Studie ontwerp

VX-765 onderzoek: Vijf maanden oude voertuig-geïnjecteerd WT (WT + voertuig; n = 18) en J20 muizen (J20 + voertuig: n = 14), en VX-765-geïnjecteerd J20 muizen (J20 + VX-765: n = 13) muizen werden in de lengterichting beoordeeld op vijf verschillende tijdstippen: nulmeting vóór de behandeling (baseline onbehandeld J20 waren gegroepeerd; n = 19), na drie IP-injecties per week van VX-765 of vehiculum (behandeling 1), na zes extra injecties over 2 weken (behandeling 2), Na 4 weken wash-out periode (WO), en na nog eens drie injecties in 1 week (behandeling 3) (Fig. 1 bis). Alle geteste dieren werden in de analyses opgenomen, tenzij a) Het dier tijdens het experiment stierf of b) Het dier niet op een gedragsmatige manier reageerde. In totaal werden 25 nesten gebruikt, verspreid over vier verschillende cohorten en getest op verschillende tijdstippen. Drie van deze cohorten ondergingen NOR en open veld testen, terwijl cohort 4 werd gebruikt voor Barnes maze. Nadat de dieren op de uitgangssituatie waren getest om te bevestigen dat J20 dieren een gedragstekort hadden, werden J20 dieren willekeurig toegewezen aan een vehiculum-of VX-765-behandeling, onafhankelijk van de gedragsprestatie. Van alle gebruikte dieren vertoonden vier J20 muizen aan het begin van het experiment geen gedragstekorten en werden ze niet gebruikt. Twee J20 + – voertuigmuizen bewogen helemaal niet tijdens het experiment en hun gedragsgegevens werden uitgesloten; deze dieren werden echter gehouden en werden nog steeds gebruikt voor postmortemanalyse.

casp1 validatiestudie: om Casp1-specifieke effecten van VX-765 te valideren, werden J20 muizen gegenereerd op een casp1−/− achtergrond. Er werden drieënzeventig muizen gebruikt (n = 12-13 per genotype, zes verschillende genotypen), die allemaal werden gefokt door middel van in-vitrofertilisatie (IVF) van 35 vrouwelijke donordieren. Fokgegevens worden beschreven in de sectie dierstudies hieronder. Alle muizen werden gedragsmatig beoordeeld tussen de leeftijd van 7 en 8 maanden en er werden geen dieren uitgesloten van deze studie.

alle muizen werden gedood en behandeld op de leeftijd van 8 maanden. Behavioural scoring werd verblind voor het genotype en de behandeling van muizen, en alle dieren werden willekeurig toegewezen voor biochemische of histologische analyse en blindelings geanalyseerd.

VX-765, VRT-043198 IC50 assays on recombinant caspases

dierstudies

alle dierprocedures volgden de Canadian Council on Animal Care guidelines en werden goedgekeurd door het McGill University Animal Care committee. De J20 transgene muis lijn (Jax Stock No. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) drukt de Zweedse (670/671KM→NL) en Indiana (717V→F) menselijke APP mutaties uit onder de PDGF-ßpromoter. Mannelijke J20 muizen werden gebruikt als fokkers en hun sperma werd gebruikt voor IVF kolonie uitbreiding.

Genotypes werden bepaald door staartbiopsie en RT-PCR. Muizen werden in groepen gehuisvest (2-4 dieren per kooi) in standaard macrolon kooien onder een 12-uur omgekeerde licht/donker cyclus en gecontroleerde omgevingsomstandigheden. Voedsel en water waren beschikbaar ad libitum.

VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) werd opgelost in 20% cremophor in dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) en intraperitoneaal toegediend. Met voertuigen behandelde J20-en WT-muizen kregen alleen cremophor.

