bereiding van eiwitcomponenten voor reconstitutie

componenten van het E. coli-vertaalapparaat, met inbegrip van vertaalfactoren en aaRS, werden bereid zoals eerder beschreven 46. Bereiding van rnasep-componenten, M1 RNA en C5-eiwit werd ook bereid zoals eerder beschreven 29. We wijzigden het protocol voor het C5-eiwit door het te precipiteren met 80% verzadigd ammoniumsulfaat, en het op te lossen door dialyseren tegen buffer a (50 mM natriumacetaat pH 6.5, 5 mM EDTA, 0,25 M NaCl, en 7 mM 2-mercaptoethanol). Het resulterende precipitaat werd teruggewonnen door centrifugeren en opgelost door dialyseren tegen buffer B bestaande uit 50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 m ureum en 10 mM dithiothreitol (DTT). Opgeloste eiwitten werden toegepast op een 5 mL HiTrap SP HP kolom (#17115101, GE Healthcare, USA), gewassen met buffer B met 7 mM 2-mercaptoethanol als een substituut voor 10 mM DTT, en geëlueerd met een lineaire gradiënt van 100 mM tot 2 M NH4Cl in buffer B. Fracties die C5 eiwit werden geanalyseerd door SDS-PAGE, hersteld, dialyzed tegen buffer-D (50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 0,8 M NH4Cl, 10 mM MgCl2, 2 M ureum, 7 mM 2-mercaptoethanol)en dan wordt het verder dialyzed tegen buffer-D zonder ureum. De resulterende oplossingen werden geconcentreerd met een Amicon Ultra 3 kDa (#Ufc800324, Merck Millipore, USA) en gedialyseerd tegen buffer D zonder ureum dat 50% glycerol bevatte. De gezuiverde C5-proteã ne werd opgeslagen bij -30 °C. Wij merken op dat wij alle plasmiden op verzoeken kunnen delen.

