CRBN is efficient degraded by vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs

PROTAC technology uses E3 ligases to destroying target proteins. We vroegen ons dus af of een E3 ligase zelf kan worden ubiquitinated en gedegradeerd door een andere E3 ligase als twee verschillende E3 ligases in de nabijheid worden geplaatst. De afbraakders van VHL kunnen mogelijk erythropoëtine vervangen worden door activering van HIF1a. Om dit te ontwerpen, verbonden wij pomalidomide, een CRBN-richtende molecuul, aan VHL032, een ligase van VHL E3 ligand (Fig. 1 bis). De linker verbond de aminogroep van pomalidomide met de terminale acetylgroep van VH032; omdat deze aan oplosmiddelen blootgestelde gebieden zijn, zou een verbinding tussen hen waarschijnlijk hun band aan elke E3 ligase niet verstoren. Voor de synthese van vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs (Fig. 1B en aanvullende Fig. S1A), 4-fluorothalidomide (1) en vhl ligand (5) werden opgesteld zoals eerder gerapporteerd 33. 4-Fluorothalidomide (1) werd behandeld met vier Amine linkers (2) met een tert-butylestergroep in aanwezigheid van N,n-diisopropylethylamine (DIPEA) in dimethylsulfoxide (DMSO) om een tussenproduct te vormen (3). Na de bescherming van de tert-butylgroep in 3 door behandeling met trifluorazijnzuur (TFA) in dichloormethaan (DCM) werd het zuur (4) gekoppeld aan het vhl-ligand (5 of 7) in aanwezigheid van 1-1H-1,2,3-triazolopyridinium-3-oxidehexafluorofosfaat (HATU) en DIPEA om de PROTACS (6), TD-158, TD-165, TD-343 en TD-487 (8) te verkrijgen.

na behandeling met deze verbindingen hebben we de niveaus van VHL en CRBN onderzocht door middel van Western blot analyse. Behandeling met TD-158, TD-165, of TD-343 veroorzaakte een concentratie-afhankelijke afname van het niveau van CRBN-eiwitten (Fig. 1C, bovenpaneel). De niveaus van zowel de lange vorm van VHL als de korte vorm van VHL namen echter toe, vermoedelijk als gevolg van stabilisatie door de chemisch-eiwitinteractie (Fig. 1C, Boven-Midden en onder-midden panelen) 34. In het geval van behandeling met 10 µM TD-158, werden de CRBN-niveaus hersteld; dit “haak” – effect is een typisch kenmerk dat optreedt in de context van hoge-dosis PROTAC-geïnduceerde eiwitdegradatie9,35,36,37. TD-487, een stereoisomeer van TD-165, slaagde er echter niet in CRBN degradatie te veroorzaken (Fig. 1C). TD-343 bezat relatief zwakke activiteit, wat impliceert dat de opname van zuurstof in de linker protac activiteit remt. Een kwantitatieve reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) analyse toonde aan dat de daling van CRBN niveau geïnduceerd door vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs niet het gevolg was van veranderingen in de mRNA (aanvullende Fig. S1B). De 50% afbraakconcentratie (DC50) en de maximale afbraak (Dmax) waarden werden gemeten voor alle gesynthetiseerde verbindingen. De berekende DC50-en Dmax-waarden voor TD-158 waren 44,5 nM en 97.1%, respectievelijk, en de overeenkomstige waarden voor TD-165 waren 20,4 nM en 99,6% (Fig. 1D en aanvullende Fig. S1D). De kortere linker-bevattende degrader TD-156 (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) vertoonde zwakkere activiteit in vergelijking met TD-165 (aanvullende Fig. S1C). TD-343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%), met zuurstof in de linker, leidde tot inefficiënte afbraak van CRBN. Om het effect van de koppeling met thalidomide te testen, onderzochten we degradatie van CRBN door vhl-CRBN heterodimeriserende PROTACs met een andere koppeling. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%), met een glycolverbinding, en TD-033 (DC50 = 2546,1 nM), met een amideverbinding, vertoonden verminderde crbn-afbraak, terwijl TD-759 (DC50 = 28,8 nM), met een glycineverbinding, een potentie vertoonde die vergelijkbaar is met die van TD-165. Om te bepalen of relatieve eiwitniveaus zouden kunnen bijdragen aan deze bevooroordeelde eiwitdegradatie, behandelden we cellen die vhl, CRBN of beide overexpressieden met TD-158, en analyseerden we CRBN en VHL-niveaus. In alle gevallen werden de CRBN-spiegels verlaagd terwijl de vhl-spiegels gelijk bleven of stegen (Fig. 1E). In tijd-cursus experimenten, TD-158 afgebroken CRBN met meer dan 80% binnen 3 uur en volledig afgebroken na 12 uur (Fig. 1F). TD-158-geïnduceerde crbn afbraak werd ook waargenomen in verschillende menselijke cellijnen (aanvullende Fig. S2A-D).

