resultaten

karakterisatie van Plasmacytoïde dendritische cellen in de dunne darm.

we hebben standaardprocedures toegepast om immuuncellen in het epitheel (intra-epitheliaal, IE) en de LP uit de darm te isoleren. In beide celpreparaten vonden we een aparte populatie van CD11c+B220+Ly6C+ cellen die goed waren voor maximaal 1% van alle cellen. In tegenstelling tot pDC, waren myeloïde (m)DC (CD11c+MHCII+CD3−B220−Ly6C−) slechts aanwezig bij zeer lage aantallen in de IE voorbereiding (Fig. 1 A). Zowel pDC van de lp en IE voorbereiding toonde lage niveaus van oppervlakte MHC klasse II expressie (Fig. 1 A). Verdere analyse toonde aan dat CD11c + B220 + Ly6C + cellen van beide preparaten uniform de PDC markers pdca1 en 120G8 (Fig. 1 B). Cytospinen van gesorteerde pDC (CD11c + B220 + Ly6C+) en myeloïde DC (mDC) van de IE-bereiding onthulden een ronde en gladde, plasma cel-achtige morfologie van pDC, terwijl mDC de karakteristieke dendrieten (Fig. 1 C). Om de lokalisatie van pDC in de darm verder te karakteriseren, hebben we anti-B220, anti-120G8 en anti-CD3 mAb toegepast in immunohistologie. Micrografen werden willekeurig genomen uit secties en, zoals afgebeeld in Fig. 1 D, de positionering van 120G8 + B220 + CD3-cellen werd bepaald ten opzichte van epitheliale cellen met behulp van beeldanalyse (analyse; Olympus, Hamburg, Duitsland). Bij het evalueren van de positionering van ≈150 pDC zagen we dat 4,9% van deze cellen duidelijk in de epitheliale cellaag lag, terwijl nog eens 6,7% zich op een afstand van 5-10 µm van de top van de epitheliale cellen bevond (Fig. 1 D). Deze gegevens tonen aan dat een bepaalde hoeveelheid pDC zich in of dicht bij het intestinale epitheel bevindt, terwijl >80% van de geanalyseerde cellen op een afstand werden geplaatst >15 µm, wat ze tot LP-cellen maakt( Fig. 1 D). Omdat in het IE-en het LP-preparaat na standaardisolatieprocedures vergelijkbare aantallen pDC ’s aanwezig waren, is het momenteel onduidelijk of pDC’ s van het LP-preparaat het IE-preparaat verontreinigen of dat pDC ‘ s die zich in het epitheel bevinden efficiënter geïsoleerd zijn. Omdat we nauwelijks mDC binnen de IE voorbereiding vinden we de voorkeur aan de laatste mogelijkheid. Toch moet nog worden bepaald of beide populaties verschillende functies dienen of tot een gemeenschappelijke celpopulatie behoren. Omdat pDC van het IE-preparaat, in tegenstelling tot pDC van het LP-preparaat, door vrij zachte procedures kan worden geïsoleerd, werd in dit onderzoek uitsluitend pDC van het IE-preparaat gebruikt voor functionele tests.

Ccr9-expressie op intestinale pDC.

om de moleculaire mechanismen te identificeren die de migratie van pDC naar de darm mogelijk maken, analyseerden we de expressie van homing moleculen. Hoewel het duidelijk is dat de integrine aE (CD103) lymfocyten adhesie aan epitheliale cellen in de darm bemiddelt, zijn we er niet in geslaagd om expressie van dit integrine op intestinale pDC te identificeren. Ook CCR7 (Fig. 1 E), hoofdzakelijk betrokken bij homing van lymfocyten in perifere lymfoïde organen wordt niet uitgedrukt door pDC van de darm. Daarentegen hebben we hoge niveaus van CD18 (β2-integrine) en tussenliggende niveaus van α4β7 waargenomen, terwijl ≈50% van pDC P-selectine liganden (Fig. 1 E). Van belang, de overgrote meerderheid van intestinale pDC uitgedrukt hoge hoeveelheden van de chemokine receptor CCR9 (Fig. 1 E), terwijl mDC van de LP no of lage CCR-gehalten uitdrukte .