bereiding van modificatieenzymen voor ivttrna ‘s

Modificatieenzymen voor ivttrna’ s werden als volgt bereid. E. coli-genen van TsaB, TsaC, TsaD, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE en GidA werden met behulp van geschikte primers uit het E. coli A19-genoom versterkt (aanvullende gegevens 5). Versterkte genen voor TsaC, TsaD, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE en GidA werden gekloond tot pET15b (#69661, Merck Millipore, USA) als kleine ubiquitin-like modifier (SUMO) protein-fusion proteins waar His-tag, SUMO proteins, en modificatieenzymen tandemly werden gerangschikt. Genen voor TsaB en TrmD werden gekloond in pET15b als his-tag fusieproteïne. Alle genen werden gekloond met Gibson assembly technique (#E2611, New England Biolabs, USA). Resulterende plasmiden werden omgezet in een E. coli bl21(DE3) stam en gekweekt in 1 L LB medium tot een OD660 van 0,6–1,0 bij 37 °C. Overexpressie werd veroorzaakt door de toevoeging van IPTG aan een eindconcentratie van 1 mM voor TsaB, TsaC, TsaD, TsaE en TrmD, of 0,1 mM voor GlyA, Mnmc, MnmE en GidA. Na 3 uur kweek bij 37°C werden cellen geoogst. TsaB -, TsaC -, TsaE -, TrmD-en mnme-overexpressieve cellen werden geresuspendeerd in 40 mL Lysisbuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2 en 7 mM 2-mercaptoethanol) en verstoord door sonicatie. Resulterend lysaat werd gecentrifugeerd en het supernatant werd teruggewonnen en gemengd met 5 mL volledig his-tag Zuiveringshars (#05893801001, Roche, Zwitserland) gedurende 1 uur met rotator. De hars werd gewassen met 100 mL Lysis buffer en vervolgens werd het eiwit geëlueerd met 25 mL Elution buffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mM imidazol en 7 mM 2-mercaptoethanol). TsaB en TrmD werden geconcentreerd door Amicon Ultra 3 kDa (#Ufc800324, Merck Millipore, USA) en vervolgens gedialyseerd tegen Voorraadbuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 500 mM KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-mercaptoethanol en 30% glycerol). Ze werden flash bevroren met vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80°C. Voor TsaC, TsaE en MnmE werd Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) toegevoegd aan de teruggewonnen fracties tot een uiteindelijke concentratie van 23 µg/ml om het met his-tagged SUMO-eiwit te verwijderen. De fracties werden gedurende een nacht gedialyseerd tegen Splitsingsbuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl en 7 mM 2-mercaptoethanol), terwijl de Splitsingsbuffer 500 mM KCl bevatte voor mnme-bereiding. De gedialyseerde monsters werden opnieuw gemengd met 5 mL complete his-tag Zuiveringshars met rotator. Vervolgens werden de flow-through fracties die modificatieenzymen bevatten verzameld. De teruggewonnen monsters werden geconcentreerd door Amicon Ultra 3 kDa voor TsaE of Amicon Ultra 10 kDa (#Ufc901024, Merck Millipore, USA) voor TsaC en MnmE. Ze werden gedialyseerd tegen bouillon buffer, flash bevroren met vloeibare stikstof, en opgeslagen bij -80 °C. Voor GlyA preparaat, alle buffer bevat 10% Glycerol en de andere procedures waren hetzelfde als mnme preparaat. TsaD bleek onoplosbaar na sonicatie. Daarom werd het eiwit gepelleteerd door centrifugeren bij 20.400 × g bij 4 °C gedurende 45 minuten en werd het geresuspendeerd in Lysis-buffer aangevuld met 4% Triton X-100. De suspensie werd opnieuw gepelleteerd door centrifugeren bij 20.400 × g gedurende 45 minuten. De pellet werd opgelost met Lysis buffer aangevuld met 6 M ureum. De andere procedure was hetzelfde als mnme-preparaat, behalve dat alle buffers 2 M ureum bevatten. Voor mnmc voorbereiding, alle stappen tot verwijdering van zijn-tagged SUMO eiwit waren hetzelfde als GlyA voorbereiding. Omdat MnmC niet specifiek gebonden is aan de His-tag zuivering hars, werd de zuivering met anion-exchange chromatografie geselecteerd. De oplossing na Ulp1 behandeling werd gedialyseerd tegen IEX buffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, en 7 mM 2-mercaptoethanol) en vervolgens werden ze aangebracht op een 5 mL HiTrap Q HP kolom (#17115401, GE Healthcare, USA). De kolom werd gewassen met 25 mL IEX-buffer en vervolgens mnmc werd geëlueerd met een liner gradiënt van 100 mM tot 1 M KCl in IEX-buffer. Fracties die MnmC bevatten werden geconcentreerd door Amicon Ultra 30 kDa (#Ufc903024, Merck Millipore, USA), gedialyseerd tegen Voorraadbuffer, bevroren met vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80°C. We merken op dat we alle plasmiden op verzoeken kunnen delen.

bereiding van iVTtRNA

genen voor elke iVTtRNA (aanvullende gegevens 1) werden gekloond in de pgemex-1 vector (#P2211, Promega, USA) tussen xbai en BamHI restrictieplaatsen. Gebruikend de resulterende plasmiden als malplaatjes, werden de malplaatjes van DNA voor transcriptie in vitro PCR-versterkt gebruikend een T7 promotor primer als voorwaartse primer en aangewezen omgekeerde inleidingen voor elke iVTtRNA (aanvullende gegevens 1). Elke omgekeerde primer bevatte een 2 ‘- methoxy modificatie bij het tweede nucleotide van het 5 ‘ – eindpunt om template-onafhankelijke toevoeging van een extra nucleotide28 te voorkomen. De producten werden gezuiverd door extractie van fenol/chloroform / isoamylalcohol (25:24:1), gevolgd door ethanolprecipitatie, en de precipitanten werden opgelost in water. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). RNase P componenten samengesteld uit C5-eiwit en M1 RNA werden vervolgens toegevoegd aan reactiemengsels bij 150 nM voor verwijdering van de 27 extra nucleotiden, en reacties werden geïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 °C. getranscribeerde ivttrna ‘ s werden vervolgens verwerkt met zure fenolextractie gevolgd door chloroform/isoamylalcohol (10:1) extractie, vervolgens zuivering door anion-exchange chromatografie. Monsters met iVTtRNAs werden geladen op 10 mL HiTrap Q HP kolommen (#17115401, GE Healthcare, USA) en gewassen met Q buffer (20 mM HEPES-KOH pH 7,6 en 200 mM KCl). iVTtRNAs werden geëlueerd met een lineaire gradiënt van 200 mM tot 1 M KCl in Q buffer. Fracties die target ivttrna ’s bevatten, bepaald door ureum-PAGE, werden teruggewonnen door isopropanolprecipitatie, en precipiteerde ivttrna’ s werden opgelost in water en bewaard bij -80°C tot gebruik. We merken op dat we alle plasmiden kunnen delen op verzoeken.

