Dieren

zebravis werd op 28,5 °C gehouden tijdens een 14 uur aan / 10 uur uit lichtcyclus in Danieau-oplossing . De combinatorische kristal mutant (albb4 / b4;nacrew2 / w2;roya9/A9) werd gegenereerd door achtereenvolgens drie verschillende enkelvoudige mutant stammen te kruisen, namelijk nacrew2/w2 (ref. 9), roya9 / a9 (ref. 4) en albb4/b4 (ref. 18) mutanten. Belangrijk is dat zowel larven als volwassen kristalzebravissen levensvatbaar zijn en geen zichtbare morfologische, functionele of gedragsafwijkingen vertonen, anders dan het pigmentatiefenotype. De Casper mutant werd verkregen door kruising van nacrew2 / w2 en roya9/a9 mutanten, zoals eerder beschreven 4. De AB lijn werd gebruikt om wilde type zebravis te verkrijgen. Transgene lijnen die in dit onderzoek worden gebruikt, omvatten Tg(elavl3:GCaMP5G)21 en TG(elavl3:GCaMP6f)28. Confocal functionele beeldvormingsexperimenten werden uitgevoerd in de nacremutant. Experimenten met lichtplaten werden uitgevoerd in nacre, casper en crystal mutanten. Twee-foton functionele beeldvorming experimenten werden uitgevoerd in kristallen larven. Voor de behandeling van zebravislarven met PTU hebben we standaardprocedures8 gevolgd, met name larven werden gekweekt in 200 µM PTU (Sigma) in Danieauoplossing vanaf 24 uur na de bevruchting (hpf). TG (elavl3:GCaMP5G) larven gebruikt voor confocale functionele beeldvorming van visueel opgeroepen neurale activiteit in het optisch tectum werden behandeld met 200 µM PTU van 24 hpf tot 3 dpf en afgebeeld op 4 dpf. Dit werk werd goedgekeurd door de lokale Animal Welfare and Ethical Review Body (King ‘ s College London), en werd uitgevoerd in overeenstemming met de Animals (Scientific Procedures) Act 1986, onder licentie van het Britse Ministerie van Binnenlandse Zaken (PPL70/8057).

beeldvorming

in vivo microscopie

hele dierenbeelden van volwassen zebravissen werden genomen met een Nikon D7000 digitale SLR-camera uitgerust met een Sigma 150 mm macrolens. Volwassen zebravissen werden verdoofd met 0.2% tricaine (Ms222, Sigma) in het water van de visvoorziening en in een petrischaal van 90 mm met visvoorziening. Beeldvorming van larven werd uitgevoerd met behulp van een Zeiss Axioskop microscoop verbonden met EXi Blue CCD camera ‘ s (Retiga) en Volocity acquisitie software (PerkinElmer). Larvale zebravissen werden verdoofd met 0,02% tricaine in Danieau-oplossing en geïmmobiliseerd in 1% laag smeltpunt agarose (Sigma) op glasplaten.

confocale calciumbeeldvorming

beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een Zeiss LSM 710 confocale microscoop uitgerust met een spectrale detectie scankop en een 20X / 1.0 NA water-immersie doelstelling (Carl Zeiss). Functionele tijdreeksen van visueel opgeroepen calciumresponsen in retinale ganglioncellen (RGC ‘ s) werden verkregen met een snelheid van 4,1 Hz en een resolutie van 0,415 × 0,415 µm (256 × 256 pixels), en een pinhole-opening van 1 AU. Excitatie licht werd geleverd door een 488 nm multi-line laser. Niet-geanesthetiseerde TG(elavl3:GCaMP5G) larven werden geïmmobiliseerd in 2% laag smeltpunt agarose (Sigma) bereid in danieau-oplossing en gemonteerd dorsale kant omhoog op een verhoogd glazen platform dat werd geplaatst in een op maat gemaakte Danieau-gevulde kamer. De agarose was voldoende om de larven in bedwang te houden zodat verdoving niet nodig was. Beeldvorming werd uitgevoerd in de middag (1-8 pm).

