Abstract
bestaande chemotaxis—assays genereren geen stabiele chemotactische gradiënten en meten dus—na verloop van tijd-alleen niet-specifieke willekeurige beweging (chemokinesis). In vergelijking, heeft de microfluidic technologie de capaciteit om een strak gecontroleerd micromilieu te produceren dat stabiel voor langere periodes van tijd kan worden gehandhaafd en daarom vatbaar voor aanpassing voor het testen van chemotaxis is. Wij beschrijven hier een nieuw microfluidic apparaat voor gevoelige analyse van cellulaire migratie en tonen zijn toepassing voor het evalueren van chemotaxis van gladde spiercellen in een chemokine gradiënt.
1.
gerichte celmigratie speelt een cruciale rol bij inflammatoire aandoeningen, vasculaire aandoeningen, wondgenezing en tumormetastase . Een aantal in vitro benaderingen zijn ontwikkeld om celmigratie te kwantificeren, met inbegrip van sluiting van monolaag wonden (“scratch assay”) en de Boyden kamer . Deze huidige methoden zijn echter relatief ongevoelig. Bovendien, kunnen dergelijke benaderingen eigenlijk slechts chemokinese meten, dat wil zeggen, verhoogde willekeurige beweging, eerder dan chemotaxis-gerichte celmigratie.
Het nut van de scratch assay en Boyden chamber transwells wordt inderdaad beperkt door hun methodologische ontwerp.
voor de scratch-test wordt een gedefinieerde “wond” (scratch) gemaakt in een monolaag van samenvloeiende cellen; cellen aan de randen van het defect vullen dan geleidelijk de leegte in en de tijd tot herstelde samenvloeiing wordt gekwantificeerd. De snellere reparatie van de kras is geà nterpreteerd om verbeterde “chemotaxis” te weerspiegelen toe te schrijven aan celmanipulatie of de aard van oplosbare agenten die aan het medium worden toegevoegd. Terwijl het experiment conceptueel eenvoudig en technisch gemakkelijk uit te voeren is, worden de cellen gebaad in een uniforme concentratie van agent, en er is geen chemoattractant concentratiegradiënt tijdens het gehele experiment; de beweging die de kloof vult vertegenwoordigt daarom slechts een “willekeurige wandeling.”Dus, de “migratie” in een scratch assay is grotendeels een functie van alleen verhoogde chemokinese. Bovendien, zoals typisch uitgevoerd—vooral over enkele uren van een langdurige analyse—het sluiten van een kras “wond” omvat waarschijnlijk ook een substantieel onderdeel van celproliferatie.
de andere meest gebruikte methode om “chemotaxis” te meten is het gebruik van Boyden chamber transwells. De verschillende concentraties van specifieke chemokines worden geplaatst in het lagere compartiment van het apparaat, terwijl de te evalueren cellen in het bovenste tussenvoegsel worden geïncubeerd; een microporeus membraan scheidt de twee kamers en vormt een steun voor celgroei en een gedeeltelijke barrière voor migratie. De cellen die bij het lagere gezicht van het membraan worden geteld, of die in de lagere kamer accumuleren, worden typisch beoordeeld bij één vast eindpunt. Deze test heeft het voordeel van een schijnbare gerichte migratie, dat wil zeggen, van de bovenste naar de onderste kamer, maar is nog steeds problematisch. Ten eerste is er geen “gradiënt” van chemokines van boven naar beneden, maar slechts een enkele stap functie van lage naar hoge concentraties. Ten tweede is er geen manier om het chemokinedifferentieel van de bovenste naar de onderste kamers te ondersteunen . Aanvankelijk is de chemokineconcentratie in het lagere compartiment groter, maar binnen minuten tot uren egaliseren de concentraties door diffusie, op welk punt specifieke chemotaxis ophoudt. In plaats daarvan weerspiegelen langetermijnmetingen waarschijnlijker een significant element van chemokinese. Bovendien, zodra de cellen door het membraan en in de lagere kamer vallen, is er geen kans voor omgekeerde migratie. Ten slotte is de Boyden-kamer ook beperkt omdat het tellen van cellen beëindiging van het experiment vereist; een tijdsverloop vereist daarom meerdere apparaten.