Permeabiliteitsanalyse van de bloed-hersenbarrière

vijf maanden oude J20-en WT-muizen werden verdoofd met isofluraan en de rechter halsslagader werd gescheiden. Een kleine incisie werd gemaakt langs de halsslagader en een micro-katheter werd ingebracht in de ingang van de interne halsslagader. De katheter werd vastgezet met hechtdraad. VX-765 (50 mg kg−1) werd geïnfundeerd bij 50 µl min−1 (90-120 µl totaal volume). De microkatheter bleef nog 5 minuten over om diffusie mogelijk te maken, waarna bloed werd verzameld door intra-hartpunctie. De muis werd transcardiaal geperforeerd met ijskoude zoutoplossing en de hippocampus en cortex werden eruit gehaald. Monsters werden verzonden naar het Biofarmacy platform (Université de Montreal) voor vloeistofchromatografie en tandem massaspectrometrie analyse.

gedragsanalyse

Open veld: de bewegingsactiviteit werd gemeten met behulp van een hvs2100 geautomatiseerd volgsysteem (HVS Image, Hamptom, UK). Muizen werden geplaatst in de open veld kamer (40 × 40 cm Plexiglas doos, geen plafond, en witte vloer) en toegestaan om te verkennen voor 5 minuten.

nieuwe objectherkenning (nor): muizen werden gedurende 5 minuten vooraf blootgesteld aan twee identieke objecten in de open veldkamer. Twee uur na de pre-blootstelling werden muizen terug in de kamer geplaatst en gedurende 5 minuten blootgesteld aan een bekend object en een nieuw object. Muizen werden slechts eenmaal blootgesteld aan een specifiek object in verschillende testsessies, en nieuwe objectplaatsing werd gecompenseerd binnen elke behandelingsgroep. Percentage aanrakingen van het nieuwe object tijdens de testfase en discriminatie index ((#raakt roman – # raakt vertrouwd) / totale aanrakingen) werden beoordeeld.

Barnes maze: Het Barnes maze platform (91 cm diameter, 90 cm van de vloer) bestond uit 20 gaten (elk 5 cm in diameter). Alle gaten waren geblokkeerd, behalve één doelgat dat leidde naar een verzonken ontsnappingskast. Ruimtelijke signalen, helder licht en witte ruis werden gebruikt om de muizen te motiveren om de ontsnapping te vinden tijdens elke sessie. Voor de aanpassingsfase verkende elke muis het platform gedurende 60 s. elke muis die de ontsnappingskast niet vond werd er naar toe geleid en bleef er 90 s. voor de acquisitiefase volgde elke proef hetzelfde protocol, met als doel om elke muis te trainen om het doel te vinden en de ontsnappingskast binnen 180 s in te voeren. Muizen bleven in de doos voor een extra 60 s. vier proeven per dag, ongeveer 15 minuten uit elkaar, werden uitgevoerd gedurende 4 opeenvolgende dagen. In de probe-test (dag 5) voerde elke muis één 90 s-proef uit. Het doelwit was nog steeds in dezelfde positie, maar de ontsnappingsdoos was geblokkeerd. De latentie en fouten om het doel te bereiken, plus het aantal muisprikken aan elk van de gaten (doelvoorkeur) werden gemeten. Het Y-doolhof was samengesteld uit een symmetrisch Y-vormig doolhof met drie armen 120° van elkaar, aangeduid als A, B, en C. dieren werden geplaatst aan het distale uiteinde van arm A en toegestaan om het doolhof te verkennen voor 5 minuten. Totaal aantal deelnemers in de arm en spontane afwisseling, gedefinieerd als opeenvolgende deelnemers in drie verschillende armen, werden geregistreerd. De procentuele afwisseling werd bepaald.

Weefselverwerking

voor immunohistochemie werden muizen (n = 4-6 per groep) verdoofd met isofluoraan en transcardiaal geperforeerd met ijskoude zoutoplossing gevolgd door ijskoude 4% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) in 0,1 m fosfaatgebufferde zoutoplossing. Hersenen werden gepost-fixeerd in 10% neutraal-gebufferde formaline (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Canada) voor 16 uur en overgebracht naar 70% ethanol. De hersenen waren paraffine ingebed en verdeeld op 4 µm.

voor western blot en ELISA (n = 4-8 per groep) werden onder narcose gebrachte muizen cervicaal ontwricht, de hippocampus en de cortex ontleed en onmiddellijk ingevroren op droog ijs. Eiwitten werden geëxtraheerd in 5 × volume / gewicht met RADIOIMMUNOPRECIPITATION assay (RIPA) buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% Na-deoxycholaat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 van proteasen Inhibitors Cocktail (Sigma-Aldrich)) op ijs met een weefselhomogenizer (Omni International, Kennesaw, GA, USA). De monsters werden gedurende 20 minuten gecentrifugeerd (20.000 × g, 4 °C), het supernatans teruggevonden en het eiwit gekwantificeerd met behulp van de BCA-methode. De in RIPA onoplosbare pellet werd verder geëxtraheerd in 70% mierenzuur in dH2O, verdampt en opgelost in 200 mM Tris-HCl, pH 7,5.

