wanneer het gaat om het oplossen en denatureren van eiwitten voorafgaand aan iso-elektrische focussering en 2-D gelelektroforese, kiezen de meeste onderzoekers voor ureum. Dit is niet verwonderlijk aangezien deze milde chaotropic agent De interactie tussen eiwitmoleculen volledig kan verstoren en de efficiency van protease activiteit in eiwit spijsvertering kan verhogen terwijl effectief proteã nen van het aggregeren en/of neerslaan verhinderen. Bovendien wordt ureum ook gebruikt voor het renatureren van eiwitten uit eerder gedenatureerde monsters.

ondanks zijn populariteit als effectief eiwitdenatureringsmiddel, brengt het gebruik van ureumoplossing bij het verteren van eiwitten een bijzondere uitdaging met zich mee – het verhoogt het risico op carbamylering. Waarom zou dit jou zorgen baren? Hier zijn enkele redenen waarom carbamylation schadelijk kan zijn voor uw experiment en waarom het zou moeten worden vermeden ten koste van alles.

1. afgezien van het blokkeren van de N-terminale uiteinden van eiwitmoleculen, interfereert carbamylering met de eiwitkarakterisering en maakt ze niet beschikbaar voor verder gebruik.
2. het tast agressief de zijketens van arginine-en lysineresiduen aan en maakt het eiwit ongeschikt voor enzymatische verteerbaarheid.
3. het belemmert de enzymatische vertering van eiwitten en beïnvloedt de identificatie en kwantificering van eiwitten in MS-analyse negatief.
4. het verwart de resultaten van peptiden met onverwachte retentietijden en verhoogt de complexiteit van het monster.
5. het vermindert de ionisatie-efficiëntie en heeft een negatieve invloed op de signaalintensiteit van gedetecteerde pieken.
6. het induceert een verandering in het iso-elektrische punt van eiwitten en leidt tot artifactuele resultaten.
7. Het kan de resultaten van in vivo carbamyleringsonderzoeken beïnvloeden.

Wat veroorzaakt Carbamylering?

per definitie verwijst carbamylatie naar de post-translationele modificatie die de structurele en functionele eigenschappen van eiwitten verandert. Dit wordt veroorzaakt door de niet-enzymatische reactie tussen isocyaanzuur en de vrije aminogroepen.

in waterige oplossingen bestaat ureum in evenwicht met ammoniumcyanaat. Het is belangrijk op te merken dat (1) ureum in oplossing spontaan cyanaat-en ammoniumionen produceert, (2) het afbreekt tot isocyaanzuur (CNOH), de vorm die actief reageert met eiwitaminogroepen en carbamylering induceert, en (3) De snelheid waarmee ureum dissocieert en de mate van carbamylering afhankelijk is van de temperatuur, pH en incubatietijd.

preventie van Carbamylering: enkele nuttige Tips om te overwegen

niets kan veranderen aan het feit dat ureum in aanwezigheid van warmte en eiwitten altijd tot carbamylering zal leiden. U kunt gebruik maken van de hoogste kwaliteit ureum beschikbaar en nog steeds het risico van carbamylatie lopen.

gelukkig zijn er verschillende manieren om peptiden tegen carbamylering te beschermen. Hier zijn een aantal effectieve strategieën die kunnen worden gebruikt om dit doel te bereiken.

• Gebruik altijd vers bereide reagentia op ureumbasis bij het uitvoeren van proteomische procedures. Gebruik hoogwaardige voorgemengde en gebruiksklare buffers op basis van droog ureum uit geloofwaardige bronnen en wees uiterst voorzichtig bij het bereiden van uw monsters. Opmerking: bewaar vast materiaal bij kamertemperatuur en houd de hantering tot een minimum.
• verwijder ureum uit het eiwitmonster vóór de spijsvertering door middel van dialyse en/of snelle reversed phase chromatografie of met behulp van spin kolommen.
• houd het monster op een relatief lage temperatuur om de snelheid waarmee ureum ontleedt te verlagen. Vermijd verhitting van ureumhoudende buffers boven 37oC om het risico op carbamylering te verminderen.
• Deïoniseer de ureumoplossing met behulp van een ionenwisselingshars om de cyanaatconcentratie te verminderen.
• zuur ureumoplossing (100 mm HCl) aan om de vorming van isocyaanzuur te belemmeren.
• gebruik reagentia zoals ethanolamine, ethyleendiamine, methylamine en Tris-HCl om proteïne/peptide carbamylering te minimaliseren. Deze reagentia helpen door cyanaatmoleculen op te ruimen waardoor ze niet beschikbaar zijn voor peptiden.

toegegeven, deze strategieën hebben hun eigen nadelen (d.w.z., vereisen langere verwerkingstijd, precipitatie van gemakkelijk gedenatureerde eiwitten induceren, en kan ongeschikt zijn voor tal van enzymatische spijsvertering technieken) maar aangezien enzym verteert worden uitgevoerd bij verhoogde temperaturen over een lange periode van tijd, heb je geen andere keuze dan ureum te verwijderen uit de verteersel mengsel. Anders loop je altijd het risico van carbamylatie. Het is een risico dat je niet zou willen nemen.