Systemische agonistisch immunotherapie bij kanker induceert differentiële uitbreiding van CD4 en CD8 T lymfocyten in en perifere lymfoïde organen

een Combinatie van anti-interactie cd40 met IL-2 het is aangetoond veroorzaken een vertraagde groei en regressie over verschillende muriene tumor modellen . Vergelijkbaar met gepubliceerde gegevens met behulp van cellijntumormodellen , leidde de behandeling van het mammary intraepithelial neoplasia-outgrowth (MIN-O) model, een weefseltransplantatielijn, met anti-CD40 en IL-2 immunotherapie (IT) tot significante anti-tumor responsen (P = 0,0057) inclusief regressie bij >50% van de behandelde muizen (aanvullend dossier 1: Figuur S1A). Eerdere studies hebben aangetoond dat deze anti-tumor reacties te wijten zijn aan CD8 T cellen daarom hebben we onderzocht T-cel fenotype in de milt en binnen de tumor en longen (een gemeenschappelijke metastatische site voor veel verschillende tumormodellen). Hoewel we merkten dat de therapie over het algemeen CD8-expansie veroorzaakte over alle organen, merkten we enkele verschillen op in het fenotype van het CD8 T-celgeheugen tussen orgaanplaatsen (aanvullend bestand 1: Figuur S1B-C).

wij en anderen hebben eerder aangetoond dat sterke immunostimulerende therapieën voor kanker krachtige proliferatie van geheugen (CD44high) CD4-en CD8 T-cellen in de milt en lymfeklieren veroorzaken . Er werd ook opgemerkt dat CD4 -, maar niet CD8 -, T-cellen ook door activering veroorzaakte celdood ondergaan in een interferon – (IFN) – γ-afhankelijke manier, resulterend in een onbeduidende algemene uitbreiding van CD4-T-cellen in aantallen in deze zelfde organen in vergelijking met baseline . Deze gegevens werden gegenereerd met behulp van lymfoïde orgaan uitlezingen. Echter, in het licht van fenotypen waargenomen in de min-O lager, met immunotherapie behandelde muizen, kunnen de expansie, activering en apoptose van geactiveerde T-cellen differentieel worden beïnvloed in de perifere weefsels. Daarom hebben we geprobeerd om de T-celactivering verder te karakteriseren en te vergelijken in perifere organen (waar de primaire tumor en/of metastatische laesies kunnen verblijven) en secundaire lymfoïde organen (die vaak worden onderzocht tijdens immunotherapeutische studies om werkingsmechanismen te beoordelen). We evalueerden CD8 en CD4 T cel (Foxp3neg) frequentie, uitbreiding, en apoptose systemisch in zowel lymfoïde en perifere organen. In overeenstemming met eerdere verslagen van onze fractie, zonder de algemene frequentie ervan significant te wijzigen (Fig. 1a), resulteerde anti-CD40/IL-2 immunotherapie in significante uitbreiding van het totale aantal CD8 T cellen in de milten en lymfeklieren (Fig. 1 ter). In overeenstemming met de toename van het totale aantal CD8-cellen werd de frequentie van CD8 T-cellen waarin bromodeoxyuridine (BrdU) in vivo werd opgenomen, significant uitgebreid en het aandeel van apoptotische cellen, zoals beoordeeld door extracellulaire Annexine V-expressie, verschilde niet significant van de controlegroep (Fig.C-D). In tegenstelling, de totale CD4 T-celfrequentie daalde en aantallen veranderden niet significant in vergelijking met controles binnen dezelfde organen (Fig. 1a-b). Terwijl CD4 T cellen zich uitbreidden zoals beoordeeld door brdu incorporatie, ging een significant deel van hen ook door apoptosis (Fig. 1c-d) wat resulteert in een netto onbeduidende verandering in het totale aantal. Deze gegevens waren in overeenstemming met wat eerder werd waargenomen . Toen we niet-lymfoïde organen met inbegrip van longen en lever beoordeelden, zagen we vergelijkbare trends in zowel CD4-als CD8 T-cellen, namelijk dat CD8 T-cellen zich uitbreidden en overleefden over alle organen die het volgden (Fig. 2a-b) terwijl CD4 T cellen (Foxp3neg) expandeerden en gelijktijdig door apoptosis gingen in een vergelijkbare mate resulterend in onbeduidende veranderingen in zowel hun frequenties als aantallen (Fig. 2c-d) in de periferie.