microfluïdische technologie kan deze beperkingen overwinnen door op lange termijn een stabiele en controleerbare gradiënt van oplosbare factoren te genereren die in de loop van de tijd continu kan worden gecontroleerd . Met behulp van cellen die zijn behandeld om proliferatie te blokkeren, maakt een dergelijk apparaat een echte voortdurende beoordeling van chemotaxis versus chemokinese mogelijk. Figuur 1 toont een dergelijk apparaat waar de bron – en zinkconcentraties worden gehandhaafd door het creëren van overeenkomstige putten waarvan de volumes groot zijn ten opzichte van de diffusieve flux door het verbindende hydrogelkanaal . Bij steady state vormt zich een lineaire concentratiegradiënt tussen deze twee putten. Hoewel de interstitiële stroom door het hydrogelgebied de gradiënt kan verstoren als de hydrostatische druk in de twee putten niet gelijk is, worden de drukgradiënten geëlimineerd door de bron-en spoelputten te verbinden met extra kanalen en reservoirs die dienen als lage weerstandsbanen voor vloeistofstroom en drukevenwicht. De gradiënten kunnen, aldus, verscheidene dagen worden gehandhaafd en aan studiecelmigratie op een gevoelige en specifieke manier met een verscheidenheid van celtypes worden gebruikt . Het hier gepresenteerde werk beschrijft het gebruik van dergelijke apparaten om chemotaxis te beoordelen voor primaire culturen van gladde spiercellen en om het te vergelijken met Scratch en Boyden chamber technieken voor gevoeligheid.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (a) de onderste 3 putten zijn cel-en/of bronputten voor chemokines, en de bovenste 3 putten dienen als reservoirs om gelijkwaardige druk in de onderste putten te handhaven. Afhankelijk van experimenteel ontwerp, kunnen de zijputten of de centrale put als bronputten dienen; cellen in een centrale put kunnen naar verschillende chemokineprikkels aan beide kanten migreren, of verschillende celpopulaties in de zijputten kunnen naar een centrale chemokineprikkel migreren. (b, c) De concentratiegradiënten worden schematisch weergegeven na toevoeging van een fluorescerende kleurstofindicator met een laag molecuulgewicht aan de bronput en het bronreservoir, hetzij 2 uur (b), hetzij 72 uur (c). D) grafische weergave van concentratiegradiënten van 0 uur tot 72 uur na toevoeging van fluorescerende kleurstof aan bronput en reservoir.
2. Materialen en methoden
2.1. Primaire Smooth Muscle Cells (SMC) Culture
aorta ‘ s werden geoogst van 8 weken oude C57/B6 muizen (Charles River, Wilmington, MA) met een steriele dissecteerschaar. Adherent vet werd verwijderd, en aorta ’s werden geïncubeerd gedurende 20 min bij 37°C in Dulbecco’ s modified Eagle ‘ s medium (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) met 1% penicilline/streptomycine, 2% foetaal runderserum, en 5 mg/mL collagenase type II (Invitrogen). Aorta ‘ s werden gespoeld in koude DMEM en de adventitia werd zorgvuldig ontleed; ze werden vervolgens in kleine stukjes gesneden en gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd in DMEM met 1 mg/mL collagenase type I (Invitrogen) en 0,125 mg/mL elastase type III (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO). Na herhaalde pipetteren om het weefsel te scheiden, werd het resulterende celmengsel gesuspendeerd in vers “SMC medium” (DMEM met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline/streptomycine; 2% niet-essentiële aminozuren, 1% L-glutamine; alle reagentia van Invitrogen) en gekweekt bij 37°C in een 5% CO2-incubator op platen bedekt met 1 mg/mL fibronectine gedurende 30 minuten. Zodra de celcultuur is gevestigd (typisch na de eerste passage), wordt SMC gekweekt op ongecoate plastic kolven (Corning opgenomen, Corning, NY).
