Dit is de eerste in een driedelige reeks over de transformatie van E. coli. Tegen het einde hiervan moet je een expert zijn op het gebied van E. coli transformatie en op welke stammen je moet kiezen voor verschillende toepassingen. Als je al een expert bent, hoop ik dat het een aangename opfriscursus voor je zal zijn. In beide gevallen kunt u hieronder reageren als u iets toe te voegen.

met behulp van elektriciteit voor Transformatie

vreemd DNA kan worden ingebracht in bevoegde E. coli door elektroporatie of chemische transformatie. Bij gebruik van elektroporatie breng je een elektrische stroom aan over de cel. De stroom wordt verondersteld om kortstondige “poriën” in de celmembranen te creëren, die negatief geladen DNA in de cellen door een elektroforese-type effect dwingt. Om elektro-competente E. coli te maken, grondig wassen van de cellen om alle middelgrote zouten te verwijderen. Dit zorgt ervoor dat de lading niet via het medium wordt geleid. Voer ook de elektroporatie uit bij 0°C om hitteschade aan de cellen te minimaliseren.

chemicaliën: ze werken ook

om chemisch competente cellen te maken en E. coli te resuspenderen in een CaCl2-oplossing bij 0°C. Onder deze voorwaarden, wordt het Ca2+ ion verondersteld om poriën in het membraan tot stand te brengen, band van DNA aan het celmembraan bij te staan en de negatieve last op DNA te maskeren. Samen, vergemakkelijken deze de passage van DNA door het hydrophobic celmembraan. Dwing DNA in de cellen door een korte hitteschok van 42°C toe te passen, wat resulteert in een thermische stroom die DNA in de cellen veegt.

de voor-en nadelen van elke

elektroporatie zijn minder omslachtig dan chemische omzetting en geven over het algemeen een hogere omzettingsefficiëntie (gemeten in kolonies gevormd per microgram DNA). Het is echter duurder. Het vereist een gespecialiseerd apparaat om de lading en cuvetten te leveren om de lading naar de celsuspensie over te brengen. Elektroporatie is gevoelig voor zout – U kunt kostbare monsters verliezen als overtollig zout wordt overgedragen in de cuvet.

persoonlijk geef ik de voorkeur aan chemische transformatie. Hoewel het ongeveer een half uur langer duurt, vind ik dat de resultaten voorspelbaarder zijn en ik vind het leuk dat een groter volume DNA kan worden toegevoegd als de concentratie te laag is. Je kunt het volume van DNA met elektroporatie niet verhogen vanwege het risico van het toevoegen van te veel zout aan de oplossing. Hoewel het vaak geciteerde nadeel van chemische transformatie de lagere efficiëntie is, kunt u nu ultra-competente cellen kopen, zoals Stratagene ’s XL10-goud, dus dit is niet langer zo’ n probleem.

artikelen in deze serie:

• E. coli elektroporatie vs chemische transformatie (dit artikel)
• competente E. coli: kopen of niet kopen?
• het kiezen van een competente E. coli stam

oorspronkelijk gepubliceerd op 18 September 2007. Herzien en bijgewerkt op 11 juli 2016.