Resultaten en Discussie

In zoogdieren systemen, Cdc42 activiteit heeft aangetoond dat een belangrijke rol in het reguleren van de huid stuurpen/progenitor cel differentiatie in het haar follikel cellen, het regelen van neuroepithelial stuurpen/stamvader van de polariteit en de hersenen hemisferische bifurcatie, en het reguleren van het aantal cellen en de groei tijdens de perinatale periode (6-9). Interessant is dat een onderzoek van de Cdc42-activiteit bij volwassen muizen van verschillende leeftijden aantoont dat het relatieve Cdc42-GTP-niveau van oudere dieren significant hoger is dan dat van jongere dieren in diverse weefsels, waaronder hart, hersenen, longen, lever, beenmerg, milt en nieren (Fig. 1 A en gegevens niet weergegeven), waardoor de mogelijkheid bestaat dat een verhoogde Cdc42-activiteit betrokken is bij het normale verouderingsproces.

om te bepalen of de verhoogde Cdc42 activiteit geassocieerd met natuurlijke veroudering fysiologische relevantie kan hebben, onderzochten we de Cdc42 negatieve regulator, Cdc42GAP, in Gen-gerichte muizen nadat ze volwassen zijn geworden. Eerdere studies van de homozygote Cdc42GAP-knockoutmuizen tijdens de perinatale periode toonden aan dat verschillende weefsels/cellen een verhoogd Cdc42-GTP bevatten en dat de embryo ‘ s/pasgeboren pups van het cdc42gap −/− genotype een verminderde orgaan – /organismale grootte vertoonden die verband houden met een verhoogde spontane apoptose in verschillende celtypen (6). Bij volwassen Cdc42GAP−/− muizen was de Cdc42-activiteit constitutief hoger in meerdere Weefsel/celtypen dan die van de overeenkomende WT-muizen, terwijl het niveau van RhoA-GTP of Rac1-GTP gelijk bleef aan dat van WT (Fig. 1 B; gegevens niet weergegeven), wat wijst op een specifieke toename van Cdc42-activiteit bij volwassen dieren die vergelijkbaar is met die tijdens de perinatale periode. De meerderheid van de Cdc42GAP – / – muizen stierf tijdens de neonatale periode als gevolg van hun kleinere omvang en zwakke lichaamsbouw (6). Echter, een deel van hen (≈7%) zou de neonatale periode onder Pleegzorg kunnen overleven door niet-verwante verzorgende vrouwen. Ondanks regelmatige melkinname en normale serum glucose-en insulineconcentraties gevonden in de homozygote muizen in de postnatale periode, begon de gewichtstoename van Cdc42GAP – / – muizen te vertragen bij ≈3 maanden oud in vergelijking met ≈5 maanden oud voor gew.of heterozygote muizen, en de rijpe homozygoten waren ≈30% verminderd in lichaamsgewicht als gevolg van een afname van de totale cellulariteit (Fig. 1 C en gegevens niet weergegeven). De mediane levensduur van de Cdc42GAP – / – muizen was ≈12 maanden, terwijl de controle (WT of heterozygote) muizen vitaal bleven tot een mediane leeftijd van ≈27 maanden (Fig. 1 D). De overlevingscurve van de homozygote muizen verschilt enigszins van de typische Gompertz-curve, maar is vergelijkbaar met die voor BubR1 (een mitotische controlepointregulator) knockout (10) of P44 (een korte isovorm van de p53 tumor suppressor) transgene (11) dieren. Kyfose en gebrek aan kracht bij Cdc42GAP – / – muizen werd duidelijk op de leeftijd van ≈12 maanden (Fig. 1 E). Gevilde Cdc42GAP – / – muizen vertoonden op de leeftijd van 15 maanden een duidelijke afname in lichaamsgewicht, een aanzienlijk verlies van onderhuids vetweefsel, ernstige lordokyphose en spieratrofie (gegevens niet getoond). Een röntgenscan toonde een significant fenotype van kyfose en verminderde botmineraaldichtheid (BMD) bij Cdc42GAP−/− muizen op de leeftijd van 15 maanden (Fig. 1 F). Verdere kwantificering van de ontleed botten van Cdc42GAP−/− muizen toonde 3 – en 2,6-voudige reducties van BMD in respectievelijk het scheenbeen en het dijbeen (SI Fig. 7). Bovendien verloren zowel mannelijke als vrouwelijke Cdc42GAP−/− muizen de vruchtbaarheid op een vroege leeftijd in vergelijking met die van WT. Bij paring tussen Cdc42GAP – / – vrouwtjes en WT mannetjes werden de homozygoten onvruchtbaar op 26 weken oud vergeleken met 48 weken oud voor WT (Fig. 1 G). Deze waarnemingen wijzen erop dat Cdc42GAP deficiëntie resulteert in de constitutief verhoogde Cdc42-GTP-spiegel, verminderde lichaamsgrootte, vroege kyfose, verminderde BMD, verkorte vruchtbaarheidsperiode en verminderde levensduur bij volwassen muizen.

