verbindingen

ALDH1A1-inhibitors is onlangs beschreven30. Ldha-remmers werden eerder beschreven in Rai et al.29. IDH1-remmers werden eerder beschreven in Urban et al. en Davis et al.24,36. Andere stoffen die in de studie werden gebruikt waren methotrexaat (MedChem Express, HY-14519), Panobinostat (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Isofagomine (Toronto Research Chemicals #I816010), Lumacaftor (BioVision #2857) en LY2857785 (Medchem Express, HY12293). Voor qHTS werden verbindingen in de ondervragingsplaat van het mechanisme (MIPE) getest in 11 punten (intraplaat, verdunningsfactor 1:3). De verzameling kinaseremmers met 977 kinaseremmers werd getest in doses van 7 punten (interplate, 1:5 verdunningsfactor). In alle gevallen werd DMSO als voertuig gebruikt.

klonen

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Open Reading Frames (ORF ‘ s) van de genen van belang werden gekloond in de acceptor backbones met behulp van BamHI/EcoRI (N-terminal) of NheI/BamHI (C-terminal) locaties door PCR versterking van de codering gebied met Infusiecompatibele oligonucleotiden, in detail gedefinieerd in aanvullende tabel S1. IDH1, LDHA, DHFR, GC, en ALDH1A1 constructies werden bereid door GeneArt Gen synthese (ThermoFisher) in pcDNA3.1 (+). Voor Gateway cloning (IDH2 construeert alleen), werd een doelvector met de 86B tag aangemaakt door de V5 tag te vervangen in pcDNA3.2-V5/DEST. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ‘scar’ after the final amino acid of the ORF, which encodes “LPTFLYKVVDLEGPR” prior to the 86b tag.

celculturen

HEK293T, LN18, OV-90, HeLa, 22RV1, MDA-MB-468 en HT-29 cellen werden verkregen uit ATCC (respectievelijk CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 en HTB-38). HuCC-T1 en CC-LP-1 waren een geschenk van Dr.N. Bardeesy (Massachusetts General Hospital, Boston). HEK293T-cellen werden gekweekt in DMEM (4,5 G / L glucose) met 10% foetaal runderserum (FBS), 6 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 50 U/mL penicilline en 50 µg/mL streptomycine. LN18, HT-29, CC-LP-1 en HeLa cellen werden gekweekt in het bovenstaande medium, zonder natriumpyruvaat. OV-90 cellen werden gekweekt in een 1: 1 mengsel van MCDB 105 medium (Cell Applications Inc.) en m199 medium (HyClone, GE), aangevuld met 15% FBS, 1% penicilline-streptomycine (Life Technologies) en een eindconcentratie van 1,85 g/L natriumbicarbonaat (HyClone, GE). 22RV1, HuCC-T1 en MDA-MB-468 cellen werden gekweekt in RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS, 6 mM L-glutamine, 100 eenheden/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine. Alle cellen werden gekweekt bij 37 °C in een bevochtigde incubator die op 5% CO2 werd gehouden en werden negatief getest op mycoplasma met behulp van een MycoAlert detection kit (Lonza).