modificatie van iVTtRNA

t6A37 modificatie werd uitgevoerd in het reactiemengsel met 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM pyridoxal-5 ‘ – fosfaat, 1 mM Ser, 1 mM Gly, 36,4 µM SAM, 0,1 eenheid / µL recombinant Rnaseremmer (#2313 a, TaKaRa, Japan), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2,5 µM MnmC, 6 A260 eenheid/mL tRNAGluUUC of tRNAGluCUC. Na incubatie bij 37°C gedurende 2 uur voor t6a37-en m1G37-modificatie of 4 uur voor mnm5u34-modificatie, werden tRNAs verwerkt met zure fenolextractie gevolgd door chloroform/isoamylalcohol (10:1) – extractie en teruggewonnen door isopropanolprecipitatie. Neergeslagen tRNAs werden opgelost in water en opgeslagen bij -80 °C. Voor modificatie mnm5U34 werd de reactie opnieuw uitgevoerd met herstelde tRNAs. Ze werden verwerkt met zure fenolextractie gevolgd door chloroform / isoamylalcohol (10:1) extractie, ontzouten door Microspin G-25 kolommen (#27532501, GE Healthcare, USA), en teruggewonnen door isopropanol precipitatie. Neergeslagen tRNAs werden opgelost in water en opgeslagen bij -80 °C. om de modificatieefficiëntie te kwantificeren, werd 57,1 µM Thr gebruikt in plaats van 1 mM Thr en het mengsel zonder TsaD werd gebruikt als controle voor t6a37-modificatie. 36.4 µM S — adenosyl-Methionine werd gebruikt en het mengsel zonder TrmD werd gebruikt als controle voor wijziging m1G en zonder GidA werd gebruikt als controle voor wijziging mnm5U34. Na incubatie bij 37 °C werden aliquots (10 µL) teruggetrokken en Gespot op Whatman 25 mm gf/C filterschijven (#1822-025, GE Healthcare, USA). Filterschijven werden tweemaal gewassen met 10% TCA, daarna ethanol, gevolgd door meting van radioactiviteit met een vloeibare scintillatieteller. Voor de kwantificering van mnm5u-wijziging, werden tRNAs gezuiverd zoals hierboven en toen werd 0.02 A260 eenheid op de filterschijven in plaats daarvan Gespot.

Aminoacylatie

Aminoacylatie experimenten werden uitgevoerd volgens een vorig rapport47. Reactiemengsels (10 µL) bevatten 100 mM HEPES-KOH pH 7,6, 15 mM MgCl2, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mM ATP, 1 eenheid/µL recombinant Rnaseremmer (#2313 a, TaKaRa, Japan), 50 nM of 1,5 µM aaRS overeenkomend met elk aminozuur, 20 µM-aminozuur of 68 µM Asn voor asparagineaminoacylering, en 2 A260 eenheid/mL tRNA. Voor het meten van methylering werd in plaats daarvan een mengsel van 0,6 µM en 3,4 µM koud L-methionine gebruikt. Cys werd verkregen door verlaging van-cystine met 50 mM DTT bij 37 °C gedurende 15 minuten. Voor het meten van cysteinylering was de DTT-concentratie 5 mM. wanneer native tRNA-mengsels werden gebruikt, werden in plaats daarvan 40 A260 eenheden/mL tRNA-mengsels (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) toegevoegd. Na incubatie bij 37°C gedurende 30 min, werden aliquots (8 µL) teruggetrokken en Gespot op Whatman 25 mm gf/C filterschijven (#1822-025, GE Healthcare, USA). Filterschijven werden tweemaal gewassen met 10% TCA, vervolgens met ethanol, gevolgd door meting van de radioactiviteit met een vloeibare scintillatieteller.

