tekst
De behandeling van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) is gecompliceerd door een toename van antibioticaresistentie. MRSA-stammen drukken penicillinebindend eiwit 2a (PBP2a) uit, gecodeerd door mecA, dat resistentie biedt tegen β-lactams door het reactieve serine te beschermen in een smalle, ontoegankelijke spleet, waardoor de celwandsynthese kan worden voortgezet in aanwezigheid van een antibioticum (1, 2). Ceftobiprole en ceftaroline zijn anti-MRSA cefalosporinen die PBP2a remmen bij therapeutisch bruikbare concentraties. De R2-groep van ceftobiprole strekt zich uit in de smalle spleet van PBP2a om toegang te krijgen tot de actieve plaats, terwijl de ceftarolinebinding een allosterische verandering in PBP2a veroorzaakt, die de actieve plaats voor band door een tweede molecuul openbaart (3, 4). Ceftobiprole is geëvalueerd in klinische studies, en ceftaroline is FDA goedgekeurd voor de behandeling van huid en huidstructuur infecties, met inbegrip van die veroorzaakt door MRSA (5-10).
eerdere studies uit onze groep hebben aangetoond dat passage van de COLSTAM in ceftobiprole selecteert voor resistente mutanten met mutaties in PBP2a (11). Deze studie onderzoekt of ceftaroline passage ook selecteert voor soortgelijke mutaties. Passage experimenten werden uitgevoerd met twee verschillende MRSA achtergronden: COL, een archaïsch homogeen resistent isolaat uit 1961, en SF8300, een heterogeen resistente hedendaagse USA300 MRSA stam. COLnex en SF8300ex, mecA-negatieve afgeleide stammen van COLn en SF8300, werden verkregen door (12) het verwijderen van chromosomale staphylococcen cassette chromosoom MEC (SCCmec) (13). Wild-type mecA werd opnieuw geïntroduceerd op plasmide pYK20 (afgeleid van plasmide pAW8 en met wild-type Meca gekloond van COL ) in COLnex en SF8300ex voor passage studies. Als mecA resistentie medieerde, moet hetzij het genezen van een resistente mutant van het plasmide, hetzij het aanbrengen ervan in een gevoelige achtergrond resulteren in verlies of toename van het fenotype, waardoor de bijdrage van mecA aan de resistentie kan worden bepaald. Stammen en plasmiden die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn vermeld in de tabellen 1 en 2. COLnex (pYK20) en SF8300ex(pYK20) werden serieel gepasseerd in tryptische sojabouillon met toenemende concentraties ceftaroline (Boslaboratoria) zoals eerder beschreven (11).
- View inline
- View popup
lijst van ouder-en mutantstammen gebruikt in Meca-positieve passage studiesa
- Bekijk de inline
- Bekijk de popup
Plasmiden gebruikt in mecA-positieve passage studies
Na 28 dagen, COLnex(pYK20) en SF8300ex(pYK20) passaged in ceftaroline leverde twee mutanten, COLnexpT(pYK20COLT*) en SF8300expT(pYK208300T*) (een sterretje geeft een plasmide gegenereerd tijdens ceftobiprole of ceftaroline selectie in een COL of SF8300 achtergrond) (Tabel 1). MICs tot ceftaroline, ceftobiprole en andere β-lactamen (Sigma-Aldrich) werden bepaald met de bouillonverdunningsmethode volgens de CLSI-normen (Tabel 3) (15). COLnexpT (pYK20COLT*) vertoonde een hoge resistentie tegen zowel ceftaroline als ceftobiprole, met MICs van respectievelijk 64 µg/ml en 32 µg/ml. SF8300expT (pYK208300T*) uitgedrukt lage niveau weerstand door passage dag 4, met een MIC van 4 µg / ml, die onveranderd bleef ondanks 24 meer passages (Tabel 3 en Fig. 1). De eerder beschreven ceftobiprole-passaged mutant van COLnex(pYK20) (11), COLnexpB(pYK20COLB*), vertoonde een hoge resistentie tegen zowel ceftobiprole als ceftaroline, met een MIC van 64 µg/ml per stuk.
- View inline
- View popup
MICs of drugs for Meca-positive parent and passaged mutant strains
Emergence of ceftobiprole – en ceftaroline-passeerde Meca-positieve mutanten. Resistentie tegen ceftobiprole (BPR) en ceftaroline (CPT) werd gegenereerd door het passeren van stammen in subinhibitieve concentraties van elk antibioticum in bouillon. De hoogste concentratie van drug waarin de spanningen elke dag groeiden wordt getoond op de Y-as.
plasmide mecA werd gesequenced voor mutaties in gepasseerde stammen. Aangezien PBP ‘ s het doelwit zijn van β-lactams, werden pbp1, -2, -3 en -4 ook gesequenced. Ten slotte werden gdpP en acrB gesequenced, aangezien mutaties in deze genen waren geïdentificeerd in een MECA-negatieve ceftobiprole-resistente mutant van COL (16). Plasmide pYK208300T* (pYK20 van SF8300ex passed in ceftaroline), had een single point mutatie (G naar A bij codering sequentie positie 1339) in mecA, resulterend in een niet-synonymous aminozuur verandering, E447K. er waren geen mutaties aanwezig in andere PBP genen, acrB, of gdpP (Tabel 4).