SMC werden gebruikt van passages 2 tot en met 7 en waren 99.5% zuiver zoals beoordeeld door cytometrie stroom na kleuring voor gladde spier α-actine. Voor kleuring worden cellen geoogst en gefixeerd met 1% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). FITC-conjugated antismooth muscle α-actin antilichaam (Sigma-Aldrich) bij 1 : 100 verdunning in 10X BD perm/wash buffer (Bd Pharmingen, San Jose, Californië) werd aangebracht gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Cellen worden tweemaal gewassen met 1% foetaal runderserum in PBS en eenmaal met 1% foetaal runderserum in PBS met 1% formaldehyde en onmiddellijk geanalyseerd door flow cytometry (FACScalibur, Bd Biosciences, San Jose, CA). FITC-conjugated mouse IgG1 isotype (BD Pharmingen) wordt gebruikt als een isotype controle. De cellen voor chemotactische analyses werden geoogst toen zij samenvloeiing hadden bereikt.
2.2. Mitomycine-C behandeling
cellen werden gedurende 2 minuten bij 37°C trypsine-EDTA (0,25% trypsine-EDTA; Invitrogen), gewassen met SMC-medium, en vervolgens geïncubeerd als een eencellige suspensie in 40 µg / mL mitomycine-C (MMC; Sigma-Aldrich) in SMC-medium gedurende 30 min bij 37°C. Na twee extra wasbeurten in PBS, werden cellen beoordeeld op levensvatbaarheid, proliferatie, of migratiecapaciteit. Voor de wondgenezing (scratch) assay, MMC behandeling werd uitgevoerd na SMC plating en wanneer cellen waren 100% samenvloeiend; cellen werden geïncubeerd in 40 µg / mL MMC in SMC-medium gedurende 30 min bij 37°C en vervolgens tweemaal gewassen in PBS vóór de assay.
2.3. SMC-Proliferatieremmingstest
na MMC-behandeling of controle-incubatie in SMC-medium werd SMC gekweekt in 6-putplaten (Corning Incorporated). Cellen werden na 1 uur, 24 uur of 48 uur door trypsinisatie teruggevonden en celaantallen en levensvatbaarheid werden beoordeeld door te tellen met behulp van een hemocytometer en trypan blue exclusion.
2.4. Wondgenezing / Scratch Assay
SMC werden gekweekt in 12-Wells platen (Corning Incorporated) tot confluent en vervolgens behandeld met MMC. Na het wassen werd vers SMC-medium toegevoegd en werd de celmonolaag reproduceerbaar gekrast met behulp van een steriele pipetpunt van 200 µL. Verschillende concentraties van bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF; R&D Systems, Minneapolis, MN) in SMC media werden toegevoegd aan elke put. De afstand tussen de randen van het krasdefect werd gemeten en gemiddeld vanaf vijf afzonderlijke punten op 3, 6 en 9 uur, of totdat het wonddefect was gesloten.
2.5. Boyden Chamber Transwell Assay
100 µL SMC suspensies bij 1,0-1,5 × 105 cellen / mL (1,0–1,5 × 104 Totale cellen) werden geladen in de bovenste transwell inserts (Costar, Corning Incorporated) en 600 µL SMC media met verschillende concentraties PDGF werden geplaatst in het onderste compartiment. Na 6 uur, 12 uur of 24 uur incubatie werd het transwell-membraan gekleurd met Hoechst 33342 (Invitrogen) volgens de aanbeveling van de fabrikant, en transmigreerde cellen op het ondervlak werden geteld op een fluorescentiemicroscoop met behulp van metamorf NX-Microscopieautomatisering en Beeldanalysesoftware (BioCompare, South San Francisco, CA). Er zijn nooit cellen geïdentificeerd in het medium in de onderste kamer. In experimenten om te beoordelen of celmigratie chemotaxis of willekeurige chemokinese vertegenwoordigde bij afwezigheid van een concentratiegradiënt, werd bloedplaatjes afgeleide groeifactor-BB (PDGF) toegevoegd aan de onderste kamer, alleen de bovenste inzetplaats, of zowel de bovenste inzetplaats als de onderste kamer.