T-cel geheugen fenotypen verschillen tussen de secundaire lymfoïde organen en de perifere niet-lymfoïde weefsels in CD8 + T-cellen, maar niet CD4 T-cellen volgende

In muizen, CD4 en CD8 T-cellen kan verder worden onderverdeeld in het geheugen en naïef fenotypen gebaseerd op CD62L (L-selectin) en CD44-expressie met de CD44lowCD62L+ bevolking beschouwd als naïef (TN), CD44highCD62L+ bevolking beschouwd als centrale geheugen (TCM), en de CD44highCD62Lneg bevolking beschouwd als effector en/of effector-geheugen (TE/EM). Het is bekend dat CD4 en CD8 T cellen verschillen in hun verdeling van deze subsets in lymfoïde en perifere organen. Terwijl de naïeve frequenties binnen CD4 en CD8 populaties vrij gelijkaardig blijven, is de Cd44hoge populatie meer centraal geheugen scheef in CD8 T cellen en effectorgeheugen scheef in CD4 T cellen in een rustend organisme . Echter, in de perifere organen, weefsel resident T cellen binnen zowel de CD4 en CD8 T cel subsets zijn voornamelijk van het effector geheugen fenotype .

eerdere studies hebben aangetoond dat geheugenfenotype cellen (CD44high) het belangrijkste celtype zijn dat zich uitbreidt na stimulerende immunotherapieën . Om de samenstelling van CD4 en CD8 T cellen over verschillende organen beter te begrijpen, evalueerden we hun geheugen fenotype status in elk orgaan dat het volgde. In rust was de Cd44hoge populatie CD8 T-cellen in de lymfoïde organen voornamelijk TCM (>90%) terwijl in de perifere organen het een combinatie was met ~60% TCM (Fig. 3a, c, e, – f). In het algemeen resulteert dit in een algemene uitbreiding van de CD44 hoge frequentie over alle organen. De TCM-frequenties waren ofwel onveranderd of licht verhoogd, terwijl de te / EM-populaties aanzienlijk werden uitgebreid (Fig. 3e-f) van ~10% tot 30% in de lymfoïde organen en, indrukwekkend, van ~30-85% in de perifere organen.

binnen de Cd44hoge populatie van de CD4 T-cellen, waren de muizen in rust sterker scheef in de richting van het te/EM-fenotype met ongeveer 60-70% in het lymfoïde en 75-95% in de perifere weefsels (Fig. 3b, d). Zoals in de CD8 T-cellen gebeurde, breidde het CD44-hoge aandeel zich uit, maar door het feit dat het zo sterk was scheefgetrokken naar het te/EM-fenotype over alle organen in rustmuizen, waren de frequenties van CD4 te/EM grotendeels consistent over alle organen in it-behandelde muizen (Fig. 3e). De TCM CD4-frequenties bleven relatief laag en consistent in alle organen, zowel pre – als post-IT (Fig. 3f).

expressie van activatiemarkers in CD4 en CD8 T cellen is afhankelijk van locatie en geheugen fenotype

naast verschillen in proliferatie en apoptose, hebben we ook routinematig opgemerkt dat CD4 en CD8 T cellen differentieel upreguleren activering en remmende moleculen na het. Het meest opmerkelijke voorbeeld van dit zijnd PD-1 die, gebaseerd op studies die zich op secundaire lymfoïde organen (milt en LN) concentreren, preferentieel upregulated op CD4 en niet CD8 T cellen en dacht waarschijnlijk bij het preferentiële AICD proces betrokken te zijn dat in CD4 maar niet CD8 T cellen na het voorkwam . Een ander voorbeeld zou de preferentiële upregulation van NKG2D op CD8 T-cellen zijn, maar niet CD4 die omstandergeïnduceerde lytische capaciteit na sterke cytokineblootstelling aan de geheugen CD8 subset verleent. Eerdere studies door ons lab en gegevens weergegeven in Fig. 3 hebben aangetoond dat onder zowel CD4 als CD8 T cellen, de primaire cellen die actief verspreiden en reageren op het zijn de CD44high geheugen fenotype cellen . Daarom richtten we ons vervolgens op deze bevolking.

