resultaten

we hebben eerst onderzocht of CD63 en de H,K-ATPase in hetzelfde subcellulaire compartiment in maagpariëtale cellen verblijven. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat pariëtale cellen van ratten hoge niveaus van CD63 (22) tot expressie brengen. De immunofluorescentiemicroscopie op bevroren delen van rattenmaag wijst erop dat CD63 in de meeste cellen in rattenmaag, met inbegrip van pariëtale cellen aanwezig is (Fig. 1 bis). CD63 colokaliseert gedeeltelijk met de HKA in pariëtale cellen. Daarnaast analyseerden we een sterk gezuiverd TVE-preparaat van varkensmaag (een soort geschenk van C. T. Okamoto). H, K-ATPase draagt bij tot ongeveer 50% van het eiwitgehalte in soortgelijke preparaten (23). Western blot analyse geeft aan dat CD63 overvloedig aanwezig is in dit gezuiverde preparaat van TVEs (Fig. 1 ter).

om een mogelijke in situ interactie tussen CD63 en de H,K-ATPase te onderzoeken, hebben we pull-down experimenten uitgevoerd met behulp van biotinyleerde tomatenlectine. Eerdere studies hebben aangetoond dat dit lectine specifiek en uniek bindt aan de HKß in maagpreparaten (24-27). We blokte een TVE-preparaat met anti – hkß mAb en biotinyleerde tomaat lectine om te bevestigen dat de lectine associates specifiek met de geglycosyleerde HKß (Fig. 1C). Vervolgens gebruikten we gebiotinyleerde tomaat lectine om eiwitten te isoleren die interageren met de HKß in de TVE voorbereiding. Western blot analyse geeft aan dat CD63 wordt neergeslagen door tomaat lectine (Fig. 1D), waaruit blijkt dat CD63 en de H,K-ATPase associëren in situ en suggereert dat deze associatie fysiologisch relevant kan zijn. Voorbehandeling van het TVE-preparaat met 4% SDS, gevolgd door een 20-voudige verdunning in lysis-buffer, verminderde de neergeslagen hoeveelheid CD63 significant. De hoeveelheid van de neergeslagen hkß werd door deze behandeling niet veranderd (gegevens niet getoond). Deze gegevens suggereren dat de aanwezigheid van CD63 in de pull-down is toe te schrijven aan zijn associatie met de HKß en niet aan een directe associatie tussen CD63 en tomaat lectine.

om de functionele betekenis van de interactie tussen CD63 en de HKß verder te onderzoeken, transfecteerden we COS-7 cellen met een cDNA codering konijn HKß afzonderlijk of samen met een cDNA codering een vlag-tagged CD63 construct (CD63-FL). We hebben aangetoond dat de HKß niet hoeft te assembleren met de HKa om het celoppervlak in getransfecteerde COS-cellen te bereiken (20). We gebruikten een cd63 construct dat een vlag epitope tag draagt op zijn n eindpunt omdat de c Eindpunt van CD63 een tyrosine-gebaseerd motief bevat dat nodig is voor de intracellulaire handel van deze tetraspanine (13).

COS-cellen met HKß en CD63-FL werden onderworpen aan immunoprecipitatie met behulp van een anti-FLAG pAb. Western blot analyse van de immunoprecipitated materiaal geeft aan dat de hkß coprecipitates met CD63 (Fig. 2, HKß + CD63-FL). De CD63-FL en HKß eiwitten coimmunoprecipitaat in een verscheidenheid van detergentia, waaronder 2% CHAPS, 1% Brij 96, en 1% Triton X-100. De associatie tussen CD63 en de HKß vormt een van de weinige beschreven tetraspaninecomplexen die de oplosbaarheid in Triton X-100 overleeft en dus waarschijnlijk een directe interactie vertegenwoordigt (28). De β-subeenheid heeft twee vormen: ßm (Rijpe), die wordt gemodificeerd met complexe koolhydraten, en ßc (kern), die wordt gemodificeerd met hoog-mannose koolhydraten (29). Beide vormen coprecipiteren met CD63, hoewel de verhouding van ßc aan ßm in het precipitaat als functie van de oplosbaarheidsvoorwaarden varieert.

De HKß werd niet gedetecteerd in de vlag immunoprecipitaties uitgevoerd op cellen getransfecteerd met de HKß alleen, waaruit blijkt dat de vlag pAb geen interactie heeft met de β-subeenheid (Fig. 2, HKß). De HKß niet coimmunoprecipiteren met vlag pAb uit een mengsel (50: 50, vol / vol) van lysaten bereid uit cellen transfected afzonderlijk met CD63-FL en de β-subeenheid, bevestiging dat de interactie plaatsvindt in vivo (Fig. 2, tweede rijstrook). Monsters geïncubeerd met vlag pAb niet neerslaan de lysosomale eiwit Lamp-1, wat aangeeft dat de interactie tussen CD63-FL en de HKß is specifiek en niet een Artefact van onvolledige solubilisatie van de CD63 compartiment (Fig. 2).