beeldvorming van lichtplaten

beeldvorming van lichtplaten in de hele hersenen werd uitgevoerd met behulp van een Zeiss Lightsheet Z. 1 Microscoop uitgerust met twee 10x/0,2 na belichtingsdoelstellingen en één 20x / 1,0 NA water-immersion detection objective (Carl Zeiss). 488 nm-het licht van de laseruitbreiding werd gebruikt om de fluorescentie van GCaMP6f te ontlokken en een 505-545 BP-filter werd gebruikt voor uitgezonden lichte opsporing. De pivot scanner (Carl Zeiss) werd gebruikt om homogene verlichting te leveren en daardoor schaduwen langs de verlichtingsas te vermijden. De dikte van de lichte plaat was 5,39 µm in het Midden en 10,8 µm aan de randen van het gezichtsveld. De grootte van de volumetrische beelden was 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 pixels) met een resolutie van 0,415 × 0,415 × 0,631 µm. 4 larven van DPF nacre, casper en crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) werden eerst 10-15 minuten verlamd in α-bungarotoxine (1 mg/ml; Biotium) bereid in danieau-oplossing. Vervolgens werden larven geïmmobiliseerd in 2% laag smeltpunt agarose (Sigma) en geplaatst in een glazen capillair (20 µl volume, 701904; merk). Vervolgens hebben we het deel van de agarose cilinder met de kop van de larve uit het capillair geëxtrudeerd en de larven zo georiënteerd dat de rugzijde van de kop naar het detectiedoel keek en de ogen naar de twee verlichtingsdoelstellingen. Beeldvorming van casper-mutantlarven in de hele hersenen werd uitgevoerd met behulp van een op maat gemaakte lichtplaatmicroscoop gebouwd door Dr Martin Meyer (King ‘ s College London) en uitgerust met een 20x/1.0 NA water-immersion xlumplanfln detection objective (Olympus).

twee-foton calcium beeldvorming

twee-foton functionele beeldvorming in het netvlies werd uitgevoerd met behulp van een Nikon A1R MP microscoop uitgerust met een 4-kanaals Gaasp NDD en een Apochromat 25x/1,1 NA water-immersion objective (Nikon). Excitatie werd geleverd door een Chameleon Ultra II Mode-vergrendelde titanium-saffier laser (Coherent) afgestemd op 930 nm. Tijdreeksen van visueel opgeroepen calciumresponsen werden verkregen met een snelheid van 4 Hz en een resolutie van 0,248 × 0,248 µm (512 × 256 pixels). Na activering van het laserscan wachtten we 60 seconden voordat we begonnen met de visuele stimulatie om ervoor te zorgen dat het netvlies werd aangepast aan het achtergrondlichtniveau dat door de multi-fotonlaser wordt veroorzaakt. 4 DPF crystal TG(elavl3:GCaMP6f) larven werden eerst 10-15 minuten verlamd in α-bungarotoxine (1 mg/ml; Biotium) bereid in danieau-oplossing. Vervolgens werden larven geïmmobiliseerd in 2% laag smeltpunt agarose (Sigma) en gemonteerd op een verhoogd op maat gemaakt glazen platform met de rugzijde naar boven (45° hoek kanteling) en een oog naar een LCD-scherm (zie visuele stimulatie) dat onder een op maat gemaakte Danieau gevulde kamer werd geplaatst. Beeldvorming werd uitgevoerd in de middag (1-8 pm).

visuele stimulatie

bewegende staven in confocale bereiding

bewegende staven werden gegenereerd zoals eerder beschreven 22,33. Een diffusiefilter (3026, Rosco) werd aan één zijde van de kamer gehecht om als projectiescherm te dienen. De agarose voor het oog gericht op het projectiescherm werd verwijderd, zodat een onbelemmerd zicht op het geprojecteerde beeld aan de zijkant van de kamer. Larven werden op 3 cm afstand van het scherm geplaatst en het geprojecteerde beeld vulde een gezichtsveld van ~97° × 63°. Visuele stimuli bestonden uit licht (56 cd/m2) of donkere balken (8 cd/m2) (respectievelijk 175% en 25% van de gemiddelde Luminantie) op een gemiddelde grijze achtergrond (32 cd / m2). Aangezien er geen kwalitatieve verschillen tussen lichte en donkere staven werden waargenomen, werden gegevens die met de twee stimuli werden verkregen, gecombineerd. Elke staaf was 10° breed met een snelheid van 20°/s en 30° van de voorgaande staaf gescheiden, waardoor meer dan één staaf op het scherm tegelijk mogelijk was. De lange assen van de staven waren loodrecht op de bewegingsrichting. Elk van de 12 bewegingsrichtingen werd één keer (3 seconden) gepresenteerd in een pseudo-willekeurige volgorde die uniek is voor elke plak in elk afgebeeld dier. Elk Inter-Epoche interval was 10 seconden om gcamp5g-signalen terug te laten keren naar de basislijn. Een lege scherm nul voorwaarde van 2 seconden werd ook interleaved. Visuele experimenten werden gegenereerd en gecontroleerd met behulp van op maat geschreven Labview en MATLAB code (MathWorks), geïmplementeerd op een ViSaGe stimulus presenter (Cambridge Research Systems) en geleverd via een DLP Pico Projector (Optoma).