Immunohistologische kleuring

epitopen werden ontmaskt in citraat (10 mM Tris-Na Citraat, pH 6,0) of EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9.0) antigeen retrievalbuffer, en immunostained met behulp van de Dako Autostainer Plus geautomatiseerde slide processor en EnVision Flex systeem (Dako, Burlington, ON, Canada). Volgende deparaffinization en hydraten, secties werden peroxidase behandeld, geblokkeerd in serum-vrij-eiwit blokkeren, en immunostained met de volgende antilichamen verdund in de Ogen Flex-Antibody Diluent: 1:2000 konijn anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, USA), 1:8000 konijn anti-GFAP (Dako Z-0334), 1:2000 konijn anti-Aß1-40 (F25276, laboratorium ontwikkeld), en 1:1000 muis antisynaptophysin (Sigma-Aldrich S5768). De secties werden behandeld met het door de kit geleverde geschikte HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam van muizen of konijnen en gevisualiseerd met schar. Secties waren hematoxyline tegenbehandeld, gedehydrateerd, en coverslipped met Permount (Fisher Scientific). Secties werden digitaal gescand met MIRAX SCAN voor analyse (Zeiss, Don Mills, on, Canada). Na deparaffinisatie en rehydratie werden de glaasjes gekleurd met gefilterd 1% waterig Thioflavine-S (Sigma-Aldrich).

kwantitatieve immunohistologische analyse

Iba1-positieve cellen in de cortex en het anterieure gedeelte van het CA1-gebied van de hippocampus werden gekwantificeerd met behulp van een aangepaste versie van het areal counting frame48. Kort, elke vijfde dia werd gekwantificeerd (resulterend in vier secties per hersenen). Meerdere ×80 beelden werden genomen met de MIRAX SCAN binnen het gebied van belang en het aantal Iba1-positieve cellen werd handmatig geteld. De numerieke dichtheid (aantal cellen mm-3) in het voorste CA1-gebied en de cortex werd geschat. Een minimum aantal van 150 hits per gebied was nodig om een betrouwbare schatting te maken. Extra secties werden geteld als we niet in staat waren om ons minimumaantal te bereiken. Kwantificering werd geblindeerd uitgevoerd voor behandeling en genotype. ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA) werd gebruikt om Aß accumulatie, GFAP en synaptofysine immunopositieve kleuring in de CA1 regio en cortex te meten. Vier secties per hersenen werden geanalyseerd, en meerdere beelden werden genomen binnen elke sectie om het CA1-gebied en de cortex te behandelen. De drempelwaarde werd in alle hersenen even aangepast om het gebleekte gebied te markeren, en deeltjes werden geanalyseerd om het totale gebied van kleuring te bepalen. De resultaten worden uitgedrukt als totale gekleurd oppervlak per geanalyseerde totale oppervlakte (µm2 mm−2). Representatieve beelden zijn alleen bijgesneden om te voldoen aan de beperkingen van de grootte en hebben geen enkele nabewerking ondergaan.

Western blotting

Muizeneiwitmonsters (25-100 µg) werden bereid in Laemmli (5% 2-β-mercaptoethanol, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 proteaseremmers Cocktail (Sigma-Aldrich)), gekookt gedurende 5 minuten en gescheiden door polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). Monsters werden gesondeerd met de volgende primaire antilichamen, verdund in ofwel 5% magere droge melk in Tris-gebufferde zoutoplossing en 0,1% Tween-20 of PBS-blokkeringsbuffer (Thermoswetenschappelijk): 1: 1000 anti-humane muizen Aß1-16 (6E10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA), 1:2000 konijn anti-APP C-terminus (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 konijn anti-neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 konijn anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 konijn anti-Caspase-3 (Cell Signaling 9665), 1:1000 muis antiactive Caspase-8 (Cell Signaling 8592), 1:1000 konijn anti-Caspase-9 (Cell Signaling 9504), en 1:5000 muis-anti-β-actin (Sigma-Aldrich A5441). Blots werden gedetecteerd met 1:5000 HRP-gekoppeld anti-muis (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) of 1: 5000 anti-konijn (Dako P0217) secundair antilichaam gevolgd door ECL (GE Amersham). Immunoreactieve banden werden gevisualiseerd met behulp van ImageQuant LAS 4000 imaging system (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA), en densitometrische analyses werden uitgevoerd met Image Gauge analysis software (Fujifilm USA). Helderheid / contrast van RAW blots werden even aangepast over het hele beeld met Adobe Photoshop CS5-software (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) om representatieve beelden te genereren. Er werden geen aanvullende wijzigingen aangebracht. CanvasTM X software (Acd system, Plantation, FL, USA) werd gebruikt om definitieve cijfers te maken. Raw blots voor western blots zijn beschikbaar in aanvullend Figuur 11.