in de Cd44hoge populatie is aangetoond dat de prolifererende CD8 T-cellen geen upregulerende markers hebben die consistent zijn met activering door een antigeenspecifieke stimulus zoals CD25 en PD-1, maar wel upregulerende markers die hen in staat stellen een omstander fenotype te verkrijgen, namelijk NKG2D, wat de mogelijkheid biedt om meer op een NK-achtige, antigeen onbeperkte manier te handelen. Omgekeerd, CD44high, proliferating (Foxp3neg) CD4 T cellen disproportioneel upregulate PD-1 (in tegenstelling tot CD8 T cellen en Foxp3+, regelgevende CD4 T cellen) die wij hebben voorgesteld staat hen toe om bij voorkeur worden gericht voor inductie van apoptosis . In overeenstemming met deze vorige rapporten, zagen we vergelijkbare fenotypen onder milt en lymfeklieren resident, it-behandelde CD44highCD8+ T cellen, die significant upregulated nkg2d maar niet PD-1 (Fig. 4a, c), en CD44highCD4+ T cellen, die robuust upregulated PD-1, nog niet NKG2D (Fig. 4 ter, d). Toen we dezelfde fenotypische markers beoordeelden in de T-celpopulaties resident aan perifere, niet-lymfoïde organen, was het cd44highcd8+ T-cel fenotype aanzienlijk verschillend van dat van die resident aan de secundaire lymfoïde organen. Terwijl CD44highCD8 + T cellen resident aan de longen en lever waren nog steeds NKG2D+CD25neg (Fig. 4a, c), de frequentie van nkg2d+ cellen in deze populatie leek te stijgen van 20-30% in de lymfoïde organen tot 40-50% in de perifere organen (Fig. 4a). Bovendien, in tegenstelling tot lymfoïde organen waar PD-1 expressie onveranderd was, PD-1 expressie werd significant verhoogd in zowel de longen en lever na het in de CD44highCD8+ populatie (Fig. 4c). Omgekeerd, CD44highCD4 T cel fenotype was opmerkelijk gelijkaardig aan milt en lymfeknoop CD4 T cellen over alle organen (Fig. 4b, d) met vergelijkbare expressie van PD-1, en minimale upregulation van NKG2D. CD25 was niet upregulated in CD4 of CD8 T cellen op een plaats (gegevens niet getoond). Dit was onverwacht omdat wij eerder hebben gesuggereerd dat de differentiële uitdrukking van PD-1 waarschijnlijk het onderliggende mechanisme van de differentiële inductie van apoptose tussen CD4 en CD8 T cellen na sterke, immunostimulatory it regimes was. Toch, in de perifere organen, blijven de cellen van CD4 T onevenredig door apoptosis worden beà nvloed ondanks het feit dat de uitdrukking van PD-1 tussen CD4 en CD8 T cellen vergelijkbaar is. Dit patroon dat naar voren kwam was ook interessant omdat de verhoogde activeringsmarkeruitdrukking in de periferie direct leek te correleren met te/EM overheersing, met name in het geval van PD-1.

