Abstract
Carbendazim, als fungicide, werd vaak gebruikt om schimmelziekten in landbouw -, bosbouw-en diergeneesmiddelen te bestrijden. In deze studie werd de acute en reproductietoxiciteit van carbendazim beoordeeld met behulp van Caenorhabditis elegans (C. elegans) als model om de potentiële risico ‘ s van dit fungicide in de landbouwproductie en toepassing voorlopig te evalueren. De resultaten toonden aan dat de groei van C. elegans werd geremd door 0,01 µg/l carbendazim. De behandeling van 0,1 µg/l carbendazim veroorzaakte een significante afname van het bewegingsgedrag en aanzienlijke schade aan het voortplantings-en antioxidantsysteem, waardoor de levensduur van nematoden drastisch werd verkort. Deze resultaten geven een beter inzicht in de milieurisico ‘ s van carbendazim en geven aanleiding tot nieuwe bezorgdheid over de veiligheid.
1. Inleiding
pesticiden, een soort chemische of biologische reagentia, worden op grote schaal gebruikt in de landbouw om plantengroei te reguleren en ziekten en insectenplagen te bestrijden, die de groei van gewassen kunnen bevorderen en de opbrengst van gewassen kunnen verbeteren . Het wijdverbreide gebruik van pesticiden zal echter leiden tot verschillende niveaus van residuen in gewassen of voedsel en dus van invloed zijn op de menselijke gezondheid . De problemen met residuen van bestrijdingsmiddelen hebben niet alleen de aandacht van de consument getrokken, maar zijn ook een van de belangrijkste factoren geworden die van invloed zijn op de voedselveiligheid .
Carbendazim, als een breedspectrum fungicide, is gebruikt om schimmelziekten in de landbouw, bosbouw en diergeneesmiddelen te bestrijden . Carbendazim is echter door de Wereldgezondheidsorganisatie ingedeeld in de gevaarlijke categorie chemische stoffen en is door de Europese Commissie opgenomen in de prioriteitenlijst van hormoonontregelende chemische stoffen . In de afgelopen jaren is het duidelijk dat het wijdverbreide gebruik van carbendazim met overmaat en overdosis en het feit dat carbendazim moeilijk kan worden afgebroken, beide hebben geleid tot het probleem van residuen van carbendazim in de landbouw . Hoewel het toxische effect van carbendazim sinds de jaren 1980 is gemeld, wordt de toxiciteit van carbendazim een hot topic vanwege de toenemende bezorgdheid over milieu-hormoonontregelaars . Carbendazim is in verschillende landen verboden vanwege de negatieve effecten op het milieu en de gezondheid, zoals ontwikkeling en reproductieve stoornissen, toxiciteit en mutageniciteit . De nadelige effecten van carbendazim op de biochemische, histopathologische en hematologische parameters in de lever, nieren en endocriene klieren en hun hormonale niveaus zijn geïllustreerd bij ratten . Daarnaast moet verder onderzoek worden gedaan naar de lage concentratie als gevolg van de residuen van carbendazim.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), een belangrijk onderzoeksmodel, wordt op grote schaal gebruikt om enige evaluatie te doen. Volgens Amrit et al. , C. elegans heeft vele voordelen, zoals kleine grootte, snelle generatietijd, gemakkelijk van het kweken op laboratorium, en korte volwassen levensduur. C. elegans werd in deze studie gekozen als modelorganisme om de toxiciteit van een lage concentratie carbendazim te evalueren, die kan worden beschouwd als een referentiewaarde voor de toepassing van carbendazim in de landbouw.
2. Materialen en methoden
2.1. Chemische stoffen en stammen
Carbendazim (zuiverheid ≥ 99%; Aladdin ® Biochemical Technology Co., LTD, Shanghai, China) werd opgelost in N, N-dimethylformamide (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD, Shanghai, China) om 1 g/l carbendazim originele oplossing te produceren. De concentraties van DMF waren 0,1% in uiteindelijke blootstellingsoplossingen (0.01, 0.1, 1, 10, 100 µg / l). 0,1% DMF zonder carbendazim was de controlegroep. C. elegans (wild-type N2) werden oorspronkelijk verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center (Universiteit van Minnesota, MN, USA). De nematoden werden gekweekt op nematodengroeimedium (NGM) platen die werden gezaaid met Escherichia coli op50 bij 20°C zoals beschreven . L1-larve C. elegans werden verzameld door het wassen van de gravide nematoden met een bleekmengsel (1 M NaOH, 10% NaHOCl).