2.6. De microfluidic device Assay
De microfluidic devices (figuur 1(A) -1(c)) worden bereid zoals elders beschreven . Zoals aangegeven in Figuur 1, onder d), zijn de gradiënten van toegevoegde reagentia gedurende ten minste 72 uur stabiel. Afhankelijk van het experimentele protocol, worden de te evalueren cellen in de centrale put geplaatst en verschillende chemotactische gradiënten ontwikkeld van de twee zijputten. Alternatief, kan de migratie van twee verschillende populaties van cellen van de zijputten worden geëvalueerd, ervarend identieke concentratiegradiënten die door reagentia worden geproduceerd die in de centrale put worden geplaatst. Celconcentraties waren altijd 4-5 × 105 / mL en 40 µL van de cel suspensies (1,6–2,0 × 103 cellen) werd geladen in testputten.
cellen werden geïncubeerd in de apparaten voor verschillende tijdstippen en vervolgens gekleurd met Hoechst 33342 (Invitrogen). De locatie van elke cel werd bepaald met behulp van fluorescentiemicroscopie (Nikon Eclipse TE2000 – U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), en de gemigreerde afstand werd beoordeeld met behulp van het Matlab-programma (MathWorks, Natick, MA). “Totale migratie” wordt gedefinieerd als de som van de afstanden die door alle cellen worden gemigreerd buiten een initiële startlocatie; deze migratie-index wordt gebruikt voor statistische analyse (Figuur 2).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
Beoordeling van de cel migratie in microfluidische apparaten. De cellen werden geplateerd in de centrale lagere put van een microfluidic apparaat, met 50 ng/mL PDGF in SMC medium geplaatst in de linker lagere put en SMC medium alleen geplaatst in de rechter lagere put, gevolgd door incubatie bij 37°C gedurende 48 uur. (A, b) Fasecontrastbeeld van celchemotaxis vanuit het centrale kanaal in de richting van de 50 ng/mL PDGF in het linkerkanaal; de beelden worden verdeeld langs het kanaal tussen de gootsteen en bronputten, zodat de volledige lengte van het kanaal kan worden weergegeven bij een vergroting die voldoende is om cellulaire resolutie mogelijk te maken. (c, d) Fasecontrastbeeld van celchemokinese vanuit het centrale kanaal alleen in de richting van SMC-medium. (e, f) laagvermogen fluorescentie beeld van de linker (e) of rechts; (F) kanaal op 48 uur na kleuring met Hoechst 33342. (g) High-power fluorescentie beeld van het linker kanaal in Paneel (e); het zwarte vierkant zonder cellen in de buurt van de rechterkant van het beeld (sterretje) is een structurele paal die het beginpunt voor de migratie markeert. h) voorbeeld van de migratieanalyse. Een verticale rode lijn geeft het beginpunt aan; de afstand van het beginpunt tot het centrum van elke celkern wordt gemeten, en de som van al deze individuele metingen wordt de totale migratieafstand met Matlab.
Collageen type I (Invitrogen) wordt gebruikt om het kanaal tussen centrale en zijputten te vullen en is het substraat waardoor cellen migreren. Zowel 1 mg/mL als 2 mg/mL collageen kan worden gebruikt. Hoewel 1 mg/mL collageen resulteert in iets hogere niet-specifieke achtergrondcel chemokinese en gellading technisch moeilijker is dan met 2 mg/mL collageen, laat de lagere collageenconcentratie een grotere migratie van primaire culturen van SMC toe en is de testgevoeligheid beter. Tenzij anders vermeld, was de concentratie collageen in de migratiekanalen 1 mg / mL voor alle experimenten.
2.7. Statistische analyse
statistische vergelijkingen werden gemaakt met behulp van Student-test of one-way ANOVA. Betekenis werd gedefinieerd op het niveau.
