discussie

deze studie heeft een rol blootgelegd voor het SR luminaal Ca-bindend eiwit, CSQ2 bij het reguleren van excitatie–contractie koppeling en CICR in het hart. Specifiek tonen we aan dat Ad-gemedieerde overexpressie van CSQ2 de grootte van zowel cel-gemiddelde ICA-geïnduceerde CA transiënten en spontane CA vonken in geïsoleerde hartcellen dramatisch verhoogde. Analyse van de stijgende fase en snelheid van verandering van deze ca signalen gaf aan dat hun vergrote grootte te wijten was aan vertraagde beëindiging van de onderliggende CA-release fluxen van de SR. naast het verlengen van actieve Ca release, werd de dynamiek van het functionele opladen van Sr Ca opslag ook vertraagd in cellen met verhoogde CSQ2 eiwitniveaus, zoals aangegeven door vertraagde hersteltijd voor repetitieve CA vonken. We verkregen in wezen de tegenovergestelde resultaten in myocytes, waarin CSQ2 niveaus werden verminderd door Ad-gemedieerde antisense transductie. Deze myocyten vertoonden een kortere Ca-release, maar een versnelde restitutie van ca-release plaatsen. Bovendien veroorzaakte de toepassing van isoproterenol in periodiek gestimuleerde myocyten met verlaagde CSQ2-niveaus intracellulaire aritmogene oscillaties van isoproterenol . Deze resultaten tonen aan dat CSQ2 een belangrijke determinant is van de SR Ca releasing functie die werkt door het regelen van Ca-release duur en release site refractoriness. In het licht van de waargenomen isoproterenol-afhankelijke stoornissen in ritmische CA-cycli in myocyten die CSQ2 onderexpressie, zijn onze resultaten relevant voor het begrijpen van de cellulaire mechanismen van catecholamine-geïnduceerde aritmieën gekoppeld aan mutaties van het CSQ2-gen.

moleculaire mechanismen van CSQ2 actie. We schrijven de waargenomen effecten van CSQ2 op SR Ca release toe aan het vermogen van dit eiwit om te functioneren als een moleculaire buffer die de Vrije in de SR luminale ruimte controleert (zie voorgesteld schema in Fig. 5). Het is bekend uit lipide bilayer studies dat de binding van Ca aan het luminal aspect van het RyR complex (d.w.z., Luminal CA sensor) kanaal activiteit verhoogt, terwijl bij verlaagde luminal, kanaal activiteit wordt verminderd (EC50 ≈ 1 mM; ref. 26). Omdat veel RyRs in een geactiveerde staat zouden zijn bij normale rust luminale Ca-niveaus (≈1 mM), zou het verlagen van luminale tijdens het releaseproces daarom de totale kanaalactiviteit verminderen (een proces dat luminale Ca-afhankelijke deactivering wordt genoemd; ref. 3). Onze resultaten suggereren dat door het stabiliseren van de lokale vrije luminal in de buurt van RyRs tijdens het releaseproces, CSQ2 de Luminal Ca-afhankelijke sluiting van het RyR-kanaal vertraagt, waardoor de hoeveelheid Ca die van de SR naar het cytosol wordt vrijgegeven, wordt verhoogd. CSQ2 regelt ook de hersteldynamiek van vrije intra-SR tijdens de heropname van Ca door te dienen als een sink voor Ca in het SR lumen. Zo versterkt CSQ2 niet alleen de SR Ca efflux maar stabiliseert ook CICR door het moduleren van de functionele restitutie, of gereedheid, van ca-release sites na elke release. Onlangs hebben we een soortgelijk mechanisme aangeroepen om de effecten te verklaren van Low-affinity CA chelatoren (organische zouten) geladen in de SR op Ca release (3). Het belang van onze huidige bevindingen is dat ze laten zien hoe het vrijgaveproces wordt gecontroleerd door een endogeen, SR-resident Ca-bindend eiwit, CSQ2. Ze onthullen ook de pathologische gevolgen van verminderde CSQ2 hoeveelheden in de SR van hartcellen.

Er is voorgesteld dat CSQ2 de Ca-release channel functie kan beïnvloeden door directe interacties met eiwitten die het Ca-release channel complex (d.w.z. RyR, junctine, en/of triadin) vormen (ref. 13; zie ref. 9). Onze studies hebben geen aanzienlijke verschillen in de parameters van SR Ca release tussen cellen met ongeveer 3-voudige verhoogde niveaus van CSQ2 eiwit en cellen waarin organische buffers werden geladen in de SR (3). De eenvoudigste verklaring voor onze bevindingen is dus dat de overheersende effecten van CSQ2 op de afgifte van Sr Ca te wijten zijn aan de bufferwerking van dit eiwit in de SR. opheldering van het gedetailleerde mechanisme waardoor CSQ2 en geassocieerde eiwitten zoals junctine en triadin reguleren CA release moet wachten op studies waarbij manipulatie van niveaus en expressie van mutante vormen van deze eiwitten met veranderde mogelijkheden om te interageren tussen zichzelf en de RyR.