De H&e bevlekte secties door het 8 maanden oude vrouwelijke muizenwervellichaam toonden aan dat de Cdc42GAP −/− muizen een dunnere, gebogen cortex en dunnere trabeculae hadden in vergelijking met WT muizen (Fig. 2 A). Ook de lengtesecties van het dijbeen van de homozygote muizen vertoonden een vermindering van de corticale botdikte in vergelijking met die van WT muizen (gegevens niet getoond). Deze waarnemingen zijn in overeenstemming met het bruto uiterlijk en de klinische kenmerken van osteoporose. De milt, lever en nieren van volwassen Cdc42GAP-/-muizen waren in massa verminderd als gevolg van een afname van de totale cellulariteit, wat duidelijk was in de H&e-bevlekte delen van de milt, en de T-en B− celhoudende witte pulpgebieden van 12 maanden oude Cdc42GAP− / -milt waren aanzienlijk verminderd in vergelijking met die van Op leeftijd afgestemde WT-muizen (Fig. 2 b en gegevens niet getoond), wat wijst op uitgesproken lymfoïde atrofie in de homozygoten. In overeenstemming met de schijnbare reductie van subdermaal vetweefsel, histologische analyse van de dwarsdoorsneden van de dorsale huid bleek een bijna volledige afwezigheid van s.c. vetcellen in 9 maanden oude Cdc42GAP- / -muizen (Fig. 2 C). Een verlies in spiermassa en spieratrofie werden ook bevestigd door het onderzoek van H&e-bevlekte skeletspiersecties van 12 maanden oude Cdc42GAP – / – muizen en de bij de leeftijd overeenkomende WT-muizen (Fig. 2 C). De Cdc42GAP – / – muizen toonden ook duidelijke vermindering van haarregeneratie na verwijdering van het dorsale haar door het scheren, terwijl de leeftijd-en geslacht-matched WT toonde robuuste haargroei (SI Fig. 8). Het vermogen om stress te verdragen, zoals wondgenezing, een verouderingsactiviteit (12) van de Cdc42GAP−/− muizen, was significant verminderd in vergelijking met die van WT (Fig. 2 D). Histopathologische analyse van de wondsecties toonde weinig reepithelialisatie aan in de wondrand van de Cdc42GAP – / – muizen, terwijl volledige reepithelialisatie van WT muizen duidelijk was 4 dagen nadat de wond werd ingebracht (Fig. 2 E). Naast deze waarnemingen, waren een aantal hematopoietische fenotypen van de homozygote muizen, met inbegrip van bloedarmoede, verminderde milt en cellulariteiten van het beenmerg, defecten van hematopoietische stamcelgraftment aan het beenmerg, en verhoogde gevoeligheid van hematopoietische stamcellen voor geïnduceerde mobilisatie (13, 14) consistent met vroege veroudering in het hematopoietische systeem. Belangrijk is dat een onderzoek van jonge homozygote muizen (<4 maanden oud) vóór de manifestatie van duidelijke fenotypen geen belangrijke afwijkingen aan het bot, de huid en de milt aan het licht bracht (SI Fig. 9 A en B en gegevens niet getoond), wat suggereert dat de verouderingsachtige fenotypen van de Cdc42GAP-/− muizen niet te wijten zijn aan een vroege ontwikkelingsstoornis. Verder kon een aantal fenotypen van de homozygote muizen, waaronder verminderde corticale botdikte, kyfose en verlies van spiermassa en epidermale weefsels, worden gevonden in de oude (>2,5 jaar oud) WT muizen (SI Fig. 9 C en D en gegevens niet weergegeven). Zoals samengevat in SI Tabel 1, leveren deze resultaten samen sterk bewijs dat Cdc42GAP deficiëntie vroegtijdige veroudering-achtige fenotypen veroorzaakt bij de dieren.

