bijgedragen door Paul Barber
DNA-extractie via Chelex
Chelex is berucht omdat het zo wispelturig is als het goedkoop en gemakkelijk is. Hier zijn enkele tips voor goede versterkingen: 1. Soms werken monsters het beste als ze onmiddellijk worden gebruikt, soms is het beter om ‘ s nachts te wachten voordat u ze gebruikt. Experimenteer en vind wat werkt voor uw soort. Resultaten kunnen per taxa variëren.2. Bij het doen van initiële PCR ‘ s, doe een seriële verdunning van de sjabloon.De hoeveelheid Chelex-DNA-extractie die in een PCR wordt gebruikt, kan zo hoog zijn als de helft van het volume van de PCR of zo laag als 1 microliter van een 1:10.000-verdunning. Ik vind dat 1 microliter van een 1: 1 goed is voor de meeste toepassingen.3. Als je de eerste keer met een chelex-extract geen versterkingen van je PCR krijgt, herhaal dan de hierboven beschreven procedure vortex, spin, incubate, vortex, spin, sit overnight. Vaak zal dit een negatief PCR werk maken.
methode¶
- met bleekmiddel, steriliseer een droog reagens spatel en een kleine magnetische roerstaaf.
- bereid een mengsel van 5-10 gewichtspercenten Chelex100-hars (biorad-deel) 143- 3832,100-200 mesh Chelex, natriumvorm) en UV-gesteriliseerd HPLC-water. De meest effectieve manier om dit te doen is om een 50 ml steriele falcon tube, plaats in op een schaal in een klein bekerglas en nul de schaal. Voeg vervolgens 5 gram Chelex toe en vul tot 50ml mark met water.
nauwkeurigheid is niet kritiek. Steriele techniek wel.
- plaats een steriele roer in een buis en plaats deze op een magnetische roerder. Chelex vestigt zich snel, dus als de mengmest niet goed gemengd is, zullen uw concentraties en resultaten variabel zijn. Houd de mengmest goed gemengd, aliquot 300-500micro liter in 0,6 of 1,6 ml Eppendorf buizen (opnieuw, steriel) en dop onmiddellijk. Als u toegang tot een laminaire stroom kap, dat is een goede plek om dit alles te doen. U kunt de schaal en roerder afvegen met een 10% bleekoplossing en/of UV steriliseren voor gebruik.
- zet verwarmingsblok aan. Ingesteld op 95°C. vul gaten met water.
- verwijder met een steriele pincet (meerdere keren vlam boven een alcoholbrander om te steriliseren) een klein stukje weefsel uit uw monster. Dit stuk weefsel moet groot genoeg zijn om zichtbaar te zijn, maar niet zo groot dat het gemakkelijk zichtbaar is. Stel je voor dat je een doorsnede van 0,2 mm van een standaard nietje snijdt. Dit is groot genoeg. Te veel weefsel kan uw reacties remmen.
steriliseer de tang tussen de monsters.
- wanneer u klaar bent, maak dan een negatieve Chelexcontrole door uw gesteriliseerde tang in een buis met Chelex-slurry te dompelen.
- Vortexmonster en chelexslurry gedurende 10-15 seconden.
zorg ervoor dat deksels strak worden vastgeklikt voordat u begint.
- Spinmonsters kort bij hoge snelheid in een microcentrifuge
- incubeer monsters gedurende 20 minuten bij 95°C
*bij deze stap kan de bloktemperatuur licht dalen. Deze druppel is normaal. Controleer de tubes tijdens het incuberen om er zeker van te zijn dat deksels er niet zijn afgevallen.*
- Vortexmonsters opnieuw gedurende 10-15 seconden.
voorzichtig omdat stoom de deksel van de centrifugebuis kan ontvouwen. Houd deksels naar beneden.
- Spin buizen opnieuw op hoge snelheid in microcentrifuge.
- de monsters zijn klaar voor gebruik.
gebruikt alleen supernate voor PCR-reacties. Chlex bead zal Taq inactiveren!
deze methode is, met toestemming, gebaseerd op een origineel protocol dat hier beschikbaar is.