Ccr9 expressie van PDC geïsoleerd uit verschillende lymfoïde organen.rekening houdend met de uniforme expressie van ccr9 op intestinale pDC, analyseerden we de expressie van CCR9 op PDC geïsoleerd uit secundaire lymfoïde organen, waaronder milt, skin-draining LN, mesenteric LN, en Peyer ‘ s patches (PP; Fig. 2 A) en gebruikte CD4 + CD8 + thymocytes, gekend om hoge niveaus van ccr9 uit te drukken, als positieve controle (11); Fig. 2 B). Interessant is dat slechts een fractie van pDC aanwezig in een van deze organen uitgedrukt CCR9 (Fig. 2 A), terwijl ≈95% van de PDC geïsoleerd uit de BM droeg deze receptor (Fig. 2 C). De meeste BM pDC drukken ook CCR5 en CXCR3 uit, terwijl CCR2 slechts op ongeveer 25% van de cellen aanwezig is. CXCR4, waarvan bekend is dat het cellen aan de BM vasthoudt, wordt slechts zeer zwak uitgedrukt (Fig. 2 C). Samen, tonen deze gegevens aan dat pDC met diverse chemokine receptoren wordt uitgerust alvorens van BM wordt vrijgegeven. Deze functie maakt waarschijnlijk homing niet alleen naar plaatsen van ontsteking, maar ook naar de niet-ontstoken darm.

Fig. 2.

expressie van CCR9 op pDC. (A) cellen werden geïsoleerd uit verschillende lymfoïde organen zoals aangegeven. pDC werden aangesproken als CD11c + B220 + Ly6C+ en geanalyseerd voor de expressie van ccr9 (vaste lijn). B) CD4+CD8+ thymocyten diende als positieve controle. C) expressie van chemokinereceptoren (vaste lijnen) op PDC geïsoleerd van de BM (gearceerde zone: isotype controle). SPL, milt; ALN, axillary LN; MLN, mesenteric LN; PP, Peyer ‘ s patches; Thy, thymus). Representatieve gegevens van vier onafhankelijke experimenten met cellen samengevoegd van twee tot zes muizen elk (A en B) of van drie muizen (C).

Chemotaxis analyse van Flt3L-geëxpandeerde pDC.

gebaseerd op de sterke expressie van CCR9 op BM en intestinale pDC, vergeleken we de migratiecapaciteit van pDC en mDC naar de chemokine CCL25/TECK, de enige bekende ligand voor deze receptor (12). De frequentie van pDC varieert tussen verschillende muizenstammen en het is bekend dat bijvoorbeeld c57bl / 6 (B6) muizen veel minder pDC hebben dan 129SV muizen (13). Ongeacht de genetische achtergrond is het aantal pDC dat kan worden geïsoleerd uit muizenweefsels echter onvoldoende om standaard in vitro chemotaxis-tests uit te voeren. Om deze beperking te overwinnen hebben we de DC populatie in vivo uitgebreid door een Flt3-L-afscheidende tumorcellijn (B16-FL) in B6 muizen te implanteren gedurende 14 dagen (14).