onlangs is aangetoond dat circulerende te/EM-cellen verhoogde PD-1-spiegels vertonen bij mensen in rust . Daarom veronderstelden we dat CD8+ te/EM-cellen deze activatiemarkers bij voorkeur kunnen uitdrukken over CD8+ TCM, wat resulteert in differentiële frequenties van CD44highCD8+ T-cellen die activatiemarkers uitdrukken in secundaire lymfoïde en perifere organen die het volgen. Daarom evalueerden we nkg2d en PD-1 expressie op CD8 + CD44highCD25neg te / EM en TCM cellen in alle organen in rust-en IT-behandelde muizen. In controle muizen, beide NKG2D (Fig. 5a) en PD-1 (Fig. 5c) werden met een hogere frequentie uitgedrukt in de te/EM subset van de CD8+CD44highCD25 – populatie. De totale frequentie van de te / EM-populatie onder CD8 + T-cellen in rustmuizen is echter relatief laag in vergelijking met TCM (cirkeldiagrammen Fig. 5a) daarom is de expressie van zowel PD-1 als NKG2D over het algemeen laag (Fig. 4) aangezien TCM omhoog de meerderheid van CD8+ T cellen in rust maakt. Bij de met immunotherapie behandelde muizen waren zowel de nkg2d als de PD-1 expressie verhoogd in alle organen (Fig. 4). Nogmaals, beide NKG2D (Fig. 5b) en PD-1 (Fig. 5d) werden sterker uitgedrukt op de te/EM CD8+ T-cellen dan de TCM CD8+ T-cellen. In de lymfoïde organen, waar de te/EM populatie groter was dan de controle, was het nog steeds significant minder dan CD8 + TCM cellen (cirkeldiagrammen, Fig. 5b) wat resulteert in minder belangrijke uitbreidingen op deze locaties. In tegenstelling tot lymfoïde organen vormden CD8+ te/EM-cellen het grootste deel van de onderzochte perifere organen (cirkeldiagrammen, Fig. 5b) waardoor de Algemene expressie van NKG2D en PD-1 op deze plaatsen aanzienlijk hoger wordt. Opnieuw is het belangrijk op te merken dat in de lymfoïde organen van met immunotherapie behandelde muizen, de Algemene expressie van beide activeringsmarkers significant lager was dan in de perifere organen als gevolg van de TCM scheeftrekking in de lymphatics over de periferie in de CD8-populatie. De expressieniveaus varieerden niet sterk tussen te / EM van verschillende organen (er waren geen significante verschillen tussen lymfoïde en perifere organen) binnen dezelfde behandelingsgroepen, maar Namen over het algemeen toe in de IT-behandelde vergeleken met de controlegroep, een trend die met NKG2D significant groter was dan PD-1 (Fig. 5). Daarentegen bleef de TCM-activeringsmarkerexpressie relatief constant, niet alleen onder organen van muizen binnen een behandelingsgroep, maar ook tussen de controlegroep en de IT-behandelde groepen (Fig. 5a-b). Al met al suggereren deze gegevens dat de samenstelling van de geheugen/geactiveerde pool (TCM vs TE/EM) zwaar weegt op het fenotype van de geactiveerde T-celpopulatie, in het bijzonder met CD8 T-cellen omdat hun samenstelling sterk varieert tussen lymfoïde en niet-lymfoïde organen.

Assessment of T cells from patients going high dose systemic immunostimulatory therapy

of deze resultaten zich vertaalden in humane patiënten die immunostimulerende behandelingen voor kanker kregen. Er zijn momenteel geen onderzoeken waarin combinatie-agonistische anti-CD40 met recombinant humaan IL-2 wordt beoordeeld, maar we hebben onze combinatietherapie routinematig vergeleken met andere systemische immunostimulerende behandelingen, waaronder hoge doses TLR-agonisten en hoge doses systemische cytokinetherapieën, en we hebben vergelijkbare fenotypische en functionele veranderingen in T-cellen laten zien zoals waargenomen in ons preklinisch model . Om te beoordelen of patiënten in de kliniek vergelijkbare veranderingen in de oppervlakte marker expressie vertoonden, verzamelden we perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC ‘ s) van patiënten met gemetastaseerd melanoom die een systemische hoge dosis IL-2 therapie ondergingen. De patiënten kregen om de 8 uur 6×10^5 IE/Kg voor een gepland totaal van 14 doses. PBMC-monsters werden één dag voor aanvang van de behandeling (baseline) of op dag 8 van de eerste behandelingscyclus (dag 8) verzameld om het T-celfenotype te bepalen. Bij vergelijking van baseline-en dag 8-Monsters was er een significante toename van PD-1+ geheugenfenotype (CD45RO+) cellen in zowel de CD4-als CD8 T-cel subgroepen na behandeling met hoge doses IL-2 (Fig. 6a-c). Toen deze populatie verder werd opgesplitst in Centraal geheugen (CD62L+) en effector/effectorgeheugen (CD62L -) op het tijdstip van dag 8, drukte de effector/effectorgeheugensubverzameling significant hogere PD-1-expressie uit dan de centrale geheugensubverzameling (Fig. 6d-e). Samen, correleren deze gegevens met wat werd waargenomen in muriene studies suggereren dat deze gegevens van toepassing zijn op menselijke studies en kunnen een indicator zijn van wat er lokaal gebeurt.