productie en zuivering van Recombinant eiwitten en peptiden

11S en 86b eiwitten werden geproduceerd door GenScript. Voor recombinant 11S fragment, werd de opeenvolging van codagedna aan een 6x zijn markering gesmolten om stroomafwaartse zuivering te vergemakkelijken en de opeenvolging werd gesubcloneerd in een E. coli uitdrukkingsvector. BL21 Star (de3) cellen werden getransformeerd met recombinante plasmiden en een enkele kolonie werd geïnoculeerd in LB medium met IPTG voor inductie van eiwitexpressie. SDS-PAGE en Western blot analyse werden gebruikt om de expressie te monitoren en optimale oogsttijd te selecteren. De cellen werden geoogst door middel van centrifugering en de pellets werden gelyseerd door sonicatie. Na de zuivering werden fracties gesteriliseerd door een filter van 0,22 µm. Eiwitten werden geanalyseerd door SDS-PAGE en Western blot met behulp van standaardprotocollen en een muis-anti-His mAb (Genscript, Cat.nr.A00186). de concentratie van gezuiverd eiwit werd bepaald met behulp van een Bradford proteïne assay met BSA als standaard. Eiwit werd opgeslagen in 1X PBS, 10% glycerol, pH 7,4, en de zuiverheid was ongeveer 90%, zoals geschat door densitometrische analyse van de Coomassie blauwgekleurde SDS-PAGE gel onder reducerende omstandigheden. Het 15 aminozuur 86b peptide werd opgeslagen in ultrapure dH2O en was 99,9% zuiver door HPLC.

lage doorvoer (96-wells PCR-platen of-strips) CETSA complementatietest

cellen werden getransfecteerd in schotels met 6 boorputten met behulp van een omgekeerde transfectieprocedure, waarbij 1,25 ml complexen (6,25 µL Lipofectamine 2000 en 3 µg DNA per boorput) werd gecombineerd met 1,25 ml hek293t-celsuspensie (1 × 106 / mL, 1,25 × 106 cellen totaal). Voor CDK9 werd 2 µg DNA per put gebruikt. Na 24 uur (48 uur voor CDK9) werden cellen geoogst door trypsinisatie en geresuspendeerd in 1 × 106 cellen/mL (tenzij anders aangegeven) in CETSA-buffer die DPBS bevat (met CaCl2 en MgCl2) plus 1 G/L glucose, 1x Halt protease inhibitor cocktail (ThermoFisher), en 0,5% DMSO (DMSO werd niet toegevoegd voor experimenten die vervolgens een verbinding en een vehiculumbehandeling kregen). Voor experimenten met temperatuurbereiken (zonder verbinding of enkelvoudige dosis) werden monsters aliquoteerd in PCR-strips met 30 µL per buis. De verbinding werd toegevoegd en de cellen werden bij 37 °C gedurende 1 uur geïncubeerd. de monsters werden vervolgens gedurende 3 uur verhit.5 minuten met behulp van een voorverwarmde thermische cycler, toegestaan om te equilibreren tot kamertemperatuur, en 6 µL van 6% NP40 werd toegevoegd aan elk putje. Voor freeze-thaw experimenten werden buizen geplaatst in een aluminium PCR-blok op een droogijs / ethanol bad gedurende 3 min gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 3 min, vortexing gedurende 3 sec, en herhalen deze stappen drie extra keer. 11S (GenScript) en furimazine-substraat (uit Nano-Glo Luciferase Assay System, Promega) werden toegevoegd, bij uiteindelijke concentraties van 100 nM en 0.5X, respectievelijk, en monsters werden geanalyseerd op luminescentie intensiteit met behulp van een ViewLux High-throughput CCD imager (Perkin Elmer) uitgerust met heldere filters.

384-well CETSA assay

cellen werden getransfecteerd in T75 kolven met behulp van een omgekeerde transfectieprocedure, waarbij 9 mL complexen (45 µL Lipofectamine 2000 en 22,5 µg DNA) werd gecombineerd met 10 mL hek293t-celsuspensie (1 × 106 cellen / mL, 10 miljoen cellen in totaal). Na 24 uur werden cellen geoogst door trypsinisatie, geresuspendeerd in 1 × 106 cellen / ml zoals hierboven beschreven en gedoseerd (15 µL cellen/putje) in 384-wells PCR-platen (Roche) met behulp van een Multidrop Combi (ThermoFisher). Compounds (63 nL) of DMSO vehicle control (63 nL) werden vervolgens gepind met behulp van een pin tool (GNF) en geïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 °C. platen werden verzegeld en verwarmd bij de aangegeven temperatuur gedurende 3,5 min en gekoeld tot 25 °C met behulp van AB qPCR machine (Roche) met opritsnelheid van 1,5 °C/sec voor de verwarmingsfase en max opritsnelheid voor de koelfase. Drie µL van 6% NP40 werden per putje toegevoegd en gedurende 30 minuten geïncubeerd om cellysis mogelijk te maken, gevolgd door toevoeging van 11S en furimazine-substraat (bij eindconcentraties van respectievelijk 100 nM en 0,5 X). Monsters werden geanalyseerd op luminescentie intensiteit met behulp van een ViewLux reader.

