II Effect van hyperthermie alleen in Vitro
in 1967 gebruikte Harris een single-cell cloning assay om hitteoverlevingscurves van pseudodiploïde varkensniercellen te verkrijgen. De krommen waren samengesteld uit een initiële schouder gevolgd door een exponentiële afname van de overlevende fractie en waren daarom vergelijkbaar met krommen verkregen uit stralingsdoding van cellen in cultuur (puck and Marcus, 1955). Ook Westra en Dewey (1971) en Palzer en Heidelberger (1973a) hebben dit fenomeen aangetoond. Dit impliceert echter geen gelijkenis van het dodelijke mechanisme van de twee modaliteiten.
een Arrhenius-grafiek van de reciproque van de inactivatiesnelheid uitgedrukt als functie van de reciproque van de absolute temperatuur voor beide ovariumcellen van de Chinese hamster (CHO) en varkensniercellen toonde een activeringsenergie aan van 141 kcal/Mol voor beide typen bij een temperatuurbereik van 43,5° tot 46,5°C (Westra and Dewey, 1971). De omvang van de activeringsenergie is vergelijkbaar met die voor verschillende enzymen en eiwitten (Johnson et al., 1954), en is aanzienlijk groter dan de activeringsenergie gerapporteerd voor DNA (Eigner et al., 1961; Greer en Zambehof, 1962) die suggereren dat eiwitdenaturatie de dodelijke hittelaesie kan zijn. Nochtans, was de entropie van activering voor de twee cellijnen verschillend.
De huidige kennis en kennis van het doel(en) en de mechanismen(n) voor het doden van warmte zijn beperkt. Terwijl een aantal door warmte veroorzaakte veranderingen van cellulaire structuur en metabolisme zijn beschreven, is geen van hen uitsluitend met celdood verbonden. Geen middelen zijn gevonden om selectief subcellular organellen te verwarmen om inzicht in het kritieke doel of de doelstellingen van hitte te bereiken. Toch zijn er verschillende mogelijkheden voorgesteld.
een aantal onderzoekers vond dat hitteschok het vermogen van cellen om thymidine in DNA op te nemen vermindert (Mondovi et al., 1970; Reeves, 1971; Plagemann en Erbe, 1972). Deze remming van de opname van thymidine kan het gevolg zijn van schade aan het thymidinetransportmechanisme, waarvan wordt aangenomen dat het de opname van DNA controleert (Plagemann en Erbe, 1972). Er is echter aangetoond dat de geëtiketteerde precursorpool niet voldoende afnam om de grote afname van de opname van thymidine in varkensniercellen te verklaren (Plagemann en Erbe, 1972).
Dewey et al. (1971) vond dat warmte chromosomale afwijkingen induceerde in synchrone CHO-cellen. De aberratiefrequentie was te laag om de celletaliteit in M-en G1-cellen te verklaren (minder dan één aberratie per cel wanneer de overleving tot 37% werd verminderd), maar zou wel de celdood van S-fase-cellen kunnen verklaren. Bovendien, hitte en de thymidine analoge bromodeoxyuridine (BUdR), wanneer het samen werken, doodde cellen additief, die suggereren dat dezelfde structuren werden beschadigd door beide agenten. Er werd dan verondersteld dat warmte en BUdR beide laesies produceren uitgedrukt als schade in DNA, maar dat warmte schade veroorzaakt in chromosomale eiwitten, mogelijk herstelenzymen, en dat BUdR schade veroorzaakt in het DNA. Dan kan de schade in chromosomale proteïne of interactie met BUdR schade in het DNA of kan resulteren in een remming in het herstel van DNA schade. Deze hypothese wordt ondersteund door de overeenkomst tussen de activeringsenergieën voor het doden van hitte (141 kcal/Mol) en de inactivering van eiwitten (Westra and Dewey, 1971). De eiwitgemedieerde DNA-schade die tijdens G1 optreedt, manifesteerde zich blijkbaar niet als chromosomale afwijkingen, mogelijk als gevolg van de meer gestabiliseerde associatie tussen deze componenten van chromatine tijdens G1. Het mechanisme van het doden van mitotische cellen werd verondersteld om vernietiging van de spindel te zijn, die de hoge frequentie van tetraploïde cellen veroorzaakte die in deze experimenten worden waargenomen.
warmtegevoeligheid varieert aanzienlijk tussen cellijnen. Muisprostaatcellen werden niet gedood voor maximaal 5 uur bij 43°C, terwijl de overleving van koolwaterstof-getransformeerde prostaatcellen 0,37 was na 2 1/2 uur warmtebehandeling (Chen en Heidelberger, 1969). Het aantal minuten warmte dat nodig is om de overleving van l1210 leukemiecellen en HeLa-cellen te verminderen tot 37% op het exponentiële gedeelte van de overlevingscurve (D0) is aangetoond 12 min en 30 min bij 43°C, respectievelijk (Palzer en Heidelberger, 1973a). Ook was de warmte-inactivatiesnelheid van CHO-cellen (Westra en Dewey, 1971) tien keer groter dan de inactivatiesnelheid van varkensniercellen (Harris, 1967).de hoeveelheid delingsvertraging na verhitting (Westra and Dewey, 1971; Palzer and Heidelberger, 1973b) blijkt veel langer te zijn dan de vertraging die wordt veroorzaakt door een stralingsdosis die de overleving met een vergelijkbare hoeveelheid vermindert (Westra and Dewey, 1971). Dit suggereert dat de laesies die verantwoordelijk zijn voor delingsvertraging of de laesies die verantwoordelijk zijn voor letaliteit verschillend zijn voor de twee modaliteiten.