- view inline
- View popup
mutaties in Meca-positieve mutantstammen passed with ceftobiprole and ceftaroline
plasmide pYK20COLT* (pYK20 from COLnex passed in ceftaroline) had geen mutaties in Meca. Een puntmutatie (C tot T op CDS-positie 1327) die de h443y-mutatie in GDPP introduceerde, een puntmutatie (G tot A op CDS-positie 466) die de d156n-mutatie in PBP2 introduceerde, en twee puntmutaties (A tot G op CDS-positie 601 en C tot G op CDS-positie 723) die t201a-en F241L-mutaties in PBP4 introduceerden (Tabel 4) werden gevonden. Van belang is dat ceftaroline passage van COL die mecA bevat op zijn natuurlijke chromosomale locatie ook resulteerde in een mutant met hoge resistentie, maar zonder mutaties in mecA (gegevens niet getoond). Sequentieanalyse van die passaged mutant toonde een puntmutatie aan in pbp2 (G naar A op CDS-positie 1891), resulterend in de aminozuurverandering G631S, en één in pbp4 (T naar A op CDS-positie 414), wat een n138k-mutatie introduceerde. Deze gegevens wijzen erop dat ceftaroline, zelfs in aanwezigheid van mecA, kan selecteren op mutaties in andere genen, wat resulteert in resistentie.
uithardende COLnexpB (pYK20COLB*) en SF8300expT(pYK208300T*) van hun plasmiden, die elk mecA-mutaties hadden, verminderden de MICs voor alle geteste β-lactamen (tabellen 5 en 6). Het genezen van COLnexpT(pYK20COLT*) van zijn plasmide, dat geen mecA-mutaties had, had geen effect op MICs (Tabel 5). Het transformeren van pYK20COLB*, dat 6 substitutiemutaties in mecA bevat, in de vatbare colnex-ouder, wat resulteerde in de transformant COLnex(pYK20COLB*), resulteerde in hoge ceftaroline-en ceftobiprole-resistentie. Het omzetten van pYK208300T* , dat de enkelvoudige mutatie E447K in mecA bevat, in COLnex, wat de transformant COLnex oplevert(pYK208300T*), resulteerde in een hoge resistentie tegen ceftobiprole (MIC van 64 µg/ml), maar alleen een lage resistentie tegen ceftaroline (MIC van 4 µg/ml) (Tabel 5). Het omzetten van pYK20COLB * in SF8300ex, wat de transformant SF8300ex(pYK20COLB*) opleverde, resulteerde in een hoge resistentie tegen ceftaroline en ceftobiprole (MIC van 32 µg/ml per stuk) (Tabel 6). Meerdere pogingen om SF8300ex te transformeren met pYK208300T* waren niet succesvol.
- View inline
- View popup
MICs of drugs for Meca-positive passaged mutant strains cured of plasmid and parental strains transduced with plasmids from passaged strains in the COL background
- View inline
- View popup
MICs of drugs for Meca-positive passaged mutant strains cured of plasmid and parental strains transduced with plasmids from passaged strains in the USA300 strain SF8300 background
een enkele aminozuurverandering op E447 in mecA lijkt een sleutel te spelen rol in verzet. Het is aanwezig in ceftobiprole-gepasseerde COL (onder andere mutaties) (11), Het is de enige Meca-mutatie in de ceftaroline-gepasseerde SF8300, en het is gemeld in klinische isolaten (17, 18). Structureel bevindt E447 zich in het penicillinebindend domein van PBP2a en interageert het met de R2-groep van ceftobiprole en andere β-lactamen (3, 19). E447K gaf een hoge ceftobiprole-resistentie en een lage ceftaroline-resistentie in de colnex-achtergrond, waarschijnlijk als gevolg van structurele verschillen tussen de twee stoffen. Meerdere mutaties in mecA leveren een hoge resistentie tegen beide antibiotica op (20). Ook de genetische achtergrond speelt een rol. Heterogene SF8300 die in ceftaroline werd gepasseerd, ontwikkelde een lage resistentie tegen ceftobiprole en ceftaroline met E447K (MIC 4 µg/ml). Deze mutatie is in verband gebracht met een lage resistentie tegen ceftaroline in klinische isolaten (17).
concluderend kan worden gesteld dat passage in ceftaroline of ceftobiprole selecteert voor een e447k-mutatie in PBP2a, een mutatie die wordt gevonden in ceftaroline-resistente klinische isolaten, wat het belang ervan onderstreept bij de mediatie van het resistentiefenotype (17, 18). Hoewel het gehele genoom rangschikken niet werd uitgevoerd, wat een beperking van deze studie is, spelen andere genen dan mecA een rol omdat het niveau van resistentie verschilde tussen Col en SF8300 achtergronden bij introductie van de e447k mutatie en de hoogst resistente passaged COL mutant geen Meca mutaties had. Hoewel er waarschijnlijk andere mutaties zijn, lijken mutaties in genen die PBP4 en gdpp coderen bijzonder belangrijk, aangezien deze herhaaldelijk zijn geïdentificeerd bij ceftobiprole – en ceftaroline-passaged mutanten. De rol van deze genen en andere genen wordt actief onderzocht.
