het myeloïdcompartiment van het aangeboren immuunsysteem bestaat uit een aantal celtypen waarvan de functies de klaring van beschadigde en apoptotische cellen, de presentatie van antigeen, immunosuppressie en de bescherming van de gastheer tegen vreemde micro-organismen omvatten.

monocyten vertegenwoordigen een sterk plastic subgroep van cellen waaruit het aangeboren immuunsysteem bestaat. Deze cellen kunnen de vasculatuur doorkruisen en, wanneer blootgesteld aan specifieke cytokines, differentiatie in verschillende celtypes ondergaan. Circulerende monocyten worden geclassificeerd als of niet-klassiek of klassiek en kunnen door hun patroon van cel-oppervlakte receptoruitdrukking worden onderscheiden. De klassieke monocyten in de circulatie tonen CD14+++Hi/CD16−/lo en zijn vooral aanwezig op plaatsen van infectie of ziekte (1,2).

Humane niet-klassieke monocyten binnen de circulatie display CD16+++Hi/CD14+/lo oppervlakte-expressie (1). Na activering, ondergaan monocyten verscheidene morfologische en biochemische functionele veranderingen, resulterend in monocytedifferentiatie in nieuwe celtypes zoals macrofagen (3).

in een paradigma dat klassieke activering wordt genoemd, vertonen humane monocyten fenotypische plasticiteit die kan worden geïnitieerd door blootstelling aan th1—responsbevorderend cytokine interferon-γ (IFN-γ) Of tumornecrosefactor α (TNF-α), evenals het endotoxine lipopolysaccharide (lps) (4,5). Dit mechanisme van klassieke activering genereert M1 macrofagen, die functioneren om pro-inflammatoire mediatoren te produceren die gastheerbescherming tegen bacteriën en virussen bieden (6). Menselijke monocyten kunnen ook aan m2 macrofagen door blootstelling aan th2—reactie-bevorderende cytokines zoals interleukine-10 (IL-10) en het transformeren van de groeifactor-β (TGF-β) (4,7) worden onderscheiden. M2 macrophages drukken hoge niveaus van CD206 (mannose receptor) en CD163 uit, veroorzaken lage niveaus van pro-inflammatoire cytokines, en bevorderen het gekronkelde helen en matrixremodellering.

dendritische cellen (DCs) zijn een andere reeks van monocyt-afgeleide immuuncellen waarvan de functie is om antigenen aan T-cellen te presenteren om een adaptieve T-cel-gebaseerde immuunrespons te initiëren. DCs kan grotendeels worden onderverdeeld in drie subgroepen: klassiek (cDCs), plasmacytoid (PDC ‘ s), en monocyt-afgeleide (moDCs). cDCs worden typisch gevonden in het lymfoïde weefsel, milt, lymfeklieren, en beendermerg. PDC ‘ s lijken op plasmacellen en worden meestal aangetroffen in de bloedcirculatie (8). De monocyten kunnen in DCs worden onderscheiden, die vaak monocyte-afgeleide DCs (moDCs) worden genoemd, na blootstelling aan de stimulatiefactor van de granulocyte macrofaagkolonie (GM-CSF) en IL-4 (9,10). er is gemeld dat modc ‘ s in vitro (11-13) cel-oppervlakte markers CD80, CD83, CD86 en CD1a tot expressie brengen. Terwijl moDCs van macrophages in celvorm en functie verschillen, delen zij uitdrukking van verscheidene cel-oppervlakteantigenen, met inbegrip van CD11c, CD206, en CD1a (14).

verschillende groepen hebben succesvolle differentiatie van menselijke CD14+ monocyten in macrofagen gemeld; veel van deze gepubliceerde protocollen zijn echter verschillend. Een veel voorkomende variatie tussen deze methoden is het opnemen (15) of weglaten (16) van IL-6. Een ander verschil tussen protocollen is de behandelingstijd. Dit gebrek aan consistentie tussen protocollen is problematisch.

om deze problemen aan te pakken, hebben we de opname en weglating van IL-6 onderzocht en vergeleken in de cytokinebehandeling die wordt gebruikt in gangbare humane monocyt-differentiatiemethodologieën. We vonden dat in de afwezigheid van IL-6, deze strategieën cellen produceren met een lage mate van homogeniteit, die dubbelzinnige experimentele resultaten kunnen opleveren. Ten tweede, om dit probleem verder aan te pakken, ontwikkelden we een nieuwe gefaseerde in vitro strategie met de opname van IL-6. We vonden dat deze strategie sterk verbeterde de cellulaire homogeniteit van M1 en M2 macrofagen evenals moDCs die werden onderscheiden van menselijke CD14 + monocyten. Deze verbetering van de methodologie zal onderzoekers voorzien van betere modellen voor het onderzoeken van het immuunsysteem en de ziektestaten.