vervolgens werd onderzocht of de interactie tussen HKß en CD63 de subcellulaire lokalisatie van de β-subeenheid beïnvloedt. De HKß is aanwezig op het celoppervlak in Tijdelijk getransfecteerde COS-cellen (Fig. 3 A-C). Er is een uitgesproken herverdeling van de β-subeenheid naar intracellulaire CD63-bevattende blaasjes wanneer COS-cellen met zowel HKß als CD63-FL (Fig. 3 D-F). Om de mogelijkheid uit te sluiten dat deze veranderde lokalisatie een niet-specifiek effect van CD63 overexpressie zou kunnen zijn, onderzochten we het effect van CD63 expressie op de distributie van AQP4. AQP4 is een waterkanaal dat aanwezig is in de basolaterale plasmamembranen van pariëtale cellen. Het ondergaat geen geregelde endocytose en exocytose met H, K-ATPase (30, 31). Dit kanaal coimmunoprecipiteert niet met CD63-FL in een Triton X-100 lysaat van cotransfected cos cellen (Fig. 4A). Wanneer cotransfected cellen worden gevisualiseerd door immunofluorescentie confocale microscopie, is AQP4 niet aanwezig in het cd63-bevattende compartiment (Fig. 4B), wat aangeeft dat CD63-geïnduceerde herverdeling naar intracellulaire blaasjes specifiek is voor eiwitten die interageren met dit tetraspanine.

om de mechanismen van de cd63-gemedieerde herverdeling van de HKß te onderzoeken, hebben we gebruik gemaakt van recent werk dat de intracellulaire trafficking van CD63 heeft gekarakteriseerd. Rous et al. (13) aangetoond dat het op tyrosine gebaseerde motief aanwezig bij het uiterste c-Eindpunt van CD63 interageert met de adapter subeenheden μ2 en μ3. Het μ2-eiwit is een lid van het heterotetramere ap-2-complex. Dit complex is aanwezig bij het plasmamembraan en verbindt ladingeiwitten met de clathrineklaag, waardoor hun endocytose wordt gemedieerd (14). Het μ3-eiwit is een lid van het heterotetramere Ap-3-complex. Dit complex participeert in lysosomal het richten en wordt zowel in het trans-Golgi netwerk als in een vesiculair compartiment gevonden dat gedeeltelijk met endosomen colocalizeert (12). Wanneer het YEVM-tyrosinemotief van CD63 wordt gemuteerd in AEVM, kan CD63 niet interageren met μ2 of μ3 en wordt het voornamelijk uitgedrukt op het celoppervlak (13). Wanneer de HKß is coexpressed met de vlag-tagged CD63-AEVM construct, zowel CD63-AEVM en de β-subeenheid worden verdeeld over het celoppervlak (Fig. 3 G-I). Aldus, wordt de intracellulaire distributie van HKß beà nvloed door het verkeer signalen ingebed in de cd63 cytoplasmic staart.

wanneer de YEVM-sequentie in de staart van CD63 wordt gemuteerd naar YEVI, blijft het gewijzigde motief interageren met μ3 maar associeert het niet langer met μ2 (13). CD63-YEVI wordt voornamelijk gelokaliseerd in het late endosomaal-lysosomaal compartiment, waarschijnlijk omdat het gewijzigde tetraspanine-eiwit direct naar dit compartiment verhuist na zijn eerste biosynthetische passage door de Golgi (13). De kleine populatie van CD63-YEVI die het plasmamembraan bereikt, heeft de internalisatie verstoord omdat het niet langer kan interageren met μ2 (13). Wanneer de hkß en een CD63-YEVI-constructie met VLAGGETIKETTEN worden geconverteerd in COS-cellen, wordt een groot deel van de CD63-YEVI gelokaliseerd in het late endosomaal-lysosomaal compartiment; De β-subeenheid blijft echter op het celoppervlak en wordt niet herverdeeld naar een intracellulair compartiment (Fig. 3 J-L). Coimmunoprecipitation analyse bevestigt dat de HKß kan associëren met zowel CD63-YEVI en CD63-AEVM (gegevens niet weergegeven). Deze gegevens stellen voor dat Voor hkß aan een CD63-positief intracellular compartiment moet worden verdeeld, moeten deze proteã nen bij de celoppervlakte in wisselwerking staan en als complex worden endocytosed.