bewegende roosters in voorbereiding met twee fotonen

bewegende roosters stimuli in de voorbereiding met twee fotonen werden gegenereerd en gecontroleerd met behulp van PsychoPy39, en geleverd via een LCD-scherm (SKD5VA-3, GoodWell-technologie) geplaatst onder een op maat gemaakte Perspex-kamer. Een long-pass Rood glazen filter (Fgl610, Thorlabs) werd geplaatst tussen het LCD-scherm en de kamer om gelijktijdige beeldvorming en visuele stimulatie mogelijk te maken. Larven werden op 2 cm afstand van het scherm geplaatst en het beeld op het LCD-scherm vulde een gezichtsveld van ~140° × 100° (gemiddelde achtergrondluminantie 30,4 cd / m2). Visuele stimuli bestonden uit roosters met vierkante golven (100% contrast, ruimtelijke frequentie 1,66 cycli/cm, temporale frequentie 1 cycli/s). Elk rooster was 8,5° breed en de lange assen van de staven waren loodrecht op de bewegingsrichting. Elk van de 12 bewegingsrichtingen werd eenmaal gepresenteerd (6 seconden) met een inter-Epoche interval van 10 seconden om gcamp6f-signalen in staat te stellen om terug te keren naar de basislijn. Een lege scherm nul voorwaarde van 6 seconden werd ook interleaved. TTL triggers (0-5-0 Volt) om epoch tijd gebeurtenissen op te nemen wanneer gegenereerd via een LabJack USB DAQ apparaat (U3-LV, LabJack Corporation). Na activering van het laserscan wachtten we 60 seconden voordat we begonnen met de visuele stimulatie om ervoor te zorgen dat het netvlies werd aangepast aan het achtergrondlichtniveau dat door de multi-fotonlaser wordt veroorzaakt.

Optomotor response assay

individuele 5 DPF larven werden gepositioneerd in een 35 mm petrischaal met Danieau-oplossing. Het LCD-scherm van een iPhone 5 (Apple) bestuurd door een MacBook Pro (Apple) via Duet-Display (Kairos Technologies) werd gebruikt om zwart-wit roosters met vierkante golven weer te geven (85% contrast, ruimtelijke frequentie 0,33 cycli/mm, temporale frequentie 3,5 cycli/s) die in 4 richtingen bewegen (90° hoekafstand) aan de onderkant van de petrischaal. Visuele stimuli werden gegenereerd in Keynote (Apple). Elke larve werd in totaal 5 keer getest (elke proef duurde 6 s gevolgd door 10 s statische roosters) en scoorde volgens de proeven waarop hij reageerde (d.w.z. vissen draaien en zwemmen in de richting van de bewegende roosters). Het gedrag van de larven werd visueel gecontroleerd met een M165 FC stereomicroscoop (Leica).