afbraak van CRBN door vhl-CRBN heterodimeriserende PROTACs is afhankelijk van CRL2VHL

om te controleren of de afbraak van CRBN door TD-158 afhankelijk was van UPS of Cullin-RING ubiquitine ligases (CRL), hebben we bortezomib, een proteasoomremmer, en MLN4924, een neddyleringsremmer getest. Gelijktijdige behandeling met TD-158 en bortezomib of MLN4924 voorkwam de afbraak van CRBN (Fig. 2A en aanvullende Fig. S3A). Zoals verwacht, nam de vorming van de poly-ubiquitinketen duidelijk toe in aanwezigheid van TD-158 (Fig. 2B). Bovendien verzwakte het neerslaan van VHL door klein interfererend RNA (siRNA) TD-158–geïnduceerde CRBN-afbraak in HEK293T-cellen (Fig. 2C). In tegenstelling, de uitdrukking van VHL in 786-o cellen, een vhl-deficiënte niercarcinoom cellijn, herstelde TD-158–geïnduceerde crbn degradatie (Fig. 2D). In lijn met deze resultaten, verhinderde siRNA-gemedieerde neerhalen van Cullin2, een steigereiwit van het CRL2VHL-complex, TD–158-geïnduceerde crbn degradatie (Fig. 2E). Gezamenlijk wijzen deze resultaten erop dat de afbraak van CRBN door vhl-CRBN heterodimeriserende PROTACs afhankelijk is van het CRL2VHL-complex.

efficiënte afbraak door PROTACs vereist de vorming van een ternair complex met het doeleiwit en E3 ligase9,38. Om dit te testen, voerden we co-immunoprecipitatieexperimenten uit. We vonden dat exogeen uitgedrukt vlag-tagged CRBN co-immunoprecipitated endogene VHL in de aanwezigheid van TD-158, maar niet in zijn afwezigheid (Fig. 2F). GST pull-down experimenten die gezuiverde proteã nen gebruiken toonden aan dat CRBN direct met het complex vhl-Elongine B/C in aanwezigheid van TD-158 (Fig. 2G). Bovendien remde de toevoeging van overtollig pomalidomide of VHL ligand de afbraak van TD-158–geïnduceerde CRBN (aanvullende Fig. S3B, C). Exogeen uitgedrukt CRBN Y384 / W386A (AA), een mutant met pomalidomide-binding–defecte16, werd niet afgebroken door TD-158 (aanvullende Fig. S3D). Aldus, suggereren deze gegevens dat de vorming van een ternair complex onder CRBN, VHL, en TD-158 een voorwaarde voor crbn degradatie is.

een globale proteomic analyse toont aan dat TD-158 degradatie van CRBN

induceert om de degradatie van CRBN op een onpartijdige manier te onderzoeken, voerden we een kwantitatieve proteomic analyse uit. Om de secundaire effecten van crbn degradatie te minimaliseren, behandelden we Jurkat-cellen, die CRBN en IMiD neo-substraten tot expressie brachten, met TD-158 of DMSO (vehicle control) gedurende 12 uur. de eiwitten van elk monster werden verteerd en de verteerde peptiden werden geëtiketteerd voor isobarische etikettering gekoppeld aan vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie. Deze analyse identificeerde 7.148 proteã nen die meer dan drie niet-redundante, unieke peptiden bevatten (aanvullende tabel S1). Slechts drie proteã nen—CRBN, CNIH1 en LMBRD2—voldeden aan de criteria van een P-waarde = 0,05 en meer dan een 1,5-voudige verandering. Onder hen was CRBN het enige eiwit dat meer dan 2-voudig veranderde (Fig. 3A). De niveaus van andere componenten van CRL4CRBN-complexen (CUL4A, CUL4B, DDB1 en RBX1) en CRL2VHL-complexen (elongine C, elongine B , CUL2 en RBX1) bleven echter onveranderd (Fig. 3B, C). Interessant is dat de niveaus van eerder gemelde neo-substraten van IMID ‘ s, waaronder Ikzf1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 en ZNF653, niet werden veranderd na behandeling met TD-158 (Fig. 3B) 39,40,41. Deze resultaten werden bevestigd door immunoblotting in Jurkat en verschillende multipel myeloom cellijnen (Fig. 3D en aanvullende Fig. S2A-D).