2.2. Letaliteit
Carbendazim oorspronkelijke oplossingen (1 g/L) werden verdund met S vloeibaar medium (1,12 g K2HPO4, 5,92 g KH2PO4 en 5,85 g NaCl werden verdund met 1 L water) om de uiteindelijke carbendazim concentraties van 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, en 1 mg/ L, die 0,1% DMF bevatte. S vloeibaar medium met 0,1% DMF was de controlegroep. 30 nematoden (L4) werden getest in 96-wells platen voor elke concentratie. De overleving van nematoden werd geteld onder een microscoop na het kweken gedurende 24 uur in de incubator. Het proces van de test is gebaseerd op de methode van Xiang et al. . Er waren drie parallelle experimenten nodig.
2.3. Ten minste 10 C. elegans (L4) werden willekeurig gekozen uit elke concentratie om het gedrag van de locomotief te bepalen, wat werd geregistreerd door zowel de head-thrash frequentie als de body bochttijden . Het aantal head-thrash frequentie werd geteld door veranderingen in de richting van buigen op het midden van C. elegans in 1 min. Meting van de buiging van het lichaam werd gedefinieerd als de tijden van de richtingsveranderingen van het deel van de nematoden dat in NGM zonder E. coli OP50 wordt gekweekt in de 30 s.
2.4. Groei-en Ontwikkelingsanalyses
C. elegans die gedurende 24 uur aan carbendazim werden blootgesteld, werden geanalyseerd. De lichaamslengte van nematoden blootgesteld aan carbendazim werd beoordeeld door de Image J-software. De nakomelingen van elke C. elegans van L4 larven tot dag 1 werden geregistreerd in het L3 stadium na elke dag individueel over te zetten naar een nieuwe plaat totdat de voortplanting stopte . Er zijn ten minste drie parallelle proeven uitgevoerd.
2.5. Levensduuranalyse
Alle op levensduur geteste elegans werden gekweekt in dezelfde toestand bij 20°C. De gesynchroniseerde C. elegans werden gekweekt in NGM-platen met verschillende concentraties carbendazim tot dag 4. De geteste nematoden zouden vervolgens om de 2 dagen worden overgebracht naar nieuwe NGM-platen. Overleven en dood C. elegans werden dagelijks geregistreerd (te beginnen op de eerste dag van volwassenheid) totdat alle nematoden voor elke concentratie waren gestorven . Er zijn ten minste drie parallelle proeven uitgevoerd.
2.6. Bepaling van oxidatieve schade
intracellulair ROS werd gemeten met 2′, 7 ‘ -dichloordihydrofluorosceïne diacetaat (H2DCFH-DA), verreweg de meest voorkomende en gevoelige reactieve zuurstofdetectiesonde. De wild-type N2 C. elegans werden gewassen in M9 buffer en vervolgens ultrasonisch verstoord. De supernatant werd het ROS-niveau geanalyseerd volgens de instructies van de Ros-kit. De uiteindelijke werkconcentratie van H2DCHE-DA was 10 μΜ . De excitatie en de emissieabsorbantie golflengten waren respectievelijk 485 nm en 535 nm. Er zijn ten minste drie parallelle proeven uitgevoerd.
intracellulair totaal superoxide dismutase (T-SOD) werd bepaald volgens de instructie van de T-SOD kit gekocht van het Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Na driemaal met M9 gewassen te zijn, werden de onderzochte nematoden ultrasonisch verstoord en reageerden met een T-SOD kit. De absorptiegolflengte was 550 nm. Bovendien werd het supernatant gebruikt om het niveau van proteã Ne voor elke concentratie te ontdekken, waarin de absorptiegolflengte 595 nm was. Er zijn ten minste drie parallelle proeven uitgevoerd.
2.7. Gegevensanalyse
alle gegevens werden gegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) door gebruik te maken van eenrichtingsanova. Grafieken werden gepresenteerd met Origin 8.5 en GraphPad Primer 7, en statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de SPSS 19.0 software. De statistische significantieniveau werd uitgevoerd met behulp van en .
3. Resultaten
3.1. Bepaling van het bewegingsgedrag van C. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans na acute blootstelling aan carbendazim door analyse van de gegevens over head-thrash frequentie en lichaamsbuigtijden van nematoden (figuren 1(A) en 1(b)). Beide vertoonden significante dalingen bij de carbendazim-concentraties variërend van 0,01 µg / L tot 100 µg / L (). Bovendien daalde de head thrashes van nematoden blootgesteld aan 100 µg/L tot 68,27%. Bij de body bochten-test had de carbendazim-concentratie 10 µg/l en 100 µg / L een significant remmend effect op de lichaamsbochten van C. elegans met respectievelijk 36,77% en 35,48% vergeleken met de controlegroep.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Bepaling van de groei en ontwikkeling van C. elegans na Acute blootstelling aan Carbendazim
vergeleken met de controlegroep (figuur 1(C) en 1(d)), werden de lichaamslengte en het lichaamsoppervlak significant () verminderd in de blootstellingsgroepen van 0,01 µg/L tot 100 µg/l.beide werden verlaagd met respectievelijk 19,16% en 22,15% bij de behandeling van 0,01 µg/L in vergelijking met de controlegroep. De concentratie van 10 µg/L gaf de meest negatieve effecten, en de lichaamslengte en het lichaamsoppervlak van C. elegans namen af met respectievelijk 35,21% en 65,22% in vergelijking met de controlegroep.