kleuring van de weefsels van 9 maanden oude volwassenen, waaronder lever, nieren en milt, voor senescentie-geassocieerd β-galactosidase (SA-β-gal) toonde een sterke activiteit aan van deze senescentiemarker bij homozygote muizen die niet aantoonbaar was in de weefsels van bij leeftijd en geslacht overeenkomende WT muizen (Fig. 3 A en SI Fig. 10), wat aangeeft dat Cdc42GAP−/− volwassen weefsels voortijdige senescentie kunnen ondergaan. Interessant is dat verhoogde apoptose van de homozygote weefsels waargenomen tijdens de perinatale periode afwezig was bij de volwassen homozygoten wanneer de verhoogde SA-β-gal activiteit duidelijk was (ref. 6 en gegevens niet weergegeven). Cdc42GAP – / – muis embryonale fibroblast (MEF) cellen, die ≈3-voudige hogere Cdc42-GTP maar normale Rac1-GTP of RhoA-GTP inhoud in vergelijking met WT MEF Cellen (6) bevatten, vertoonden significant verhoogde SA-β-gal activiteit en accumuleerden een afgeplatte en vergrote senescente morfologie te beginnen bij passage 6 wanneer WT MEF cellen negatief waren voor SA-β-gal activiteit en contractueel waren in de morfologie (Fig. 3 b en SI Fig. 11). De Cdc42GAP – / – MEF cellen begonnen te vertragen in de groei bij passages 5-7 toen de overeenkomende WT MEF cellen exponentieel groeiden (Fig. 3 C) (6), en ze ondergingen massale replicatieve senescentie na passage 7, terwijl de meeste WT MEF cellen niet senescentie tot passage 13 (SI Fig. 11 en gegevens niet weergegeven). Bovendien vormde een beduidend hoger percentage Cdc42GAP – / – MEF-cellen bij passage 7 Grotere foci in de kern dan WT-cellen (SI Fig. 12). Deze resultaten wijzen erop dat Cdc42GAP deficiëntie vroege weefsel/cel senescentie induceert.

een bekende bijdragende factor voor premature veroudering bij zoogdieren en cel senescentie is verhoogde genomische instabiliteit (15). Metafase spreidingsanalyse toonde aan dat > 30% primaire splenocyten van 8 maanden oude homozygote muizen aneuploïde waren, terwijl leeftijd-en geslachtsgebonden WT splenocyten geen detecteerbare aneuploïdie hadden (Fig. 3 D), wat aangeeft dat het Cdc42GAP−/− Weefsel genomische instabiliteit leed. Ter ondersteuning van deze bevinding toonden Cdc42GAP−/− MEF-cellen een significante toename van dubbele kernencellen onder DAPI-kleuring in vergelijking met WT-cellen bij passage 7 (SI Fig. 12). Karyotype analyse van de latere passages van MEF-cellen (passage 6-7) toonde verder aan dat, hoewel de meeste chromosomen van WT− cellen (≈80%) intact bleven, 42% van de Cdc42GAP−/ – cellen ten minste één chromosoomafwijking bevatten, 20% twee of meer afwijkingen en 14% drie of meer afwijkingen (Fig. 3 E). Het percentage en de graad van aneuploïdie namen ook significant toe in Cdc42GAP−/− MEF-cellen, met>32% van cellen met abnormale chromosoomaantallen variërend van 72 tot 102, terwijl de meeste WT-cellen diploïde waren (Fig. 3 E en SI Fig. 13). Karyotype analyse van de chromosomale schade geeft aan dat de aberraties van de homozygote MEF-cellen divers waren, waaronder chromatid break, premature zusterchromatid scheiding (een kenmerk van een defecte spindel assemblage checkpoint), translocatie, chromosoombreuken, dicentrische chromosoom, en chromosoom fragmentatie (Fig. 3 F en SI Tabel 2), wat suggereert dat de DNA schade reparatie machines is aangetast in Cdc42GAP−/− cellen. Immunofluorescentiekleuring van fosfo-H2 AX in de celkern, een DNA damage response marker (16), toont aan dat, hoewel 10% van passage 7 Cdc42GAP−/− MEF-cellen positief waren voor de DNA damage marker, <1% van de WT-cellen positief waren (Fig. 3 G). De correlatie tussen het begin en de progressie van de verouderingsachtige fenotypen van de Cdc42GAP-/− muizen en de waargenomen mate en ernst van de genomische afwijkingen in Cdc42GAP− / − cellen ondersteunt een rol van Cdc42 in de ontwikkeling van de progeroïde kenmerken.