crbn-afbraak door vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs recapituleert een CRBN-deficiëntie

een endogeen substraat van CRL4CRBN is de glutaminesynthetase GLUL, een sleutelenzym in de biogenese van glutamine. De acetyltransferase CBP/p300 acetyleert twee n-terminale lysineresiduen van GLUL onder omstandigheden met een hoog glutaminegehalte, en de resulterende geacetyleerde GLUL wordt door CRL4CRBN opgevangen en ubiquitineerd en vervolgens door proteasomen22 verwijderd. Om het effect van TD-158 op GLUL-niveaus te onderzoeken, verhongerden we Hep3B-cellen van glutamine gedurende 48 uur en leverden we glutamine opnieuw in aanwezigheid of afwezigheid van TD-158. TD-158 veroorzaakte degradatie van CRBN ongeacht de glutaminestatus, en de niveaus van GLUL daalden langzamer na verloop van tijd in aanwezigheid van TD-158 dan in afwezigheid (Fig. 4A, B). Bovendien, in vivo ubiquitination assays toonden aan dat ubiquitination van GLUL verminderde in aanwezigheid van TD-158 (Fig. 4C). We hebben ook onderzocht of behandeling met TD-165 cellulaire resistentie tegen IMiD oplevert. Twee IMiD-gevoelige cellijnen, WSU-DLCL2 en RPMI8226, werden voorbehandeld met TD-165 of DMSO gedurende 24 uur en vervolgens behandeld met pomalidomide, TD-165, of beide gedurende 3 d. voorbehandeling met TD-165 verminderde de anti-proliferatieve effecten van pomalidomide in beide cellijnen (Fig. 4D, E). Samen geven deze gegevens aan dat CRBN-afbraak door vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs een CRBN-deficiëntie herkapitaliseert.

om de in vivo effecten van vhl-CRBN heterodimeriserende PROTACs te onderzoeken, hebben we geprobeerd te bepalen of TD-165 degradatie van CRBN kan induceren in diermodellen. Hoewel aminozuurresiduen in muis CRBN (mCRBN) die belangrijk zijn voor teratogeniciteit niet behouden worden, werd mCRBN duidelijk afgebroken, zij het in iets mindere mate, door TD-165 in muis embryonale fibroblasten (aanvullende Fig. S4A). Vervolgens hebben we TD-165 intraperitoneaal toegediend aan muizen om te bepalen of TD-165 CRBN degradatie in vivo induceert. Echter, CRBN niveaus werden niet veranderd in de milt, perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC ‘ s), of lever (aanvullende Fig. S4B). Aangezien de farmacokinetiek van TD-165 redelijk is (aanvullende tabel S2), kan deze afwezigheid van een effect worden toegeschreven aan de hoge plasma-eiwitbinding (99,9%) van TD-165 (aanvullende tabel S3).

n-terminaal afgeknotte CRBN wordt niet afgebroken door vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs

om te bepalen welk domein van CRBN belangrijk is voor TD–165–gemedieerde crbn-afbraak, hebben we een reeks crbn-deletie mutanten (D1-D4) gegenereerd, zoals afgebeeld in Fig. 5A. cellen die volledige lengte CRBN of individuele deletie mutanten uitdrukken werden behandeld met DMSO of TD-165, en de cel lysaten werden onderzocht voor degradatie na TD-165 behandeling. Verrassend genoeg werd geen van de vier crbn deletie mutanten gedegradeerd door TD-165, terwijl volledige CRBN efficiënt gedegradeerd werd (Fig. 5B). In het bijzonder, VHL niveaus waren licht verhoogd vermoedelijk als gevolg van de stabilisatie van chemisch-eiwit interactie in de aanwezigheid van TD-165, maar niet veranderd door expressie van afgeknotte CRBN mutanten in de aanwezigheid van TD-165 (Fig. 5B). Een mogelijke verklaring hiervoor is het onvermogen van deletie mutanten om een ternair complex te vormen. De D1-mutant vormde echter wel een ternair complex met TD-165 en VHL (Fig. 5C), en ubiquitination van D1 verhoogd in aanwezigheid van TD-165 (Fig. 5D). We veronderstelden toen dat amino-terminale lysineresiduen van CRBN nodig zijn voor ubiquitination. Om dit idee te testen, hebben we alle drie de lysineresiduen binnen het n-eindpunt van CRBN (a.a. 1-80) vervangen door arginine, individueel en in combinatie, en vervolgens cellysaten onderzocht voor de afbraak van CRBN. TD-158 degradeerde efficiënt alle mutanten in dezelfde mate als wild-type CRBN (Fig. 5E), waaruit blijkt dat de drie lysineresiduen aan het n-eindpunt van CRBN niet nodig zijn voor afbraak geïnduceerd door vhl-CRBN heterodimeriserende PROTACs.