gedurende deze periode nam het percentage CD11c+ – cellen in de milt toe van 3% tot 30-35% (gegevens niet getoond). Tachtig procent van de in vivo geëxpandeerde pDC uitgedrukt CCR9, met niveaus zeer vergelijkbaar met die aanwezig op BM pDC (Fig. 2 C en Fig. 4 C) terwijl in vivo geëxpandeerd mDC slechts kleine hoeveelheden van deze receptor uitdrukte (SI Fig. 6B). Milt pDC werden verrijkt met CD11c + MACS-sortering, wat resulteerde in 95% zuiverheid voor CD11c+ cellen die ≈15% Ly6C+B220+ pDC bevatten. In vitro transwellmigratieanalyses toonden een sterke chemotactische respons aan van pDC op CCL25, evenals op cxcl9, een ligand voor CXCR3 en op CXCL12, een ligand voor CXCR4. Slechts een zwakke respons werd waargenomen in de richting van CCL19, die dient als ligand voor CCR7. mDC vertoonde weinig chemotactische respons op CCL25 en CXCL9 en matige respons op CXCL12 en CCL19 (Fig. 3 A).

verminderde aantallen pDC in de dunne darm van Ccr9-deficiënte Muizen.

Op basis van deze waarnemingen hebben we de verdeling van pDC in ccr9-deficiënte muizen gekarakteriseerd. We vonden vergelijkbare percentages van pDC in Long en lever (SI Fig. 7) evenals bij inguinale en mesenterische lymfeklieren, terwijl het aantal milt pDC licht verhoogd was bij ccr9−/− muizen. Daarentegen zagen we een >90% afname van de darm en een 50% afname van PP pDC (Fig. 3 B).

pDC migreert bij voorkeur naar de dunne darm.

Op basis van de tot nu toe beschreven bevindingen leek het waarschijnlijk dat pDC CCR9 nodig heeft voor het Homen van de dunne darm. Om deze hypothese te bewijzen, we adoptief overgedragen cellen van B6 en ccr9−/− donoren die een Flt3-L-afscheidende tumor droeg 14 dagen. Onder invloed van Flt3L breidde pDC in vergelijkbare mate uit in B6-en ccr9 – / – muizen (Fig. 4 A en SI Fig. 8) en waren niet te onderscheiden met betrekking tot de expressie van CCR2, CCR5 en CXCR3 terwijl CCR9 alleen werd gedetecteerd op PDC afgeleid van B6 maar niet CCR9-deficiënte donoren (Fig. 4 C). Zonder verdere zuivering werden splenocyten van deze donoren geëtiketteerd met respectievelijk 5(6)-carboxyfluoresceïne diacetaat N-succinimidylester (CFSE) en 5(6)-carboxytetramethylrhodamine n-succinimidylester (TAMRA). Een mengsel van WT-en ccr9-deficiënte cellen, aangepast om gelijke aantallen pDC te bevatten, werd i. v. overgebracht in B6-ontvangers. Na 18 uur van overdracht, analyseerden we eerst de samenstelling van adoptief overgedragen WT cellen aanwezig in de IE en LP voorbereiding en merkten op dat 54% en 25% van alle cellen teruggevonden van de IE en LP fractie respectievelijk PDC waren (Fig. 4 B). Deze bevindingen tonen aan dat onder de diverse celpopulaties PDC huis het meest efficiënt naar de darm overgebracht. Uit deze competitieve overdrachten bleek ook dat ccr9-deficiënte pDC grotendeels verminderd is in hun vermogen om naar de darm terug te keren, zoals blijkt uit de lage migratieratio van CCR9-deficiënte Versus WT pDC die in het IE-en LP-preparaat wordt aangetroffen (Fig. 4 D). CCR9-deficiënte en B6 pDC migreerden daarentegen met een vergelijkbare efficiëntie als perifere en mesenterische lymfeklieren (Fig. 4 D). De aard van de celetikettering had geen invloed op deze experimenten omdat het verwisselen van de kleurstoffen tussen B6 en ccr9−/− cellen identieke resultaten opleverde (gegevens niet getoond). Hoewel deze gegevens duidelijk aantonen dat pDC CCR9 nodig heeft voor een efficiënte huishouding naar de darm, moet worden vermeld dat de trafficing eigenschappen van PDC van met Flt3-ligand behandelde muizen kunnen verschillen van die welke aanwezig zijn onder fysiologische situaties.

pDC worden gerekruteerd in de ontstoken darm.

