie de RB-familieproteã nen reageerden op G1-arrestatiesignalen. In exponentieel groeiende HL-60 cellen die F-TrCP(m1)-E7N uitdrukken die constitutieve degradatie van de RB-familieproteã nen induceerden, werd een duidelijke versnelling van cel-cyclusvooruitgang waargenomen in vergelijking met die die door het controlepbmn-GFP-virus worden geïnfecteerd (Fig. 5C links). Dit resultaat is consistent met de verminderde controle van G1–S– overgangen waargenomen bij RB–/–, P107–/– en P130–/ – drievoudige knockoutmuis embryo-fibroblasten (27, 28).

atra behandeling remde G1-naar-S-fase overgang in HL-60 cellen geïnfecteerd door de controle pBMN-GFP (Fig. 5C) of F-TrCP-E7N(ΔDLYC) virus (gegevens niet weergegeven), wat overeenkomt met wat is gemeld voor niet-geïnfecteerde HL-60 cellen (Fig. 5C) (24). Een initiële vertraging in de G1–S overgang werd ook waargenomen in pBMN-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 cellen op 48 uur na ATRA. Echter, een volledige G1 arrestatie kon niet worden bereikt in de latere fase (72-96 h) en cellen Voortgezet de loop van de cel-cyclus progressie (Fig. 5C). In tegenstelling, werden de controle pBMN-GFP/HL-60 cellen allen geblokkeerd in G1 tussen 72 en 96 h. deze waarnemingen suggereren dat F-TrCP(m1)-E7N-bemiddelde degradatie van RB–familieleden een late atra-reactiegebeurtenis belemmert noodzakelijk voor voltooiing van de groeistop, terwijl de vroege verzwakking van G1-s vooruitgang grotendeels onaangetast was. Verder werd een dramatische afname van het aantal cellen waargenomen tussen 72 en 96 uur post-ATRA behandeling als gevolg van massale celdood tijdens atra-geïnduceerde celcyclus exit en differentiatie (29). Opvallend genoeg vertoonden HL-60-cellen met F-TrCP(m1) – E7N een gemiddelde toename van 2 tot 3 maal in de subg1-populaties in vergelijking met die van met het controlevirus geïnfecteerde HL-60– cellen (gegevens niet getoond), wat overeenkomt met de verhoogde celdood in RB–/–, p107–/– en P130–/-drievoudige knockoutmuis embryonale fibroblastcellen onder groeiremmende omstandigheden (28). Collectief, veroorzaakte de constitutieve uitdrukking van F-TrCP (m1)-E7N down-regulatie van de volledige proteã nen van de RB familie, die tot een remming van de groeistop en een verhoging van celdood op behandeling ATRA leidt.

atra-geïnduceerde G1-arrestatie impliceert de gecoördineerde regulering van meerdere cellulaire signalen/componenten die de celcyclus negatief regelen (beoordeeld in ref. 30). Dimberg et al. (31) rapporteerde dat ATRA een opeenvolging van gebeurtenissen in myeloid cellen teweegbrengt die een vroege verhoging van p21waf1 uitdrukking, stabilisatie van p27kip1, en, later, dephosphorylation van RB bij het begin van G1 arrestatie impliceren. Omdat ßTrCP(m1)-E7N alleen RB-familieleden afbreekt en geen effect heeft op de stabiliteit van p21waf1 en p27kip1, is het waarschijnlijk dat alleen de late, RB-afhankelijke atra-respons wordt beïnvloed, wat consistent is met de weerstand van pBMN-F–TrCP(m1) – E7N/HL-60 cellen om G1 arrestat72-96 h te voltooien (Fig. 5C). De waargenomen vroege groeiremming door ATRA na 48 uur (Fig. 5C) kan, ten minste gedeeltelijk, worden toegeschreven aan de up-regulatie van p21waf1 en p27kip1, waarvan de stabiliteit niet wordt beïnvloed door constitutieve F-TrCP(m1)-E7N expressie (Fig. 2 en 5).