het wanordelijke gebied van het beoogde eiwit is vereist voor efficiënte protac-geïnduceerde afbraak

vervolgens hebben we geprobeerd structurele verschillen te bepalen tussen volledige CRBN en de crbn deletie mutant D1. De N-terminus van CRBN (a.a. 1-80) werd voorspeld om een ontvouwde of intrinsiek wanordelijke regio te bevatten, gebaseerd op een iupred2a-analyse (aanvullende Fig. S5A). Deze wanordelijke regio (a. a. 1-48) was inderdaad niet te onderscheiden in de CRL4CRB-kristalstructuur vanwege zijn flexibiliteit (PDB-vermelding; 6BN7). Er is aangetoond dat de intrinsiek ongeordende regio een van de belangrijkste componenten van de proteasomale degron is en als initiator voor proteasomale proteolysis fungeert25. Als alternatief, in het geval van bolvormige eiwitten zonder een wanordelijk gebied, kan het P97/valosine-bevattende eiwit (p97/VCP) complex de secundaire structuur ontvouwen, waardoor de proteasomale afbraak van de eiwitten wordt vergemakkelijkt. Om de relatie tussen PROTAC-geïnduceerde eiwitdegradatie en het P97/VCP-complex te onderzoeken,hebben we het effect van N2, N4-dibenzylquinazoline-2,4-diamine (DBeQ), een P97/VCP-remmer, op TD–165-geïnduceerde CRBN-afbraak getest. Uit deze experimenten bleek dat de CRBN-afbraak niet werd beïnvloed door DBeQ-behandeling (Fig. 6 bis). De niveaus van DNA-damage-inducable transcript 3 (DDIT-3; CHOP) en lipidated LC-3II, gebruikt als positieve controles, waren verhoogd na behandeling met DBeQ. Neerhalen van p97 door behandeling met siRNA of DBeQ verminderde Erad en autofagie pathways, wat leidde tot upregulatie van CHOP, een gevestigde UPR marker, en accumulatie van LC-3II, een representatieve autofagie marker, respectievelijk (Fig. 6 bis) 42. Daarom, om te onderzoeken of het wanordelijke gebied van CRBN PROTAC-geïnduceerde proteasomale degradatie mogelijk maakt, hebben we het wanordelijke gebied (a.a. 1-80) van CRBN gekoppeld aan D2, D3 en D4 mutanten en de chimerische eiwitten onderzocht op degradatie. Alle chimerische eiwitten, vooral de D4 chimera, werden door TD-165 op een concentratieafhankelijke manier afgebroken (Fig. 6B). De introductie van een CRBN wanordelijk gebied in de n – of C-terminus van VHL leidde echter niet tot degradatie van het fusieeiwit (Fig. 6C), die erop wijst dat de gehechtheid van het wanordelijke gebied voor alle Gerichte proteã nen niet voldoende is. Om dit idee uit te breiden tot degradatie veroorzaakt door andere PROTACs, hebben we arcc4 getest, een eerder gerapporteerde androgeenreceptor (AR) PROTAC43, omdat AR ook een uitgevouwen gebied herbergt aan de N-terminus (a.a. 1-330), zoals bepaald met behulp van de iupred2a analysetool (aanvullende Fig. S5B). Na de behandeling met ARCC4 werd AR zonder de N-terminale wanordelijke regio (ΔN330) minder efficiënt afgebroken dan de volledige AR. Intrigerend verhoogde de gehechtheid van het wanordelijke CRBN-gebied (a.a. 1-80) aan AR ΔN330 het afbraakrendement (Fig. 6D en aanvullende Fig. S5C). In overeenstemming hiermee bevorderde de gehechtheid van het AR wanordelijke gebied (a.a. 1-170) aan CRBN D1 mutant ook proteolyse door TD-165 (Fig. 6E en aanvullende Fig. S5D).

om deze bevindingen verder te versterken, selecteerden we PROTACs met een hoge potentie (DC50 < 1 µM) op basis van een literatuuronderzoek, en analyseerden ze vervolgens voor een intrinsiek ongeordend gebied met behulp van de iupred2a-tool. Interessant is dat twee derde van de geselecteerde PROTAC gerichte eiwitten bleken in het bezit van een verstoorde gebied van meer dan 40 aminozuren, hetzij op één van hun termini of intern (Tabel 1)44, hoewel aminozuursequentie-gebaseerde voorspelling van verstoord of ongestructureerde regio ‘ s geen rekening met andere factoren, zoals eiwit-eiwit interactie of post-translationele modificaties, in consideration44,45,46. In overeenstemming met dit, vhl-Homo-PROTAC is aangetoond dat degradatie van de vhl lange vorm, die een wanordelijk gebied herbergt aan zijn n-eindpunt veroorzaken, maar niet de vhl korte vorm47. Zo ondersteunt dit ons idee dat het wanordelijke gebied van gerichte proteã nen voor efficiënte degradatie door PROTACs wordt vereist.