omdat bekend is dat pDC een belangrijke rol speelt in anti virale immuniteit (4, 10) speculeerden we dat pDC in de darm zou kunnen worden gerekruteerd tijdens ontstekingsprocessen om de eerstelijnsverdediging te versterken. Van choleratoxine (CT) is bekend dat het darmontsteking veroorzaakt bij orale toediening en er is gemeld dat binnen 2 uur na orale toediening het aantal tijdelijk in de darm gerekruteerd mDC viervoudig toeneemt (15). We merkten op dat, naast mDC, pDC aantallen ook 3-voudig toenamen bij het voeden van B6 muizen met 10 µg CT (Fig. 4 E). Van belang is dat de identieke experimentele opstelling nooit heeft geleid tot een toename van pDC noch in de IE, noch in de LP-bereiding van ccr9-deficiënte muizen na 1, 2 of 3 uur CT-behandeling (Fig. 4 E en gegevens niet weergegeven). De specifieke vereiste voor ccr9 op pDC voor hun rekrutering in de darm tijdens ontstekingsprocessen werd bevestigd door adoptie overdracht van WT en CCR9-deficiënte PDC naar ccr9-deficiënte ontvangers gevolgd door toepassing van CT zoals hierboven beschreven. Terwijl adoptief overgedragen WT pDC ruimschoots aanwezig waren in het IE-en LP-preparaat, werden CCR9-deficiënte pDC bijna volledig uitgesloten van deze compartimenten (Fig. 4 F). Samen tonen deze resultaten aan dat tijdens ontstekingen pDC kan worden aangetrokken tot het darmslijmvlies en dat dit mechanisme voor een groot deel afhankelijk is van CCR9.

een rol voor intestinale pDC voor de snelle mobilisatie van LP myeloïde DC.

onlangs is aangetoond dat orale toediening van de TLR7/8 ligand resiquimod (R848) resulteert in de snelle mobilisatie van LP DC en dat TNFa, mogelijk vrijgekomen door pDC, bij dit proces betrokken is (16). We speculeerden dus dat intestinale pDC de bron van TNFa zou kunnen zijn die mogelijk de mobilisatie van naburige mDC activeert. Om deze hypothese te testen, stimuleerden we in vitro B6 pDC van de IE en LP voorbereiding voor 16 uur met R848. PDC secreteerde inderdaad aanzienlijke hoeveelheden TNFa, maar leverde geen detecteerbare hoeveelheden IL-2, IL-4, IL-5 of IFNy (Fig. 5 A). Vervolgens analyseerden we de mobilisatie van LP mDC in vivo na orale toediening van R848. Terwijl onbehandelde B6− en CCR9−/ – muizen niet verschilden met betrekking tot de aanwezigheid van intestinale mDC (Fig. 5 B) veroorzaakte orale R848 binnen 2 uur de mobilisatie van ≈60% van mDC in gew.maar slechts 10,8% in ccr9−/− muizen. Belangrijk is dat zodra ccr9-deficiënte muizen i. v. milt pDC van Flt3L-behandelde WT donoren 16 uur voorafgaand aan orale toediening van R848 kregen, deze deficiëntie in intestinale MDC mobilisatie volledig kon worden gered (Fig. 5 C). Deze experimenten tonen aan dat een ccr9-afhankelijke homing van PDC naar de darm betrokken is bij de snelle mobilisatie van intestinale mDC na orale toediening van een TLR7/8 ligand. Omdat anderen in het rattenmodel hebben aangetoond dat de toepassing van LPS ook de mobilisatie van LP mDC (17) induceert, hebben we 50 µg LPS i.p. toegepast op WT en ccr9-deficiënte dieren. Van belang is dat we onder deze experimentele omstandigheden geen verschil hebben waargenomen tussen WT en ccr9-deficiënte dieren met betrekking tot de mobilisatie van LP mDC (SI Fig. 9).