3. Resultaten en discussie
zoals getoond in Figuur 3 (a) wordt de celproliferatie geblokkeerd door MMC-behandeling. Er is tot 48 uur na de behandeling geen significant verschil in levensvatbaarheid van de cellen tussen met MMC behandelde SMC (%) en onbehandelde SMC ( % ). Aldus, vertegenwoordigt de celaccumulatie in de diverse migratieanalyses ware celbeweging zonder enige component van celproliferatie. Dit is belangrijk omdat zonder MMC-behandeling de migratieindices van incubaties op lange termijn door samenvallende cellulaire proliferatie kunnen worden verward.
(a)
b)
(c)
d)
(a)
(b)
c)
d)
Cel migratie in de scratch en Boyden kamer assays. a) mitomycine-C (MMC) remming van SMC proliferatie. SMC behandeld met of zonder MMC (40 µg/mL gedurende 30 min bij 37°C) werden geplateerd in 6-Wells platen en vervolgens geoogst. Na 1 uur, 24 uur en 48 uur werden de celtellingen handmatig op een hemocytometer uitgevoerd; celtellingen worden uitgedrukt als de gemiddelde ± één standaardafwijking van triplicaten. Trypan blue exclusion vertoonde geen verschillen in levensvatbaarheid van cellen over 48 uur (%). MMC-behandeling leidt tot stabiele aantallen cellen verzameld bij 24 uur en 48 uur met een significant verhoogde proliferatie in de niet-MMC-behandelde populaties (). b) Scratch-test; er worden geen verschillen gezien in de mate van migratie tussen cellen die in geen chemokine gekweekt zijn versus 25-100 ng/mL PDGF; gedurende de 3-6 uur van deze test wordt geen significant verschil gezien tussen controlecellen en met MMC behandelde cellen. (C) Transwell assay; verschillende concentraties van PDGF werden toegevoegd aan de onderste kamer van transwell apparaten op tijdstip nul; cellen op het onderste aspect van de transwell insert werden geteld na 6 uur, 12 uur, of 24 uur. Vergeleken met geen PDGF in de onderste kamer, waren er significant grotere aantallen gemigreerde cellen in de PDGF-groep van 10 ng/mL, 25 ng/mL en 50 ng/mL na 12 uur (). Na 24 uur waren gemigreerde celaantallen in transwells met 5-50 ng/mL PDGF niet significant verschillend ten opzichte van kamers zonder PDGF. Na 24 uur waren gemigreerde celaantallen wanneer 100 ng/mL PDGF aanwezig was in de onderste kamer significant verminderd ten opzichte van de controlegroep 0 ng/mL PDGF. d) Chemokinese in transwells; dezelfde concentratie van 50 ng/mL PDGF werd geladen in de onderste kamer, de bovenste kamer of zowel de onderste als de bovenste kamer; celmigratie werd geanalyseerd na 6 uur, 12 uur of 24 uur. ten opzichte van geen PDGF in beide kamers was de celmigratie significant groter met 50 ng/mL in de onderste kamer na 12 uur (); na 24 uur was er geen significant verschil tussen controlekamers en 50 ng/mL PDGF. Met name het toevoegen van PDGF aan de bovenste kamer, met of zonder PDGF in de onderste kamer, leidde tot een significant verhoogde migratie na 12 uur ten opzichte van PDGF in de onderste kamer alleen ().
In scratch assays (Figuur 3 (b)) met primaire SMC-culturen, migreerden cellen willekeurig (chemokinese) om de defecten in vergelijkbare snelheden op te vullen, ongeacht de PDGF-concentratie, inclusief zonder chemotactisch agens. Zonder MMC behandeling, wonddefecten hebben de neiging om iets eerder te sluiten, wat wijst op een element van celproliferatie.