ELISA

Pro-en anti-inflammatoire cytokines, en Aß-spiegels in muizenhersenen werden bepaald met behulp van elektrochemiluminescentie immune assay kits van Meso Scale Discovery (Rockville, MD, USA). Normen en monsters werden opgesteld volgens de protocollen van de fabrikant en uitgevoerd in tweevoud. Het pro-inflammatoire paneel van de muis ten-plex werd gebruikt voor Muis hippocampaal en corticale en monsters. Er werd een enkele IL-1β-kit gebruikt om muisplasma te meten. Het menselijke pro-inflammatoire paneel met vier plex werd gebruikt voor HPN-monsters (zie hieronder). De vier-panel menselijke Aß 6E10 kit werd gebruikt voor Muis hippocampus en cortex, en HPN monsters.

RNA-extractie en cDNA-synthese

totaal RNA werd geëxtraheerd uit muizenhipocampus en cortex (n = 3 per groep) met Qiazool (Qiagen, Valencia, CA, USA) gevolgd door homogenisatie met een naald van 20 gauge. De miRNeasy MINIKIT, met inbegrip van de behandelingsstap van de kolom DNase, werd gebruikt om totaal RNA (Qiagen) te zuiveren. De kwaliteit en kwantiteit van RNA werden bepaald met behulp van een spectrofotometer (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, USA). Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Producten werden gevisualiseerd op RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Canada) gekleurd 2% agarose gels. Real-time PCR experimenten werden uitgevoerd met SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) op een Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systeem machine (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Genamplificatie werd uitgevoerd met de volgende primers: (18s) 5 ‘- GTAACCCGTTGAACCCAT-3 ‘en 5′ – CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′; (IDE) 5′ – ACTAACCTGGTGGTGAAG-3′ en 5′ – GGTCTGGTATGGAAATG-3′; (Neprilysin) 5′- TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3′ en 5′- CTCCCCACAGCATTCTCCAT-3’. De resultaten worden uitgedrukt als fold-inductiewaarden genormaliseerd om HPRT en 18S referentiegenen te betekenen met behulp van de Pfaffl-methode.

Muissynaptische plasticiteit RT2-Profiler PCR array

De muissynaptische plasticiteit RT2 Profiler PCR Array (PAMM-126Z, Qiagen) beschrijft de expressie van 84 genen betrokken bij synaptische veranderingen tijdens leren en geheugen en vijf huishoudgenen (β-actine; β-2-microglobuline; glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase, GAPDH; β-glucuronidase, Gusb; Hitteschok eiwit 90 Alfa (cytosolic), Hsp90ab1) met real-time PCR. Totaal RNA (465 ng voor elk monster) werd omgekeerd getranscribeerd (inclusief een genomische DNA-eliminatiestap) volgens het Protocol van de fabrikant (eerste bundel cDNA Synthesis Kit, Qiagen). De real-time PCR reactie werd uitgevoerd in een real-time cycler ABI 7500 (Fast Block) (Applied Biosystems) met behulp van de RT2 SYBR Green/ROX PCR master mix (Qiagen). De cycli waren als volgt: 2 min bij 50 °C, 10 min bij 95 ° C, 40 cycli, 15 s elk bij 95 °C en 1 min bij 60 ° C. Drempelwaarde en basislijn werden handmatig ingesteld volgens de instructies van de fabrikant. De gegevens werden genormaliseerd naar het geometrisch gemiddelde van de vijf huishoudgenen en geanalyseerd met behulp van de vergelijkende Ct-methode (2−ΔCT).