Octapeptidesynthese met het zuivere systeem

DNA-sjablonen die octapeptiden coderen, werden PCR-versterkt met geschikte primers (aanvullende gegevens 2) met behulp van de Pure1-vector (#PUREV001, BioComber, Japan) met een T7-promotorsequentie en de ribosoombindingsplaats (Shine-Dalgarno-sequentie) als sjabloon. Amplified DNA templates werden gezuiverd met behulp van een QIAquick PCR zuiveringskit (#28104, QIAGEN, Duitsland). Octapeptidesynthesereacties bevatten 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM kaliumglutamaat, 13 mM magnesiumacetaat, 2 mM spermidine, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP, 20 mM creatine fosfaat, 10 µg/mL 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofoliumzuur, 0,2 µM ribosoom, 4 nM DNA template, PROTEÏNEHOUDENDE zuivere systeemcomponenten met inbegrip van translatiefactoren en enzymen, aminozuren en tRNAs. De concentraties van PROTEÏNEHOUDENDE zuivere systeemcomponenten waren zoals beschreven in een eerder protocol46. We merken op dat alle 20 aaRSs werden opgenomen in dit experiment, ongeacht DNA-sjablonen en testcodons. De samenstelling en concentratie van aminozuren, die afhankelijk zijn van de testcodon, zijn vermeld in aanvullende gegevens 2. De samenstelling van iVTtRNAs hangt van het malplaatje af, en reacties werden uitgevoerd gebruikend basale iVTtRNAs (aanvullende gegevens 2) in aanwezigheid of afwezigheid van test iVTtRNAs (aanvullende gegevens 2). De concentratie van elke iVTtRNA werd vastgesteld op 6 µM. Wanneer native tRNA mengsels werden gebruikt, werden in plaats daarvan 56 A260 eenheid/mL tRNA mengsels (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) toegevoegd. Reacties werden uitgevoerd gedurende 60 minuten bij 37 °C en aliquots werden teruggetrokken, Gespot op Whatman 3 MM filterpapier (#1822-025, GE Healthcare, USA), gekookt in 10% TCA bij 90 °C gedurende 30 minuten tot deacylaat aminoacyl-RNAs. De radioactiviteit in de 10% TCA-onoplosbare fractie werd gemeten met een vloeibare scintillatieteller.

eiwitsynthese met het zuivere systeem

Eiwitsyntheseexperimenten werden uitgevoerd met een purefrex 2.0 kit (#PF201, Genefinitor Corporation, Japan) zonder tRNA-mengsels in oplossing I (Buffermengsel). We hebben bovendien 0 toegevoegd.2 µM voldaan, 4 nM PCR-amplified DNA template voor DHFR of sfGFP expressie (aanvullende gegevens 3), en een bepaalde hoeveelheid iVTtRNA mengsel of native tRNA mengsel. Reacties werden uitgevoerd bij 30 of 37 °C gedurende 12 uur, en gesynthetiseerde eiwitten werden geanalyseerd.

analyse van gesynthetiseerde eiwitten

gesynthetiseerde DHFR en sfGFP die radioactief Met bevatten werden geanalyseerd door 15% SDS-PAGE, en het gelbeeld werd gevisualiseerd met behulp van een bas-5000 bio-imaging analyzer (GE Healthcare, USA). Tijd-cursus analyse van sfGFP expressie werd uitgevoerd door het meten van sfGFP fluorescentie elke 3 min met behulp van een StepOne qRT-PCR systeem (#4376373, Applied Biosystems, USA). Fluorescentiebeelden van gesynthetiseerde sfGFP in reactiemengsels werden verkregen met behulp van een LAS-4000 instrument (GE Healthcare, USA). De activiteit van gesynthetiseerde DHFR werd gemeten zoals eerder beschreven 44. Reactiemengsels (2 mL) bevatten 50 mM MES-KOH pH 7,0, 25 mM TRIS-HCl pH 7,0, 25 mM ethanolamine, 100 mM NaCl, 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM EDTA, 100 µM dihydrofoliumzuur, en een 10 µL aliquot van het zuivere reactiemengsel, en ze werden gedurende 15 minuten bij 37°C geïncubeerd. Vervolgens werd 20 mM NADPH toegevoegd aan een uiteindelijke concentratie van 200 µM, en de afname van de absorptie bij 340 nm werd gemeten over een periode van 10 minuten met een v-550 spectrofotometer (Jasco, Japan). Eén eenheid DHFR werd gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die nodig is om 1 µmol dihydrofoliumzuur in 1 min bij 37 °C te verwerken.

