Laboratory Notes for BIO 1003

© 30 augustus 1999, John H. Wahlert & Mary Jean Holland

enzymen

eiwitten die als katalysatoren fungeren

(Klik hier voor: Materials, themes, web resources)

cellen hebben niet de opties van warmte en krachtig roeren om chemische reacties te versnellen door atomen en moleculen vaker en met meer kracht tegen elkaar te laten botsen. In plaats daarvan maken zij eiwitkatalysatoren genoemd enzymen die oppervlakken verstrekken waarop reactanten elkaar in de juiste oriëntatie ontmoeten, en de enzymen kunnen zelfs banden verzwakken die moeten worden gebroken. Enzymen hebben een hoge specificiteit – alleen specifieke reagentia passen op hun oppervlakken en balanceren de lokale oppervlakte ladingen van de plaats genaamd de actieve site. De specifieke reeks reagentia voor een enzym worden zijn substraat(s) genoemd. Enzymen, zoals alle katalysatoren, worden niet veranderd door de reactie die ze katalyseren; aldus, wanneer alle reactanten in producten zijn omgezet, blijven de originele enzymmoleculen.

De enzymfunctie is afhankelijk van de omgeving waarin de reactie optreedt. Dergelijke factoren zoals temperatuur en pH kunnen het vermogen van een enzym om zijn werk te doen sterk beïnvloeden. De volgende reeks experimenten illustreert de principes van enzymatisch gekatalyseerde reacties in biologische systemen. We zullen het enzym catecholase (of catecholoxidase) gebruiken dat in planten gebruikelijk is; het is aanwezig in het vers geperste aardappelsap dat is geleverd. De substraten van catecholase zijn catechol en zuurstof. De substraten reageren met elkaar binnen de actieve plaats van het enzym. De producten die door deze reactie worden gevormd zijn benzochinon en water; aangezien benzochinon een bruine kleur heeft, kun je zien dat de reactie heeft plaatsgevonden. Dit wordt de fruit bruining reactie genoemd. Benzoquinon remt de groei van micro-organismen en voorkomt dat beschadigd fruit rot. In onbeschadigde cellen wordt catecholase opgeslagen in blaasjes en heeft geen interactie met catechol.

in aanwezigheid van het enzym catacholase:

catechol + ½O2 benzochinon + H2O

bij alle onderstaande experimenten de ingrediënten mengen zoals gespecificeerd en het mengsel roeren met een vortex genie of door op de zijkant van de buis dicht bij de bodem te tikken; incubeer mengsels bij 40 graden C, tenzij anders aangegeven.

Als u twijfelde aan de zuiverheid van het enzym, hoe kunt u dan achterhalen of er naast catecholase nog iets anders in het aardappelextract zit?

I. vorming en detectie van benzochinon

Dit experiment stelt de normen vast voor het voorkomen wanneer de reactie al dan niet heeft plaatsgevonden. Gebruik gedestilleerd water waarbij H2O is aangegeven.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment)
10 drops potato extract with 10 drops H2O (control)
10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (control)

hoe definieer je de concepten van een besturing en van een experiment?

II. Enzymspecificiteit

hydrochinon is structureel vergelijkbaar met maar niet hetzelfde als catechol. In dit experiment zullen we zien of het enzym het ook kan omzetten in benzoquinon, of dat het enzym simpelweg te specifiek is in zijn ontwerp om te interageren met het soortgelijke maar niet identieke molecuul.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol
10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone
10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (control)

kan het enzym hydrochinon omzetten in benzochinon? Hoe ben je tot deze conclusie gekomen?

opmerking: uw groep zal ofwel III of IV doen—niet beide.
vraag uw laboratoriuminstructeur of uw groep III temperatuur of IV pH zal doen.

III. effect van temperatuur op enzymactiviteit

enzymen zijn ontworpen om binnen een specifiek temperatuurbereik te functioneren. U kunt een aantal gissingen maken over de uitkomst voor de volgende temperaturen onder. Houd er rekening mee dat de structuren die het enzym produceren fruit en aardappel zijn; op de Celsius temperatuurschaal vriest 0 graden, 22 graden is kamertemperatuur, en 100 graden kookt. Hoe heter het is, hoe sneller moleculen trillen en bewegen. Botsingen van watermoleculen met het enzym kunnen zijn gevouwen structuur ongedaan maken die in positie wordt gehouden door waterstofbindingen; wanneer dit gebeurt, wordt gezegd dat het molecuul gedenatureerd is. Wat zou er in dit geval met de actieve site gebeuren? Bij lage temperaturen bewegen moleculen heel langzaam, en de kans dat ze met elkaar botsen en reageren is erg klein. Merk op dat het aardappelextract op ijs is bewaard. Waarom?

schrijf uw hypothese op over het effect van de temperatuur op de enzymactiviteit:

stel 6 paar reageerbuisjes in met 10 druppels aardappelextract in de ene set en 10 druppels van 1% catechol in de andere. Incubeer ze gedurende 5 minuten, één paar in elk van de 5 temperatuuromgevingen hieronder aangegeven. Meng vervolgens het aardappelextract en catechol samen; neem de initiële kleur op, en zet die buis terug in de gecontroleerde temperatuuromgevingen. Neem de kleur weer op na 5 minuten.

temperatuur	initiële kleur	kleurverandering (5 min.. after adding catechol)
0 degrees C
22 degrees C
40 degrees C
60 degrees C
80 graden C
100 ° C

Doe de resultaten ondersteunen uw eerste hypothese?

welke temperaturen het enzym denatureren zodat het niet kan herstellen.

Wat is het witte neerslag dat zich vormt bij 100 graden C?

IV. Effect van pH op enzymactiviteit

de pH-schaal meet het aantal waterstofionen (elk met een +1 lading) aanwezig in oplossing. De schaal in biologische systemen loopt van 0 (sterk zuur) tot 14 (sterk basisch). 7, het neutrale punt, is de pH van zuiver water. Bedenk dat de gevouwen structuur van eiwitmoleculen voor een groot deel te wijten is aan waterstofbinding tussen tegengesteld geladen delen van de polypeptideketen. Andere ionen in oplossing kunnen de bijpassende delen van de ketting vervangen en het ongedaan maken. Wanneer dit gebeurt, wat gebeurt er met de actieve site?

schrijf uw hypothese op over het effect van het pH-bereik op de enzymactiviteit:

plaats 7 reageerbuisjes met elk 40 druppels van een verschillende gebufferde pH-oplossing. Voeg aan elk 10 druppels aardappelextract toe en roer. Voeg vervolgens 10 druppels van 1% catechol toe en roer.

pH	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
pH 2
pH 4
pH 6
pH 7
pH 8
pH 10
pH 12

Do the results support your hypothesis?

bij welke pH of Bereik van pH-waarden werkt het enzym het beste?

waarom vertraagt het aanbrengen van citroensap op vers gesneden fruit de bruinkleuring?

V. noodzaak van cofactoren voor enzymactiviteit

veel enzymen werken alleen als er een cofactor mee geassocieerd is. Catecholase vereist koper als cofactor. PTU is een chemische stof die een hogere affiniteit voor koper heeft dan catecholase, en het neemt het koper weg van het enzym. U kunt zien wat er gebeurt met de functie van het enzym wanneer de cofactor wordt verwijderd. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.

Mix	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
Tube A 10 drops potato extract 5 crystals PTU and mix. After 5 minutes add 10 drops 1% catechol.
Tube B 10 drops potato extract.voeg na 5 minuten 10 druppels 1% catechol toe.

welke buis, A of B, is de controle in dit experiment?