1.536-well CETSA assay

cellen werden getransfecteerd en geoogst zoals hierboven beschreven (384-well protocol). Cellen werden verdeeld (5 µL cel/putje) in 1536-put witte platen (Aurora, cyclisch olefine polymeer, kat# EWB041000A) met behulp van een Multidrop Combi. Verbindingen (23 nL) werden vervolgens gepind met behulp van een pin tool (Wako Automation) en geïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 °C. platen werden verwarmd bij de aangegeven temperatuur en tijd met behulp van een verwarmingsblok (zie hieronder) en afgekoeld tot 25 °C. per putje werd een µL van 6% NP40 toegevoegd en platen werden gedurende 30 minuten geïncubeerd om cellysis mogelijk te maken, gevolgd door toevoeging van 3 µL 11S (eindconcentratie 100 nM) en furimazine-substraat. Platen werden gecentrifugeerd en geanalyseerd op luminescentie intensiteit met behulp van een ViewLux reader. Voor de ldha-en CDK9-schermen, een eindconcentratie van 0,5 X en 0.Er werd respectievelijk 25X furimazine gebruikt. Normalisatie controles omvatten DMSO en gsk2837808a-behandelde monsters of onverwarmde monsters voor ldha en CDK9, respectievelijk. Het CDK9 tegenscherm werd uitgevoerd zoals hierboven met de volgende verschillen: 5 µL niet-getransfecteerde HEK293T-cellen (1 × 106/mL in CETSA-buffer) werden toegediend in 1536-putplaten, gevolgd door toevoeging van een verbinding, incubatie bij 37 °C, verhitting en lysis-stappen zoals hierboven. Vervolgens werd 500 pM (laatste) van 86b toegevoegd aan de putten, gevolgd door toevoeging van 100 nM 11S en 0,25 X furimazine substraat (laatste).

het aluminium blok voor het verwarmen van een 1536-putplaat werd ontworpen door het meten van een plaat om de afmetingen van het gebied te bepalen dat wordt begrensd door gegoten-in wapeningsribben in X en Y, en de bodem van de put en de Bodemflens in Z. vervolgens werd een blok gevormd dat moet worden bewerkt uit 6061 T6 aluminiumplaat, wat een vrije pasvorm zou zijn met ongeveer 0,5 mm speling voor de plaat in alle assen. Het blok werd bewerkt met behulp van een handmatige verticale freesmachine, eindmolens en een vlakmolen. Voor oven het verwarmen experimenten, werden de platen geplaatst in middelste rek van de oven van het convectielaboratorium (ThermoFisher) en behandeld met metaaldeksels om verdamping te minimaliseren.

CETSA in cellulaire lysaten

cellen werden verzameld in CETSA-buffer bij 1,0 × 106 cellen / mL (zoals hierboven beschreven) en NP40 werd toegevoegd aan een uiteindelijke concentratie van 0,4%. Na 30 minuten (kamertemperatuur) de monsters end-over-end te hebben gedraaid, werden lysaten geklaard door centrifugering bij 20.000 × g gedurende 10 min (4 oC). Cofactor (b. v. NAD+) werd toegevoegd aan het geklaarde lysaat. Voor temperatuurresponsexperimenten werd 25 µL lysaat overgebracht naar PCR-buizen en gedurende 3,5 minuten verwarmd tot verschillende temperaturen. Voor isothermische dosis-respons experimenten werd 5 µL geklaard lysaat toegediend aan 1536-Wells platen met behulp van een bioraptr FRD werkstation en monsters werden verwarmd op een aluminium blok. Monsters mochten equilibreren tot kamertemperatuur en substraat werd toegevoegd (uiteindelijke concentratie: 100 nM 11S, 0,5 X furimazine). Luminescentie werd vastgelegd met behulp van een ViewLux imager zoals hierboven beschreven.