door het bepalen van de overlevingsreductie veroorzaakt door een constante dosis warmte op gesynchroniseerde cellen, is het aangetoond voor CHO-cellen (Dewey et al., 1971; Westra en Dewey, 1971), gist (Schenberg-Frascino en Moustracchi, 1972), HeLa-cellen (Palzer en Heidelberger, 1973b) en meristematische cellen (de la Torre et al., 1971) dat S-fase cellen (de la Torre et al., 1971; Dewey et al., 1971; Westra en Dewey, 1971; Schenberg-Frascino en Moustacchi, 1972; Palzer en Heidelberger, 1973b) en M-fase cellen (Westra en Dewey, 1971) waren de meest gevoelige ten opzichte van cellen in andere fasen van de celcyclus. Deze bevinding staat in direct contrast met bestralingsstudies, waar beide in vitro (Sinclair, 1968; Dewey et al., 1970) en in vivo (Gillette et al., 1970; Dawson et al., 1973), is de S-fase de meest radiobestendige fase. Vanwege de celcyclus-specificiteit van hittedoodheid, is de inductie van een gedeeltelijke synchronie na herhaalde hittebehandelingen gesuggereerd (de la Torre et al., 1971) en waargenomen (Martin en Scloerb, 1964).
verschillende onderzoekers hebben gemeld dat neoplastische cellen gevoeliger zijn voor warmte dan normale cellen (Mondovi et al., 1969; Levine and Robbins, 1970; Turano et al., 1970; Muckle and Dickson, 1971). Dit kan het gevolg zijn van voedingstekorten of andere factoren die het kwaadaardige Weefsel hittegevoeliger kunnen maken. Er bestaan echter uitzonderingen (Chen en Heidelberger, 1969; Kachani en Sabin, 1969), en in de meeste gevallen is een veranderde morfologie of metabolisme gelijkgesteld met het doden van cellen. Daarom, in de gegevens suggereren een selectieve warmtegevoeligheid van kankercellen (Mondovi et al., 1969, 1970; Levine and Robbins, 1970; Turano et al., 1970; Muckle en Dickson, 1971; Overgaard en Overgaard, 1972a; Kim et al., 1974), is het niet bewezen dat Voor het criterium van reproductieve dood, tumorcellen zijn warmtegevoeliger dan de normale cellen waaruit de tumor ontstond.
gefractioneerde toepassing van warmte is slechts kort onderzocht. Palzer en Heidelberger (1973a) onderzochten terugwinning van asynchrone HeLa cellen tussen gesplitste dosissen hitte. Hun gegevens geven aan dat cellen in staat waren om subletale hitteschade te herstellen in 6 uur. De fluctuatie in de overlevende fractie suggereerde ook een gedeeltelijke synchronisatie van de asynchrone populatie als gevolg van de eerste dosis. Er was een daling van de overleving na een initiële stijging als gevolg van het herstel van subletale warmteschade. De verminderde overleving werd geïnterpreteerd als een gevolg van herverdeling van cellen in een gevoeligere fase van de celcyclus als gevolg van gedeeltelijke synchronisatie geïnduceerd door de eerste dosis van het letale agens.
Gerweck et al. (1974) onderzocht het vermogen van warmte om hypoxische cellen in vitro te doden. Hypoxie werd geproduceerd in CHO cellen door een snelle vergassing techniek. Stralingsoverlevingscurven voor zowel aërobe als hypoxische CHO-cellen toonden een zuurstofversterkingsratio (oer) van 2,5 aan, wat erop wijst dat radiobiologische hypoxie werd bereikt. Verwarming gebeurde door onderdompeling in 45,5°C water voor variabele tijdsintervallen. Warmte-overlevingscurven van aërobe en hypoxische cellen werden vervolgens geconstrueerd die aantoonden dat hypoxische cellen minstens zo hittegevoelig waren en mogelijk iets hittegevoeliger dan aërobe cellen. De D0 voor hypoxische cellen was 1,2 min en voor aërobe cellen 1,8 min.
Schulman and Hall (1974) vonden dat hypoxische V79-cellen van de Chinese hamster hittegevoeliger waren dan aërobe V79-cellen. Drieënveertig graden Celsius was nodig om schade te veroorzaken in aërobe cellen, terwijl 41°C schade veroorzaakte in hypoxische cellen.
samengevat heeft het hittedoden van zoogdiercellen in kweek de volgende kenmerken: bij een bepaalde temperatuur wordt een plot van de logaritme van de overlevende fractie als functie van de behandelingstijd typisch exponentieel voorafgegaan door een eerste schouder, wat aangeeft dat cellen de capaciteit hebben om subletale hitteschade te accumuleren en vervolgens exponentieel worden gedood met toenemende behandelingstijd. Split-dose studies geven aan dat cellen ook de capaciteit hebben om deze subletale hitteschade te herstellen. Er bestaat aanzienlijke variatie in warmtegevoeligheid tussen verschillende cellijnen. Een cel-leeftijd gevoeligheid bestaat met S-fase en M-fase cellen die het meest hittegevoeligst zijn. Het doelwit beschadigd door hitte is onbekend, maar een eiwit—DNA interactie is op zijn minst een plausibele mogelijkheid. Hypoxische cellen lijken warmtegevoeliger te zijn dan zuurstofhoudende cellen.