Figuur 3 (c) toont de migratieresultaten voor SMC met behulp van de Boyden chamber transwell assay. Het vroege (12 uur) tijdstip toont een kleine maar significant verhoogde migratie in reactie op 10-50 ng/mL PDGF versus geen chemokine in de bodemput. Er was echter geen waarneembaar verschil in migratie over een 10-voudige concentratiebereik van PDGF, wat erop wijst dat de assay relatief ongevoelig is, althans voor primaire SMC-culturen. Bovendien zijn er na 24 uur geen verschillen tussen de chemokineconcentraties (met inbegrip van de mediumcontrole), wat erop wijst dat de migratie op dit tijdstip niet specifiek is zodra de cytokineconcentraties tussen de bovenste en de onderste putjes beginnen te equilibreren.
om formeel aan te tonen dat migratie door het membraan in de bovenste put niet noodzakelijk te wijten is aan gerichte chemotaxis, werd PDGF aan de bovenste put toegevoegd, met of zonder PDGF in het onderste compartiment. Zelfs bij afwezigheid van een chemokine gradiënt leidde PDGF in de bovenkamer tot een duidelijk verhoogde transmigratie (Figuur 3(d)); Dit kan alleen worden toegeschreven aan een verhoogde chemokinese.
De transwell-experimenten suggereren dus dat, hoewel initiële PDGF-concentratieverschillen een zekere mate van verhoogde celmigratie naar hogere concentraties in de lagere putjes kunnen veroorzaken, latere PDGF-diffusie leidt tot willekeurige chemokinese.
ter vergelijking, dosis-respons experimenten met behulp van de microfluïdische apparaten (Figuur 4) tonen significante chemotaxis bij concentraties zo laag als 2.5 ng/mL PDGF(Figuur 4 (b)), en vertonen een dosisafhankelijke toename van chemotaxis met een piek van ongeveer 25-50 ng/mL(Figuur 4 (a)). Interessant is dat hogere concentraties van PDGF (bijv. 100 ng / mL) leiden tot minder migratie, wat overeenkomt met een hoge dosis chemotaxisstilstand (18). Zonder voorafgaande MMC-behandeling is de migratie-index groter(figuur 4 (A)), waardoor de niet-begrijpelijke bijdrage van proliferatie aan “schijnbare” chemotaxis bij langere testtijden wordt benadrukt. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or “gold standard” Boyden chamber approaches.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Microfluidic device assay. (a) dosis-respons curven met en zonder voorafgaande MMC-behandeling. MMC-behandelde en niet-behandelde SMC werden in zijcelputten geplaatst, met verschillende concentraties PDGF (5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL en 100 ng/mL) aanwezig in de centrale bronputten. De migratie werd gemeten na de kleuring en fluorescentiemicroscopie van Hoechst 33342 na 48 uur, waarbij het Matlab-programma werd gebruikt om de totale migratie te berekenen. Controles (alleen SMC-medium) en elke concentratie PDGF werden geëvalueerd in drievoudige apparaten. Er kunnen significante verschillen worden gezien van 5 ng/mL tot 100 ng/mL PDGF in vergelijking met de controlegroep (). B) Chemokinese versus chemotaxis in microfluïdische hulpmiddelen. MMC-behandelde SMC met of zonder 2,5 ng / mL PDGF werden geplateerd in de centrale celput; 2,5 ng/mL of 50 ng/mL PDGF werden toegevoegd aan de bronputten aan de zijkant. Aangezien er geen PDGF aanwezig is in de centrale celput, toont de test een significant grotere totale migratie na 48 uur met 50 ng/mL in de bronput (“0-50”) versus 2,5 ng/mL in de bronput (“0-2, 5”). De aanwezigheid van 2,5 ng / mL PDGF in de centrale cel goed leidt tot beduidend grotere totale migratie wanneer er een concentratiegradiënt (“2,5-50”; ) toe te schrijven aan een lokaal chemokinese-effect. Bij afwezigheid van een gradiënt (“2,5–2,5”) is er een chemokinese-geassocieerde migratie die significant kleiner is dan de migratie die wordt waargenomen wanneer een gradiënt aanwezig is (“0-2, 5”;). (C) tijdsverloop experiment uitgevoerd als paneel (b).