Western blots

monsters werden verwerkt zoals beschreven in low-throughput complementation assay sectie, gebruik makend van freeze-thaw cycli voor lysis. Lysaten werden gecentrifugeerd bij 15.200 × g gedurende 20 min bij 4 °C. monsters werden uitgevoerd op een 4-12% Bis-Tris NuPAGE gel (ThermoFisher) met behulp van MOPS-buffer en overgebracht naar een PVDF-membraan met behulp van een iBlot 2-transfersysteem bij 25 V gedurende 7 min. Membranen werden geblokkeerd met een 5% melkoplossing (50 mM Tris HCl, pH6; 150 mM NaCl; 0,1% Tween-20) en primaire antilichamen werden ‘ s nachts geïncubeerd bij 4 °C in blokkerende oplossing. Antilichamen waren: anti-IDH1 (, Cell Signaling # 8137, 1: 500), anti-IDH1(R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), anti-LDHA (, Cell Signaling #3582, 1:1000). Anti-konijn/muis-HRP (konijn = Cell Signaling 7074; muis = Cell Signaling # 7076) werd toegevoegd om 1:2500 en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Een chemiluminescent signaal werd gegenereerd met supersignal west dura solution (ThermoFisher) en vastgelegd met behulp van een Biorad Chemidoc systeem. Densitometrische analyse werd uitgevoerd met behulp van Photoshop-software (Adobe).

2-Hg-assay

HEK293T-cellen keren getransfecteerd in 24 putschalen door 2 toe te voegen.5 × 105 cellen op transfectie complexen (0,75 µg plasmide DNA, 1,5 µL Lipofectamine 2000 per putje). Celkweekmedium werd verzameld na 72 uur en 15 µL werd overgebracht naar 384-goed ondoorzichtige plaat. Aan elk putje werd 1,5 µL HCl van 660 mM toegevoegd en de monsters werden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Aan elk putje werd 1,5 µL Tris-HCl-base van 720 mM toegevoegd. Vervolgens 52 µL 2-Hg detectieoplossing (100 mM HEPES (pH 8,0), 100 µM NAD+, 1 µg/mL actief recombinant d-2-Hydroxyglutaraat dehydrogenase (D2HGDH; Biovision, Cat: P1001), 5 µM resazurine, 0,03 mg/mL diaforase (Sigma, Cat: D5540) werd toegevoegd en de plaat werd bij kamertemperatuur geïncubeerd. Een standaardkromme van 2 HG werd bereid in HEPES van 100 mM (pH 8,0). Fluorescentie werd gemeten op een ViewLux reader met behulp van Ex: 525, Em: 598/25 filters.

biochemische assays

De ldha biochemische assay werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 29. Kort, 3 µL humaan lactaatdehydrogenase 5 (2 nM definitief) (no. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) in LDH assay buffer (200 mM Tris HCl, pH 7,4, 100 µM EDTA, en 0,01% Tween-20) werd toegevoegd aan een zwarte vaste bodem 1536-well assay plaat (Greiner Bio-One). Na de overdracht van de samengestelde pin (23 nL) werd 1 µL substraatoplossing met NADH (0,06 mM final) en natriumpyruvaat (0,2 mM final) (Sigma-Aldrich) in de LDH assaybuffer toegediend om de reactie te starten. Na 5 minuten incubatie bij kamertemperatuur werd 1 µL detectiereagens aan elk putje toegevoegd. De platen werden onmiddellijk overgebracht naar een ViewLux-lezer en de resulterende resorufine-fluorescentie werd gemeten (ex 540 nm, em 590 nm) bij 0 en 10 min. De fluorescentie werd genormaliseerd met behulp van enzyme-vrije en DMSO-behandelde controleputten op elke plaat.