LC-MS-analyse van gesynthetiseerde eiwitten

DHFR met FLAG-sequentie op het eindpunt (aanvullende gegevens 3) werd gesynthetiseerd met een PUREfrex 2.0 kit (#PF201, Genefinitor Corporation, Japan) zonder tRNA-mengsels in oplossing I (Buffermengsel). Wij voegden bovendien 4 nM PCR-amplified malplaatje van DNA voor DHFR die met VLAGOPEENVOLGING bij zijn c-Eindpunt wordt geëtiketteerd (aanvullende gegevens 3) en een gespecificeerde hoeveelheid iVTtRNA mengsel of native tRNA mengsel. De reacties werden uitgevoerd bij 30 °C gedurende 12 uur. gesynthetiseerde DHFR werd gezuiverd met anti-vlag M2 magnetische kralen (#M8823, Sigma-Aldrich, USA). Aliquots (55 µL) van de reactiemengsels werden gemengd met 245 µL van de FLAG wash buffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM NaCl, 20 mM Mg (OAc)2), en verder gemengd met 30 µL parels gedurende 1 uur. de parels werden gewassen met 210 µL van de vlag wassen buffer gevolgd door wassen met de buffer zonder Mg (OAc) 2 tweemaal (210 µL en 180 µL). Vervolgens werd DHFR geëlueerd met 50 µL van de Flag wash buffer zonder Mg (OAc)2 maar aangevuld met 100 µg/mL 3xflag peptide (#F4799, Sigma-aldrich, USA) na voorzichtig mengen gedurende 1 uur. voorbereiding van monsters voor LC-MS analyse werd uitgevoerd volgens een phase transfer surfactant (PTS)-aided protocol48. De 4 µL van een dichte PTS-buffer (100 mm natriumdeoxycholaat, 100 mM natrium-n-lauroylsarcosinaat en 500 mM NH4HCO3) werd toegevoegd aan 40 µl van de geëlueerde monsters. Zij werden verminderd met 10 mM TCEP bij 37 °C gedurende 30 min, gealkyleerd met 20 mM jodoaceetamide bij 37 °C gedurende 30 min, en gedoofd met 20 mM Cys. Elke reactieoplossing werd in twee delen verdeeld. Eén werd verteerd door 10 ng / µl Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) en 10 ng/µl trypsine (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) bij 37 °C ‘ s nachts. De andere werd verteerd door 10 ng/µl Asp-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) bij 37 °C ‘ s nachts. Na de vertering werd 10% trifluorazijnzuur (TFA) toegevoegd aan een eindconcentratie van 1%, en de reactieoplossingen werden gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 15.000 × g om de detergentia neer te slaan. Supernatants werden ontzouten met zelf bereide fase tips49 en gedroogd met SpeedVac. LC-MS analyse werd uitgevoerd met behulp van een Orbitrap massaspectrometer (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, USA) uitgerust met een nanospray ionenbron (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, USA) en een nano-LC systeem (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA). De gedroogde peptidemengsels werden opgelost in een oplossing die 5% acetonitril en 0,1% TFA bevatte, en elk monster werd op het nano-LC-systeem aangebracht. Peptiden werden geconcentreerd gebruikend een valkolom (#164535, 0.075 × 20 mm, 3 µm, Toejuiching PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA) en vervolgens gescheiden met behulp van een nano capillaire kolom (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 µm, C18, Nikkyo Technos, Japan) met behulp van twee mobiele fasen Een (0.1% mierenzuur) en B (acetonitril en 0,1% mierenzuur) met een helling (5% B 5 min, 5-45% B 45 min, 45-90% B in 1 min, en 90% B in 4 min), bij een debiet van 500 nL/min. Elutie werd direct elektrosprayed (2,2 kV) in de MS (positieve modus, scanbereik van 200-1500 m/z, 60.000 FWHM resolutie)50.