3.3. Bepaling van de Broedgrootten van C. elegans na Acute blootstelling aan Carbendazim
volgens figuur 2 vertoonde de broedgrootten van nematoden een significante afname () in de behandelingsgroepen van 0,1 µg / L tot 100 µg / l de broedgrootten van C. elegans daalden het duidelijkst, die daalden tot 43,71% bij de behandeling van 10 µg/L in vergelijking met de controlegroep.
3.4. Bepaling van de levensduur van C. elegans na Acute blootstelling aan Carbendazim
C. elegans levensduur werd significant geremd door 0,01 µg/L tot 100 µg/l carbendazim volgens de levensduurcurve in Figuur 3. De resultaten toonden aan dat de levensduur van C. elegans was afgenomen van 24 naar 20 dagen met de behandeling van 0,01 µg/l carbendazim. De levensduur van nematoden behandeld met 0,01 µg/l carbendazim was verminderd met 20,00%. Bij een blootstelling aan carbendazim van 100 µg / L was de levensduur van C. elegans het sterkst verminderd met 45,83%.
3.5. Effecten van Acute blootstelling aan Carbendazim op het Antioxidantsysteem van C. elegans
De ROS-niveaus van controle en behandelde C. elegans bij blootstelling aan carbendazim van verschillende concentraties zijn weergegeven in Figuur 4(a). Er werd aangegeven dat het niveau van intracellulaire ROS significant was verhoogd () met een bereik van 0,01 µg/L tot 100 µg/l carbendazim. Vergeleken met de controlegroep was het ROS-niveau bij de behandeling van 10 µg/l maximaal met 70,60% verhoogd.volgens de resultaten van intracellulaire SOD-spiegels was het bij de behandeling gestegen van 0.01 µg/l tot 100 µg / l carbendazim (Figuur 4 (b)). Het SOD-gehalte werd met 10,70% verhoogd bij 0,1 µg/l carbendazim in vergelijking met de controlegroep.
(a)
b)
(a)
b)
4. Discussie
Carbendazim, als fungiciden, wordt veel gebruikt in de landbouw om de groei van schimmels te remmen. Carbendazim is verboden in Australië, het grootste deel van de Europese Unie en de VS vanwege de ernstige toxicologie en persistente aard ervan . Voor deze studie was het de eerste keer dat C werd gebruikt. elegans als modelorganismen om de effecten van carbendazim op locomotiefgedrag, groei en ontwikkeling, voortplanting, levensduur en antioxidantsystemen te evalueren. Bovendien bleek uit de resultaten dat het een negatieve invloed had op C. elegans.
volgens de 24 h-LC50 is de acute toxiciteitsconcentratie van C. elegans blootgesteld aan verschillende concentraties carbendazim 0,867 mg/L. de 96-h LC50 van carbendazim als reactie op zebravis is weergegeven als 1,75 mg/L . De eieren van de Pruisische karper Carassius gibelio hebben de toxische effecten aangetoond bij een concentratie van 0,036 mg / L . Studies toonden aan dat de groei en ontwikkeling van Navicula sp. wordt geremd door carbendazim met een 24 h-EC50-waarde van 2,18 mg/L. hoewel de groeisnelheid van algen wordt hersteld na 72 h blootstelling, blijft het chlorofyl-A-gehalte significant verminderd wanneer de behandeling van carbendazim meer dan 0,5 mg/L bedroeg . In dit heden werden C. elegans die werden blootgesteld aan een lage concentratie carbendazim geselecteerd om de effecten ervan te evalueren, afhankelijk van de werkelijke concentratie van de dagelijkse blootstelling van de mens. Lage concentraties carbendazim betekenen niet dat het veilig is. Carbendazim vertoont in sommige studies negatieve biologische effecten bij veel lagere doses.