De ALDH1A1 biochemische test met niet-gemerkt eiwit werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 31,37. Kort, 3 µL van 20 nM gezuiverde humane ALDH1A1 in assay buffer (100 mM HEPES pH 7,5 met 0,01% Tween 20) werden toegediend in een 1,536-goed vaste bodem zwarte plaat (Greiner Bio One). 23 nl van verbindingen of controle Bay 11-7085 werden overgedragen via pin tool (Wako Automation). De monsters werden gedurende 15 minuten geïncubeerd (kamertemperatuur, beschermd tegen licht), gevolgd door een substraat van 1 µL toevoeging van NAD + en Propionaldehyde (eindconcentraties van respectievelijk 1 mM en 80 µM). De platen werden gecentrifugeerd en in kinetische modus afgelezen op een ViewLux-imager met 340 nm excitatie, 450 nm emissiefilters gedurende 5 minuten. De verandering in fluorescentieintensiteit gedurende 5 min werd genormaliseerd gebruikend enzymvrije en DMSO-behandelde controleputten op elke plaat.

De TR-FRET Lanthascreen Eu Kinase Binding assay voor CDK9 / cyclin K werd gekocht bij ThermoFisher en uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Kort, 4 µL van een master mix met 4 nM CDK9/Cyclin K (Invitrogen #PV4335), 2 nM biotine Anti-His Ab, 2 nM Eu-Streptavidin, en 10 nM Kinase Tracer 236 oplossing in 1x Kinase Buffer werden toegediend in Greiner 1,536-goed witte medium bindplaten met behulp van een bioraptr FRD werkstation. Drieëntwintig nL van samenstelling en controles (DMSO en LY2857785 bij een uiteindelijke concentratie van 6 µM) werden onmiddellijk aan de testplaten via de overdracht van het speldhulpmiddel geleverd. De platen mochten 1 uur incuberen bij kamertemperatuur, en de TR-FRET fluorescentie werd vervolgens gemeten met een PerkinElmer Envision Multilabel plate reader (Ex: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; vertragingstijd 100 µs; integratietijd 200 µs).

Lactaatproductietest

HEK293T-cellen werden gekweekt zoals hierboven beschreven. Cellen werden gespoeld met PBS, trypsinized en geresuspendeerd in fenol red free DMEM (Life Technologies) zonder supplementen. Cellen werden onmiddellijk geplateerd tot 1536-well zwarte heldere bodemplaten (Corning) bij 250 cellen per well in 4 µL volume. Verbinding of voertuig controle werd toegevoegd aan putten via pin tool transfer en cellen werden geïncubeerd bij 37 °C gedurende 1 uur. twee µL lactaat reactiemengsel (Biovision K607-100) werd toegevoegd aan elk putje en platen werden bedekt en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. De fluorescentie werd gemeten met een ViewLux microplaatbeeldcamera uitgerust met Ex / Em 528/598 nm filters.