het microfluïdische hulpmiddel kan niet alleen worden gebruikt voor het meten van chemotaxis, maar het kan ook specifiek de bijdragen van chemokinese en chemotaxis aan migratie onderscheiden (Figuur 4(b)). Dus, bij afwezigheid van een chemokine gradiënt (bijv., 2.5 ng / mL PDGF in zowel centrale als zijputten), weerspiegelt de migratieindex chemokinese. In vergelijking, met geen PDGF in de middenput en 2,5 ng/mL in de zijput, weerspiegelt de migratieindex gerichte chemotaxis. Het microfluïdische apparaat kan ook chemotaxis beoordelen in aanwezigheid van bestaande chemokinese, zoals wanneer het centrum goed 2,5 ng/mL PDGF bevat en de zijkant goed 50 ng/mL bevat. Er is een kleine maar statistisch Grotere migratie wanneer de stimulus een chemotactische gradiënt is in plaats van eenvoudige chemokinese.
aangezien de chemokine-gradiënt binnen 2 uur (17) is vastgesteld en gedurende enkele dagen stabiel is, kunnen cellen de concentratiegradiënt in de loop van de tijd continu migreren (Figuur 4(c)). In vergelijking, hebben andere klassieke methodes geen concentratiegradiënt (scratch assay) of slechts een voorbijgaande chemokine gradiënt, zodat chemokinese-eerder dan gerichte chemotaxis-in toenemende mate bijdraagt.
het microfluïdische hulpmiddel dat in dit werk wordt gerapporteerd, is in een aantal opzichten superieur in vergelijking met andere in vitro benaderingen die eerder werden gebruikt om chemotaxis te bestuderen. In het bijzonder is de Boyden—kamer—met een chemokine gradiënt over een poreus membraan-een standaard chemotactische test sinds de jaren 1950. dit apparaat heeft echter significante beperkingen in die gradiënten zijn noch stabiel, noch lineair, met een eerste scherpe concentratie stap omhoog die geleidelijk verslechtert in de tijd. Recenter werden de micro-elektromechanische systemen (MEMS) technologieën ontwikkeld die microfluidic biochips gebruiken om in vivo voorwaarden na te bootsen; in deze apparaten, worden de cellen voortdurend blootgesteld aan afschuifkrachten onder gecontroleerde stroom. De continue stroom van deze apparaten vormt echter een uitdaging voor het behoud van stabiele chemokine gradiënten. Hoewel hydrogels tussen de bron en het zinkkanaal lineaire concentratiegradiënten kunnen creëren, kunnen subtiele variaties in de putten en kanalen drukgradiënten veroorzaken die de gradiënten verstoren door interstitiële stroom ; bovendien heeft de continue stroom van de apparaten de neiging om chemoattractanten te verdunnen die door celbronnen worden afgescheiden. In de nieuwe microfluïdische apparaat eerder beschreven en gevalideerd voor gladde spiercel migratie in dit document, grote volume bron en spoelputten handhaven stabiele chemokine gradiënten in de verbindende hydrogel; elke interstitiële stroom wordt geëlimineerd door het aansluiten van de bron en spoelputten met extra kanalen en reservoirs die dienen als een weerstand-condensator circuit. De concentratiegradiënten zijn dus gedurende enkele dagen stabiel en lineair. Het huidige werk heeft de toepassing verder verfijnd, waarbij mitomycine-C-behandeling is opgenomen om de verstorende bijdrage van proliferatie te verminderen en aangetoond hoe chemotaxis en chemokinese in dezelfde experimentele opstelling kunnen worden beoordeeld.
belangenconflict
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het BWh-Bri-fonds voor het ondersteunen van onderzoeksexpertise-Bridge-onderzoeksbeurs. Chen Zhang werd gesteund door China Scholarship Council voor 18 maanden. Ovid C. Amati en Richard T. Lee werd gedeeltelijk ondersteund door het NSF Science and Technology Center CBET-0939511.