analyse

functionele Analyses

in vivo calciumbeeldvormingsgegevens werden geanalyseerd zoals eerder beschreven 22,33. Samengevat werden functionele tijdreeksen vóór de analyse als volgt verwerkt:: tijdreeksbeelden van elk experiment werden gecorrigeerd voor beweging met een rigid-body algoritme (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), mediaan gefilterd met een kernelgrootte van 1 voxel om donkere en geschoten ruis te verwijderen, en ruimtelijk gladgestreken met een 2D Gaussiaanse kernel = 2 voxels om signaal-ruis te verbeteren. Een baseline (B) die corrigeert voor laagfrequente afwijkingen werd bepaald met behulp van een cubic-spline algoritme dat extrapoleert tussen knopen gemiddeld van 5 s van de inter-epoch interval gegevens. Beide veranderingen in relatieve signaalintensiteit (ΔF = F-B; waarbij F = ruwe fluorescentie) en genormaliseerde signaalintensiteit veranderingen werden berekend bij elke voxel. ΔF werd gebruikt voor population functional data (voxel-wise analyse), terwijl %ΔF/F0 werd gebruikt voor handmatig gedefinieerde gebieden van belang (ROIs). Voor elke voxel of ROI werd de integrale respons over het epoch-interval berekend om een enkele respons-metriek te geven van elke gepresenteerde richting van stimulusbeweging. De integraal binnen elk epoch-venster is een samenvattende metriek die beter bestand is tegen verzadigingseffecten van de calciumsonde dan tegen maximale signaalverandering. Een drempelwaarde voor elke voxel binnen een acquisitiebeeldsequentie werd bepaald aan de hand van de variantie van ΔF-veranderingen tijdens de inter-Epoche-intervallen en nulconditie, drempelwaarde = 5 × SDs. Alle voxels die boven de drempel stonden binnen ten minste twee tijdperken van visuele presentatie werden beschouwd als visueel responsief en onderworpen aan verdere karakterisering.

om de richting-en oriëntatieselectiviteit van visueel responsieve voxels te analyseren, werden richtings-en oriëntatieselectieve indices (DSI en OSI)40, gebaseerd op passende von-Mises-of Gaussiaanse profielen41, berekend samen met een schatting voor hun goede pasvorm, R2. De DSI werd gedefinieerd als(Rpref−Rnull)/(Rpref + Rnull), waarbij Rpref, de respons op de voorkeursrichting, de integrale respons over de voorkeursrichting epoch-interval was. Rnull werd eveneens berekend als de integrale respons die wordt opgeroepen door de richting die tegenovergesteld is aan de voorkeursrichting. De OSI werd gedefinieerd als(Rpref−Rorth)/(Rpref + Rorth), waarbij Rpref, de respons op de voorkeursoriëntatie, de integrale respons was over het voorkeursoriëntatietijdperk-interval. Rorth werd eveneens berekend als de integrale respons die door de orthogonale oriëntatie wordt opgeroepen. Om cross talk en over-fitting geassocieerd met DSI en OSI metrics te minimaliseren, werd een strikte aanpak ondernomen. Om een voxel als richting-selectief (DS) of oriëntatie-selectief (OS) te beschouwen, werden onderling exclusieve criteria gebruikt: DS if DSi > 0,5 en OSI < 0.5; en OS if OSI > 0,5 en DSI < 0,5. In beide gevallen moest de goodness of fit (R2) voor respectievelijk DSI en OSI >0.8 zijn; de aangepaste curven verklaarden dus ten minste 80% van de integrale responsen. Een enkele von-Mises-verdeling werd gebruikt om de reacties van DS voxels aan te passen en de gewenste bewegingsrichting vanuit het midden van de gemonteerde kromme in te schatten. De som van twee von-Mises (180 ° hoekafstand van elkaar) werd gebruikt om reacties van OS voxels aan te passen en hun voorkeursrichting van bewegingshoeken ten opzichte van het midden van de gemonteerde krommen te schatten. Circulaire variantie werd ook berekend voor vergelijking als een alternatieve metriek van de oriëntatie selectiviteit (circulaire variantie < 0.4)41.

morfologische Analyses

om het hersenvolume te bepalen in 4 DPF nacre, casper en crystal Tg (elavl3:Gcamp6f) larven, hebben we het aantal gcamp6f+ voxels in elke volumetrische afbeelding berekend door de adjust>threshold functie toe te passen, gevolgd door de analyse>histogram>list commando in ImageJ42. Vervolgens werden de verkregen waarden vermenigvuldigd met het volume van een enkele voxel (0,415 × 0,415 × 0,631 µm3 = 1,086 × 10-1 µm3).

statistische Analyses

statistische testresultaten worden gerapporteerd in cijfers en legendes. Statistische analyses en tests werden uitgevoerd met Prism 6 (GraphPad) of MATLAB R2014b (MathWorks). Voordat statistische tests werden uitgevoerd, werden beschrijvende statistieken (bijvoorbeeld normaliteitstests om te zien of waarden afkomstig zijn van een Gaussiaanse verdeling of een F-test om varianties te vergelijken) gebruikt om de juiste statistische test te kiezen (gerapporteerd in Figuur legends samen met testresultaten). Het criterium voor statistische significantie werd vastgesteld op p < 0,05.