om het mogelijke mechanisme van de geaccumuleerde DNA− schade in Cdc42GAP−/ – cellen te bepalen, hebben we het endogene reactieve zuurstof species (ROS) niveau van de homozygote cellen vergeleken met dat van WT-cellen, omdat Rac1 en Rac2, twee nauw verwante Rho Gtpasen, bekende regulatoren zijn van cellulaire ROS (17). SI Fig. 14 toont aan dat Cdc42GAP−/− cellen een ROS-activiteit vertonen die vergelijkbaar is met die van WT-cellen, wat erop wijst dat Cdc42GAP de genomische stabiliteit reguleert via een endogeen Ros-onafhankelijk mechanisme. Vanwege de overeenkomsten van meerdere Cdc42GAP – / – muis fenotypen met die van een aantal gen gerichte muismodellen van DNA schadeherstelmoleculen, waaronder de BRCA1−/−p53+/−, Ku80−/−, en Mtr−/−Wrn muismodellen (12, 18, 19), hebben we de responsiviteit van de vroeg− gepasseerde Cdc42GAP−/ – cellen verder onderzocht op verschillende DNA schade agenten. In de DNA damage response growth assay, vertoonden de Cdc42GAP-deficiënte cellen een breed defect van de DNA-schadeherstelactiviteit (Fig. 4), die zich manifesteerden als significant hogere percentages celdood onder de homozygote cellen in vergelijking met WT-cellen na behandeling door verhoging van doses H2O2, ioniserende straling, camptothecin, methyl− methaansulfonaat of mitomycine C. aldus kunnen de geaccumuleerde diverse genomische afwijkingen die in de latere passages van Cdc42GAP−/ – cellen worden gevonden, ten minste gedeeltelijk worden toegeschreven aan verminderde DNA-schadeherstelactiviteiten.

een gevolg van aanhoudende genomische schade in de cellen is de inductie van meervoudige DNA-schade-respons en/of senescentiegenen (20, 21). De uitdrukkingen van p53, p21Cip1, p16Ink4a, en phospho-p53 (Ser-15) In Cdc42GAP−/− MEF cellen waren beduidend hoger dan die van WT MEF cellen na gelijkaardige passages, terwijl p19ARF in de homozygote cellen een gelijkaardige tendens van toename met passages, zoals de WT cellen (Fig. 5 A). De eiwitniveaus van p53, p21Cip1, p16Ink4a, fosfo-p53 (Ser-15), en de marker fosfo-H2 AX van de schade van DNA in Cdc42GAP−/− weefsels van 8 maanden oude muizen waren ook beduidend hoger dan die in de overeenkomstige weefsels van gematchte WT muizen (Fig. 5 B). Deze resultaten leveren bewijs dat de activering van de p53-gereguleerde route, p21Cip1 en p16Ink4a in het bijzonder, geassocieerd is met Cdc42GAP-deficiëntie-geïnduceerde vroege senescentie. Om de vraag te onderzoeken of verhoogde Cdc42-activiteit in de Cdc42GAP-deficiënte cellen voldoende is om het vroege senescentiefenotype te verklaren, hebben we een activerende mutant van Cdc42, Cdc42F28L, uitgedrukt in primaire WT MEF-cellen en onderzocht voor de sa-β-gal-activiteit van de cellen in vergelijking met die van overeenkomende EGFP-expressiecellen op verschillende passages. De uitdrukking cdc42f28l veroorzaakte een significante verhoging van Sa-β-gal-positieve celpopulatie (35% in Cdc42F28L cellen vergeleken met 7% in EGFP-uitdrukkende cellen) in vroeg passaged MEF cellen (Fig. 5 C), wat aangeeft dat Cdc42-activering voldoende is voor de inductie van vroege cel senescentie.