om te bepalen of de hkß gedetecteerd in intracellulaire blaasjes overeenkomt met eiwit dat werd endocytose van het oppervlak van de cel, merkten we de internalisatie van de β-subeenheid in aanwezigheid en afwezigheid van exogene CD63 expressie. COS-cellen werden getransfecteerd met de HKß en CD63-FL. De cellen werden vervolgens gekoeld tot 4°C om endocytose en oppervlak te stoppen geëtiketteerd met de hkß mAb. De geëtiketteerde cellen werden geïncubeerd bij 37°C gedurende 40 min om endocytose toe te staan om te hervatten. Na de incubatie, werden de cellen gekoeld tot 4°C en oppervlakte geëtiketteerd met Cy5-geconjugeerde geit anti-muis IgG. Cellen werden gefixeerd en geïncubeerd met Anti-FLAG pAb en werden vervolgens gelabeld met zowel fluoresceïne isothiocyanaat-geconjugeerde geit anti-muis IgG en rhodamine-geconjugeerde geit anti-konijn IgG. Zo werd de hkß die op het oppervlak bleef gevisualiseerd op het Cy5-kanaal, geïnternaliseerd HKß werd gevisualiseerd op het fluoresceïne-isothiocyanaatkanaal en CD63-FL werd gevisualiseerd op het rhodamine-kanaal. Deze analyse toonde aan dat geïnternaliseerde β-subeenheid colokaliseert met CD63, wat suggereert dat de pool van HKß die colokaliseerd is met CD63 wordt afgeleid door endocytose uit het celmembraan (Fig. 5 E-U). Cellen die CD63 niet overexpressie vertonen veel minder geïnternaliseerde β-subeenheid na een incubatie van 40 minuten (Fig. 5 A–D).

om de internalisatie van de HKß te kwantificeren en verder te verifiëren dat de HKß en CD63 associëren aan het oppervlak van de cel, voerden we cel-oppervlakte biotinylatie experimenten uit. In het eerste experiment werden COS-cellen getransfecteerd met de β-subeenheid alleen en gebiotinyleerd met biotine-SS-n-hydroxysuccinimide-ester bij 4°C. Vervolgens werden Duplicaatmonsters bij 37°C gedurende verschillende perioden geïncubeerd om de endocytose te hervatten. De cellen werden teruggebracht tot 4°C, en één plaat van elk tijdpunt werd ontdaan van het resterende cel-oppervlakte biotine door blootstelling aan het membraan-impermeant verminderend middel MesNa. De cellen werden gelyseerd en geïncubeerd met streptavidin parels. Eiwitten die geassocieerd met de streptavidin parels werden gescheiden door SDS/pagina, en de membranen werden gesondeerd met de hkß mAb (Fig. 6 bis). De fractie van β-subeenheid op het celoppervlak verandert niet merkbaar naarmate de internalisering van 37°C vordert. Na de eerste 10 minuten wordt een klein deel van het oppervlak-gelabelde HKß afgezonderd in de cel, en de verhouding van het oppervlak tot geïnternaliseerde HKß blijft hoog. Deze gegevens suggereren dat de β-subeenheid niet geassocieerd met CD63 ofwel zeer langzaam internaliseert of wordt geïnternaliseerd maar snel terug naar de oppervlakte wordt gerecycleerd, net als de transferrinereceptor.

vervolgens probeerden we het gedrag van de HKß die geassocieerd is met CD63 te karakteriseren. COS-cellen werden getransfecteerd met de HKß en CD63-FL. De cellen werden gebiotinyleerd en gestript zoals hierboven beschreven. Om de populatie van HKß te isoleren die met CD63 wordt geassocieerd, werd het cellysaat geïncubeerd met VLAGPAB en proteã ne a-geconjugeerde agaroseparels. Het immunoprecipitated materiaal werd geëlueerd met een kleine hoeveelheid buffer met 3% SDS, 30-voudig verdund met 1% Triton X-100, en geïncubeerd met streptavidin parels. Eiwitten die geassocieerd zijn met de streptavidin parels werden gescheiden door SDS / pagina en gesondeerd met de hkß mAb (Fig. 6B). Voor cellen die niet werden onderworpen aan een stripprotocol, vertegenwoordigt het signaal dat in deze Westelijke vlek wordt gedetecteerd de totale pool van oppervlakte-geëtiketteerde β-subeenheid geassocieerd met CD63, met inbegrip van complexen die nog bij het plasmamembraan waren en complexen die in blaasjes waren geïnternaliseerd. Voor cellen die aan een het strippen protocol werden onderworpen, vertegenwoordigt het signaal de bevolking van β-subeenheid verbonden aan CD63 die bij de celoppervlakte tijdens biotinylation aanwezig was en later van de MesNa-strook werd geïnternaliseerd en beschermd.

op het tijdstip van 0 min wordt biotinyleerde HKß gemakkelijk gedetecteerd in anti-FLAG immunoprecipitaten uit niet-gereduceerde cellen, wat aantoont dat de HKß en CD63 kunnen worden geassocieerd aan het celoppervlak. Alle biotinyleerde HKß teruggevonden op het 0-min tijdstip is gevoelig voor de MesNa strip. De hoeveelheid CD63-geassocieerde, biotinyleerde β-subeenheid beschermd tegen het MesNa-reagens neemt toe naarmate de cellen worden toegestaan om te incuberen bij 37°C. In feite is de hoeveelheid HKß die aanwezig is op het oppervlak en geassocieerd met CD63 bij 0 min ongeveer hetzelfde als de hoeveelheid HKß die wordt geassocieerd met CD63 en beschermd tegen strippen bij 45 min. Deze bevindingen suggereren dat β-subeenheid geassocieerd met CD63 geïnternaliseerd is en niet terugkeert naar de celoppervlakte.