neuronale celcultuur en axonale degeneratietest

twaalf tot zestien weken oud foetaal corticaal weefsel werd verkregen van het Birth defecten Research Laboratory (University Of Washington, Seattle, USA) in overeenstemming met een goedgekeurd protocol door de McGill institutional review board. HPN werd gekweekt uit hersenen die met trypsine werden gescheiden, met deoxyribonuclease I werden behandeld, en door 130, 70, en 30 µm nylon mesh21 werden gefilterd. Gedissocieerde cellen werden gedurende 10 minuten bij 300 × g gecentrifugeerd en geresuspendeerd in minimal essential medium (MEM) met Earle ‘ s zouten, aangevuld met 5% gedecomplementeerd BCS, 1× penicilline-streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat en 2 mM L-glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Cellen werden gezaaid met een dichtheid van 3×106 cellen ml-1 op 5 µg mL−1 poly-l-lysine-gecoate zes-put weefselkweekplaten (Sigma-Aldrich). MEM-medium werd om de 2 dagen veranderd en astrocytenproliferatie werd beperkt met fluorodeoxyuridince (FdU) antimitotische behandeling (1 mM, Sigma) gedurende de eerste 4 dagen. Neuronale culturen werden gekweekt 7-10 dagen voor het uitvoeren van experimenten. Vier verschillende neuronpreparaten werden op verschillende tijdstippen getest. Een van de neuronpreparaten was niet stabiel en de kweek, inclusief de Serum + – controle die geen medicijn kreeg, stierf in het midden van het experiment. Daarom werden drie verschillende neuronpreparaten van drie genetisch verschillende donoren gebruikt.

VX-765 toxiciteit werd beoordeeld met 3-(4,5-dimethylthiazool-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT). Neuronen werden behandeld met 25-200 µM VX-765 of 0,1% DMSO (hoogste gebruikte DMSO-concentratie) gedurende 72 uur. neuronen werden vervolgens geïncubeerd met 0,5 µg ml-1 MTT (Sigma-Aldrich) gedurende 4 uur bij 37 °C (5% CO2). De formazan-kristallen werden gedurende 30 minuten opgelost in 100 µl DMSO. De absorptie werd gemeten bij 560 en 670 nm met behulp van de Synergy H4-plaatlezer.

axonale degeneratie werd veroorzaakt door APPWT transfectie of stress bij serumdeprivatie. VX-765 werd toegediend als een voorbehandelingsstrategie (1 uur vóór stressor) of als een postbeading-behandelingsstrategie (48 uur na stressor). Neuronen werden getransfecteerd door Gene gun (BioRad, Mississauga, ON, Canada) met gouden kralen bedekt met pBudCE41-eGFP voor fluorescentie visualisatie. Neuronen die met appwt gestresst waren werden getransfecteerd met pBudCE41-eGFP/APPWT. Kort, neuronen werden behandeld met medium aangevuld met 25 of 50 µM VX-765, 5 µM Casp1 inhibitor Z-YVAD-fmk, of DMSO. Fluorescentiebeelden werden elke 24 uur (tot 72 uur na de behandeling) genomen met een Nikon Eclipse ti microscoop (Nikon, Mississauga, ON, CA) en fotometrie coolSNAP HQ2 CCD camera (Photometrics, Tucson, AZ, USA) met behulp van NIS Elements AR 3.10 software (Nikon). Het percentage neuronale beading werd gemeten door het aantal beaded eGFP-positieve neuronen over het totale aantal eGFP-positieve neuronen op elk tijdstip te tellen. Een minimum van 150 eGFP-positieve neuronen werd geteld voor elke aandoening. Geconditioneerde medium werd bemonsterd (aangevuld met 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 van proteasen Inhibitors Cocktail (Sigma-Aldrich)), en neuronen werden geoogst in cellysis buffer (50 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 0,1 mM EDTA) voor analyse.

statistische analyses

het aantal dieren of onafhankelijke experimenten en de gebruikte statistische analyse (ANOVA en post-hocvergelijkingen) zijn allemaal vermeld in de figuur legends. Alle waarden worden uitgedrukt als het gemiddelde ± s. e. m., met F-en p-waarden aangegeven in de figuur legends. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 7 software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).