om de mogelijkheid verder te onderzoeken dat het senescentiefenotype van Cdc42GAP−/− cellen kan worden gered door een p53 defect, hebben we Cdc42GAP+/−p53+ / − muizen gegenereerd en geprobeerd MEF-cellen van de kruising voor te bereiden. Van de 44 embryo ‘ s werden er zes met het Cdc42GAP−/−p53+/− genotype en geen van het Cdc42GAP−/−p53−/− genotype verkregen. De Cdc42GAP – / – p53 + / – MEF-cellen groeiden met een snelheid tussen die van p53 + / – en WT-cellen en toonden een basale senescente populatie vergelijkbaar met die van p53+/− of WT-cellen bij passage 7, terwijl de p53−/− en Cdc42GAP- / -MEF-cellen zich vermenigvuldigden met een lineaire curve en een kromme-populatieverdubbeling en senescentie-resistent en senescentie-gevoelig waren bij vergelijkbare passages, respectievelijk (Fig. 5 D en E). Deze resultaten wijzen erop dat Cdc42 activering-veroorzaakte voortijdige senescentie van p53 afhangt.

De beperkte levensduur van cellen en dieren kan het gevolg zijn van replicatieve senescentie als reactie op verschillende spanningen, waaronder DNA-schade (22), telomeererosie (23), ROS (24) en/of onjuist geactiveerde oncogenen (25). De Cdc42GAP – / – muizen presenteren een gain-of-Cdc42-activiteit diermodel dat mitogene signaal-geïnduceerde Cdc42 activering nabootst (6) en een beoordeling van de mogelijke effecten van Cdc42 activering op dier-en celfysiologie mogelijk maakt. We tonen aan dat Cdc42GAP deficiëntie de vroege aanvang van senescentie in cellen en vroegtijdige veroudering-achtige fenotypen in het dier veroorzaakt. In het bijzonder, veroorzaakt het gen van Cdc42GAP het richten een globale verhoging van Cdc42 activiteit en bevordert celgenomic instabiliteit met verminderde de reparatiecapaciteit van de schade van DNA, die op zijn beurt p53 en P16 Ink4a kan activeren, leidend tot vroege senescentie (Fig. 5 F). Eerder, is Cdc42 gevonden om in senescente cellen te worden geactiveerd om morfologische aanpassing te moduleren (26). Het is ook voorgesteld om betrokken te zijn bij p53-gereguleerde celmorfologische verandering, apoptose, en proliferatie (27-29) en in C-Jun n-terminale kinase-gecontroleerde apoptose (30, 31), gebeurtenissen die zijn geassocieerd met cellulaire senescentie en dierlijke veroudering (32, 33). Onze bevindingen dat Cdc42-activering wordt geassocieerd met natuurlijke veroudering en dat Cdc42GAP-deficiëntie een defecte DNA-schadeherstel veroorzaakt om cellen toe te staan genomische afwijkingen te accumuleren die tot vroege senescentie leiden, suggereren verder een functioneel verband tussen Cdc42-activiteit en zoogdierveroudering.

activering van de p53-route of de verstoring van genen die betrokken zijn bij het herstel van DNA-schade of de genomische stabiliteitsregulatie, blijkt vroege veroudering bij muizen te veroorzaken (11, 12, 33, 34). In overeenstemming met eerdere waarnemingen dat Cdc42 mogelijk niet betrokken is bij het reguleren van cellulaire superoxide− activiteiten (17), vonden we dat de opgehoopte DNA− schade in Cdc42GAP – / – cellen niet geassocieerd is met de ROS-activiteit omdat homozygote cellen geen verhoogde ROS-activiteit vertonen. Cdc42GAP-schrapping veroorzaakt een duidelijke vermindering van het herstelvermogen van DNA-schade in een breed spectrum, met inbegrip van reacties op de DNA-kruisverbindende agent en de dubbelstrengbreukinductor of eenstrengbreukinductor, wat suggereert dat langdurige activering van Cdc42 het herstelvermogen van DNA-schade kan dempen. De diversiteit van de genomische schade Gevonden in de Cdc42GAP – / – cellen is ook consistent met een impact van een wereldwijd DNA-schadehersteldefect. De belangrijke vragen die nog moeten worden beantwoord zijn onder andere welke specifieke moleculaire determinanten betrokken zijn bij Cdc42GAP-gereguleerde DNA schadeherstel en welke upstream signaal(s) veroorzaakt een verhoogde Cdc42-GTP tijdens het normale verouderingsproces.