De maximale snelheid van Ca-afgifte uit gestimuleerde myocyten was vergelijkbaar, ongeacht de hoeveelheden CSQ2 uitgedrukt in de SR (Fig. 2B en 3D). Deze resultaten ondersteunen het idee dat CSQ2 de beëindiging van het vrijgaveproces controleert, maar deze resultaten zijn niet wat men noodzakelijkerwijs zou voorspellen op basis van de verwachte buffereffecten van dit eiwit in de SR. inderdaad, de maximale snelheid van afgifte zou naar verwachting hoger zijn in cellen met verhoogde luminale CA-buffersterktes veroorzaakt door vertraagde afname van de vrije intra-SR , omdat, in deze cellen, de vertraagde afname van de CA-gradiënt over het SR-membraan zou worden verwacht om grotere CA flux intensiteiten te maken. Verschillende mogelijke redenen verklaren waarom dit niet werd waargenomen. Een mogelijkheid is dat de initiële vrije intra-SR lager kan zijn in CSQ2-overexpressie dan in CSQ2-onderexpressie cellen. Hoewel bij steady-state Het Vrije in een gesloten compartiment zoals de SR niet zou moeten worden beïnvloed door het aantal Ca-bindingsplaatsen (dit zou alleen de kinetiek moeten beïnvloeden waarbij steady-state intra-SR wordt bereikt), is het mogelijk dat een echte steady-state niet werd bereikt in onze experimenten (d.w.z., myocyten ondergaan lage snelheid stimulatie). Een andere mogelijkheid is dat de aanwezigheid van verhoogde niveaus van CSQ2-eiwit de verspreiding van Ca in de luminale ruimte vertraagt, waardoor de exodus van Ca via de open kanalen wordt vertraagd. Het is duidelijk dat er meer onderzoek nodig is, zowel experimenteel als theoretisch, om dit probleem op te lossen.

beëindiging van CICR. Hoe CICR, een proces met een inherente neiging tot zelfregeneratie, wordt beëindigd, is onderwerp van intensief onderzoek geweest, eerst door metingen van globale Ca transiënten te gebruiken en, meer recent, door Ca vonken te onderzoeken (3, 27-30). Een mogelijkheid die is overwogen is dat de RyR-kanalen Ca-afhankelijke inactivering of aanpassing ondergaan als gevolg van de opkomst van op de cytosolic kant van het kanaal (27-29). Een andere mogelijkheid is dat de daling van de intra-SR een actief signaal geeft voor sluiting van RYR ‘ s nadat ze geopend zijn (3, 30-32). We hebben onlangs direct experimenteel bewijs gevonden voor een rol van luminale CA-geïnduceerde veranderingen in RyR activiteit (d.w.z., luminale Ca-afhankelijke deactivering) in beëindiging van SR CA release door het klemmen van de niveaus van intra-SR met lage-affiniteit Ca buffers geladen in de SR cisternae (3). Met behulp van deze buffers verlengde we dramatisch de duur van actieve CA-afgifte die ten grondslag ligt aan zowel focale als globale CA-transiënten in myocyten. In overeenstemming met deze bevindingen tonen onze huidige resultaten aan dat het verhogen van de niveaus van de hoge capaciteit SR luminal Ca buffer CSQ2 de CA-afgifteduur verlengt, terwijl het verminderen van hoeveelheden van deze endogene buffer de afgifteduur verkort, blijkbaar door respectievelijk de Luminal Ca-afhankelijke sluiting van RyRs te vertragen of te versnellen. Samen leveren deze resultaten overtuigend bewijs voor de rol van luminale Ca-afhankelijke deactivering van RyRs in beëindiging van CICR. Hoewel het belang van veranderingen in Luminal Ca bij de beëindiging van SR Ca-release wordt aangetoond, sluiten onze resultaten niet noodzakelijk de mogelijkheid uit dat aanvullende mechanismen, zoals inactivatie of aanpassing van RyR op cytosolische CA-regelgevende locaties, ook de beëindiging van de CA-release kunnen beïnvloeden.