het gedrag van locomotieven werd geëvalueerd om de neurotoxiciteit van C. elegans (L4 larve) na 24 uur blootstelling aan carbendazim te beoordelen. De resultaten toonden aan dat carbendazim negatieve effecten kon hebben op het gedrag van locomotieven door het detecteren van hoofd-en lichaamsbuigen van C. elegans, die beide gevoeliger waren bij de groep met hogere blootstelling. Het locomotiefgedrag van zebravisembryo ‘ s blootgesteld aan carbendazim is gevoelig . Eerdere studies hebben aangetoond dat vissen een abnormaal gedrag vertonen wanneer subletale concentraties carbendazim 0,22–0,43 mg/L zijn .
ontwikkelingsafwijkingen kunnen ook een reden zijn voor abnormale voortbeweging . De groei en ontwikkeling van C. elegans werden onderzocht in onze studie. De resultaten toonden aan dat de lichaamslengte en het lichaamsoppervlak van C. elegans significant vernauwd waren bij de behandeling van meer dan 0,01 µg/l carbendazim. De normale groei van gewervelde dieren is gerelateerd aan de metabole schildklierhormoon homeostase . Williams et al. hebben aangegeven dat carbendazim zaadverlies kan veroorzaken na implantatie, foetale misvorming en langzame groei en ontwikkeling.
de reproductietoxiciteit van carbendazim is aangetoond dat carbendazim de microtubulepolymerisatie van schimmel-en zoogdiercellen kan remmen, waardoor de microtubule-assemblage door inwerking met β-tubuline wordt verstoord, waardoor de scheiding van chromosomen in het celdelingsproces wordt belemmerd . De vorming van microtubuli door noncovalente bindingen van α – En β-tubuline is verantwoordelijk voor chromosoomsegregatie in het proces van mitose en meiose . De broedgrootte van C. elegans neemt significant af bij 0,1 µg / l carbendazim concentratie. Carbendazim blijkt de voortplantingssystemen in Japanse kwartels en hamsters te beïnvloeden . Op basis van onze studie werd geconcludeerd dat de levensduur van C. elegans significant was afgenomen met een carbendazimconcentratie van ≥0,01 µg/L. Studies hebben aangetoond dat carbendazim heeft geleid tot onvruchtbaarheid en ontwikkelingstoxiciteit en manifesteert embryotoxiciteit, kiemcelapoptose en teratogenese bij verschillende zoogdiersoorten .
apoptose is een complexe geprogrammeerde celdood, een sterk gereguleerd verschijnsel dat gekenmerkt wordt door een reeks cellulaire processen . Veel studies hebben aangetoond dat de productie van ROS veroorzaakt door oxidatieve stress gerelateerd is aan apoptotische celdood . Uit ons onderzoek bleek dat carbendazim een significante stijging van het niveau van ROS-waarden en een kleine stijging van het niveau van SOD-waarden kon veroorzaken. Oxidatieve stress veroorzaakt door milieuvervuiling veroorzaakt de verhoogde uitdrukking van ROS en beschadigt vervolgens het antioxidant defensiesysteem . SOD is verantwoordelijk voor de ontgifting van giftige vrije radicalen en hun activiteiten, die wordt gebruikt om het oxidatieve stressniveau en de cellulaire antioxidantstatus te evalueren . Metalloenzym-SOD versnelt de transformatie van endogene cytotoxische superoxide-radicalen naar H2O2 en de verhoging van de expressieniveaus van SOD kan bijdragen tot verbetering van de enzymactiviteiten om de door carbendazim geïnduceerde superoxide-radicalen te elimineren en het optreden van cellulaire disfunctie tijdens blootstelling aan carbendazim te voorkomen . Hogere concentraties carbendazim kunnen ernstige oxidatieve stress veroorzaken, die vervolgens de balans van de celhomeostase vernietigt en apoptose bevordert . Carbendazim in lage concentraties kan echter nog steeds het voortplantingssysteem aanzienlijk beschadigen volgens onze resultaten.
5. Conclusie
voor zover bekend werd in dit onderzoek de veiligheid beoordeeld van carbendazim die voor het eerst aan C. elegans werd blootgesteld. Het toonde aan dat carbendazim een schadelijk effect kon hebben op het gedrag, de ontwikkeling en groei, de voortplanting, de levensduur en het antioxidantsysteem van C. elegans. Hoop dat het meer aandacht moet besteden aan de toepassing van carbendazim op basis van de resultaten. Daarnaast moet de veiligheid van carbendazim voor gebruik verder worden geëvalueerd, met name de bioaccumulatietoxiciteit en mogelijke genotoxische effecten.
beschikbaarheid van gegevens
Alle tijdens deze studie gegenereerde of geanalyseerde gegevens zijn in dit artikel opgenomen.
belangenconflicten
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31501569).