aldefluor assay

voor de initiële bepaling van 86B-gelabelde ALDH1A1-activiteit werden cellen getransfecteerd met behulp van een omgekeerde transfectieprocedure, waarbij 1 mL complexen (6 µL Lipofectamine 2000 en 3 µg DNA) werd gecombineerd met 1 mL LN18-celsuspensie (5 × 105/mL) en 100 µL/put van het mengsel werd toegediend in zwarte, heldere bodemplaten met 96 wells (Corning). Na 24 uur werden media verwijderd en vervangen door 100 µL Aldefluorbuffer (STEMCELL-technologieën) met BAAA-substraat en Hoechst 33342 (ThermoFisher, eindconcentraties van respectievelijk 500 nM en 0,5 nM). Vervolgens werd DMSO of DEAB (1 µM final) toegevoegd en werden de platen gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd om de omzetting van BAAA in BAA mogelijk te maken. Cellen werden gewassen en 100 µL/putje aldefluorbuffer werd toegediend vóór beeldvorming op een in-cel 2200 (GE Healthcare). Voor high-throughput assays, werden LN18 cellen getransfecteerd in T75 kolven met behulp van een omgekeerde transfectieprocedure zoals hierboven beschreven voor high-throughput HEK293T CETSA assays. Na 16 uur werden cellen geoogst en geplateerd (1.000 cellen / put / 5 µL) in zwarte, optische kwaliteit heldere bodem, TC behandelde 1,536-put platen (Aurora microplaten) met behulp van een Multidrop Combi dispenser en geïncubeerd ‘ s nachts bij 37 °C. De High-content Aldefluor assay werd vervolgens uitgevoerd op getransfecteerde LN18 cellen of niet-getransfecteerde OV-90 zoals eerder beschreven 31. Beelden werden geanalyseerd met behulp van de in Cell Investigator v1.6.2 Analyse Software ‘ s canned Multi-Target analyse algoritme (GE Healthcare) zoals beschreven.

Membraanthermische integriteitstest

30.000 HEK293T-cellen werden bereid in 30 µL CETSA-buffer met 1x proteaseremmercocktail (ThermoFisher) aangevuld met 0,5% DMSO (1,5% DMSO totaal). Voor het DMSO-tolerantieexperiment werd DMSO toegevoegd aan DPBS bij 0, 1, 2 of 3%. Cel suspensies werden verwarmd voor 3,5 min bij 42 tot 74 °C, met behulp van 4 graden intervallen, vervolgens verwijderd naar een aluminium blok op nat ijs. Celsuspensies werden gemengd met gelijke delen Trypan Blue (LONZA) (=0,2% trypan blue) en werden onmiddellijk geteld met behulp van een C-chip hemocytometer (iNCyto, Korea). Trypan positief (permeabiliseerd) en negatief (intact) werden geteld, met n = 2 bij elke temperatuur. Voor extra cellijnen werden 1 miljoen cellen bereid in 100 µL fenolrood vrij DMEM met 1% DMSO. Cellen werden gedurende 3 minuten verwarmd over 42 tot 90 °C met intervallen van 4 graden, vervolgens verwijderd naar een aluminium blok op nat ijs. Membraanintegriteit werd beoordeeld zoals hierboven beschreven.

PAMPA

De roermethode met dubbele spoelbak Pampa, gepatenteerd door pion Inc. (Billerica, MA) werd gebruikt om de samengestelde permeabiliteit te meten, zoals eerder beschreven 38. De verbindingen werden verdund in donor-en acceptoroplossingen gebufferd tot pH7.4 en de DMSO-concentratie was 0,5%. Permeabiliteitsberekeningen werden uitgevoerd met behulp van Pion Inc. software.

qHTS analyse

gegevens van elke assay werden genormaliseerd plaat-wise naar overeenkomstige controles zoals eerder beschreven 39. Dezelfde controles werden ook gebruikt voor de berekening van de Z’ factor voor elke bepaling. Het percentage activiteit werd afgeleid met behulp van interne software (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Alle concentratie-responscurves werden gemonteerd en AC50 werd berekend met de GraphPad Prism software; curves werden geclassificeerd zoals eerder beschreven 27. Oppervlakte onder de curve (AUC) werd berekend met behulp van de trapeziumregel om het oppervlak tussen de responscurve en de x-as over het concentratiebereik te benaderen. Voor alle samenstellingen binnen een experiment werden equivalente concentratiebereiken gebruikt. Voor de classificatie van actieve verbindingen werd een cut-off van de werkzaamheid van 3 σ ten opzichte van het gemiddelde (van de vehiculumcontrole) gebruikt.