hoewel er duidelijk bewijs is voor een rol voor veranderingen in Luminale Ca bij de beëindiging van hartvonken (ref. 3; uit eerdere studies bleek dat ca-vonken in skeletspieren mogelijk niet gepaard gaan met substantiële depletie van de SR . Lacampagne et al. (33) gebruikte kinetische analyse van hoge temporele resolutie Ca spark opnames om te suggereren dat de CA-release flux die ten grondslag ligt aan de CA spark constant is in amfibie spiervezels. Omdat Sr Ca flux moet afnemen wanneer de SR valt, kan dit resultaat betekenen dat luminal CA niveaus stabiel blijven tijdens de CA vonken. Zo bestaat de mogelijkheid dat de basismechanismen die verantwoordelijk zijn voor vonk-beëindiging verschillend zijn in hart-en skeletspieren. De uitvoering van aanvullende studies in deze twee celtypen (d.w.z., modulatie van CSQ eiwitniveaus in skeletspiervezels en snelle CA vonk kinetics metingen in cardiale myocyten) moet helpen om dit probleem te verduidelijken.

relevantie voor CPVT. Een van de belangrijkste aspecten van onze resultaten is dat ze laten zien hoe verlaagde CSQ2-waarden hartritmestoornissen op cellulair niveau kunnen veroorzaken. CPVT is een aritmogene ziekte die wordt gekenmerkt door syncope en plotselinge dood die wordt geïnduceerd door lichaamsbeweging en catecholamineinfusie (34). Tot nu toe zijn vier mutaties gekoppeld aan CPVT. Drie van deze mutaties lijken te resulteren in een verminderde CSQ2 expressie (17), en één mutatie is voorgesteld om te leiden tot een verstoorde binding van Ca (16). Onze resultaten suggereren dat de onderliggende oorzaak van CPVT gerelateerd kan zijn aan abnormale restitutie van het Ca-release mechanisme veroorzaakt door verminderde CSQ2 niveaus (Fig. 5). Vanwege de lagere concentratie van Ca-bindingsplaatsen in de SR van cellen die CSQ2 onderexpresteren, vindt het bijvullen van de CA-opslag door de SERCA-pomp sneller plaats dan in normale cellen. Het opladen van de opslag wordt nog sneller wanneer de activiteit van SERCA wordt gestimuleerd door proteïnekinase a, wat mogelijk de afhankelijkheid van klinische episodes van CPVT op catecholamines verklaart. In myocyten met verlaagde CSQ2-spiegels leidde voortijdig herstel van Ca-afgiftekanalen uit een luminale Ca-afhankelijke refractaire toestand tot spontane, extrasystolische ontladingen van Sr-CA-opslag. Het is bekend dat spontane CA-afgifte binnenstromen en oscillaties in het membraanpotentiaal kan induceren, wat resulteert in geactiveerde aritmie (4-7). Daarom zouden de waargenomen verstoringen in de behandeling van Ca, ten minste gedeeltelijk, de pathogenese van CPVT geassocieerd met genetische defecten kunnen verklaren die resulteren in een verminderde Ca-binding activiteit (16) of verminderde expressie niveaus van CSQ2 (17).

vergelijking met eerdere Studies bij transgene muizen. Onze bevindingen verschillen van eerdere resultaten verkregen bij transgene muizen overexpressie van CSQ2 (14, 15). In deze onderzoeken verhoogde een 10-tot 20-voudige overexpressie van CSQ2 de SR Ca-opslagcapaciteit van geïsoleerde cardiale myocyten; de luminale Ca was echter niet beschikbaar voor afgifte, wat leidde tot depressieve globale en lokale CA-afgifte signalen. Deze veranderingen in de behandeling van Ca gingen gepaard met verscheidene structurele, functionele en biochemische veranderingen op de cellulaire en subcellulaire niveaus en de ontwikkeling van cardiale hypertrofie en falen. Aan de andere kant, handhaaft de huidige studie CSQ2 eiwitniveaus dichter bij fysiologische niveaus onder acute eerder dan chronische voorwaarden; daarom zullen deze gegevens waarschijnlijk nauwkeuriger de directe fysiologische gevolgen weergeven van veranderingen in CSQ2-eiwitniveaus op intracellulaire CA-behandeling. Deze resultaten wijzen op de potentiële problemen bij het interpreteren van de effecten van constitutieve expressie op hoog niveau van eiwitten in transgene diermodellen en de waarde van aanvullende studies in meer acute settings.

conclusie. Concluderend hebben we ontdekt dat CSQ2 een essentiële determinant is van het vermogen van de SR om Ca in de hartspier op te slaan en vrij te geven. CSQ2 lijkt te dienen als een reservoir voor Ca dat gemakkelijk toegankelijk is voor CICR en ook als een actieve CA-buffer die lokale Luminale Ca-afhankelijke sluiting van RyRs moduleert. Tegelijkertijd stabiliseert CSQ2 het CICR-mechanisme door het functionele opladen van SR Ca-winkels te vertragen. Abnormaal repriming gedrag van Ca-release kanalen kan verantwoordelijk zijn voor, of bijdragen aan, ventriculaire aritmieën geassocieerd met mutaties in het CSQ2 gen.