materialen en methoden

Celpreparaten

Buffy coats werden verzameld uit het volbloed van vijf of meer gezonde mannelijke donoren die waren samengevoegd. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC ‘ s) werden bereid uit buffy coats door ficoll-Paque (1,077 g/mL dichtheid) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) dichtheid gradiënt centrifugeren bij 400 × g bij 18°C gedurende 35 minuten om bloedbestanddelen te scheiden. Cellen werden meerdere malen gewassen met behulp van 1× PBS en geteld met behulp van een Nexcelom Cellometer Auto T4 plus cel teller (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Eenmaal geteld, werden CD14 + monocyten geà soleerd uit PBMC ‘ s door magnetische etikettering met behulp van MAb CD14 geconjugeerde microbeads (130-050-201; Miltenyl Biotec, San Diego, CA) gevolgd door scheiding met behulp van magnetische kolommen (130-042-401 en 130-042-302; Miltenyl Biotec) volgens de instructies van de fabrikant, met één uitzondering: bij het verzamelen van CD14+ – cellen uit de magnetische kolom, werden de cellen in eerste instantie gespoeld met behulp van 5 mL buffer alleen afhankelijk van de zwaartekracht (zonder gebruik van de meegeleverde plunjer). Na de eerste spoeling van 5 mL werd een extra buffer van 5 mL toegevoegd en voorzichtig doorgespoeld met behulp van de bijgeleverde zuiger.

celcultuur

Humane CD14+–monocyten werden gezaaid met een celdichtheid van 2,0-3.0 × 105 cellen / mL in rpmi 1640 medium met 2 mM/L L-glutamine (Life Technologies, Frederick, MD) aangevuld met 10% warmte geïnactiveerde FBS (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/mL penicilline (Life Technologies) en 100 mg/mL streptomycine (Life Technologies) bij 37°C in een bevochtigde 5% CO2-incubator. Om cellen in M1-macrofagen te onderscheiden, werden GM-CSF (20 ng/mL) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-γ (20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL) en endotoxine LPS (20 ng/mL) gebruikt. Voor M2-macrofaagdifferentiatie waren de gebruikte cytokines macrofaagkoloniestimulerende factor (m-CSF), IL-4, IL-6 en IL-13 in een concentratie van 20 ng/mL (PeproTech). modc ‘ s werden gegenereerd door toevoeging van GM-CSF (100 ng/mL) en IL-4 (20 ng/mL). De timing van elke strategie wordt verder beschreven in Figuur 1.

flowcytometrie

Gepolariseerde macrofagen en DCs werden gedurende 9 dagen gekweekt op 10 cm2-schotels (BD Falcon, Billerica, MA). Op Dag 9, media en niet-adherente cellen werden verzameld; adherente cellen werden gewassen met behulp van 1× PBS, verwijderd met behulp van cel dissociatie buffer (het leven technologieën), en vervolgens toegevoegd aan de verzamelde media/niet-adherente cellen worden gewassen. Geschorst werden de cellen gewassen en gecentrifugeerd twee keer (1 x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA), geteld en vervolgens geïncubeerd met een fluorofoor-geconjugeerd primaire antilichamen tegen CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), E-cadherin (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE), en CD64 (FITC) in het donker voor 45 min bij 4°C. de Fluorescentie werd ontdekt door een S3TM Cell Sorter (Bio-Rad, Hercules, CA).

endocytose assay

Gepolariseerde menselijke macrofagen werden met een dichtheid van 3 geplateerd in glazen dia ‘ s met 4-Wells kamers (MA nunc Lab-tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA).0 × 105 cel / mL op dag 7 en verder gekweekt met de juiste cytokines gedurende de resterende 2 dagen. Peryleen bisimide (PBI-12-Man) (17) was een vriendelijk geschenk van Ke-Rang Wang aan de Hebei Universiteit. Cellen werden gekweekt met 10 µg / mL PBI-12-Man gedurende 30 min bij 37°C, daarna gewassen met 1× PBS. De cellen werden bevestigd gebruikend 70% ethanol en opgezet met DAPI (P36962; het Levenstechnologieën). Om endocytose van de mens PBI-12 te visualiseren, werden de dia ‘ s opgewekt en bij 585 nm uitgezonden. Rode fluorescentiebeelden werden gekwantificeerd met behulp van Metafer slide scanning software (Metasystems, Boston, MA). Statistische tests werden uitgevoerd met behulp van MATLAB R2015a software (The Mathworks, Inc., Natick, MA). Rank-sum tests werden uitgevoerd om te testen op univariate statistische significantie tussen de monsters.

immunofluorescentie

macrofagen werden gedurende 7 dagen gedifferentieerd aan de hand van eerder beschreven methoden en vervolgens overgebracht naar nunc Lab-tek II 4-Wells glazen kamerglaasjes met de juiste cytokines. De cellen bleven de volgende 7 dagen groeien; 14 dagen na de eerste plating werden cellen gefixeerd met 70% ethanol en gemonteerd met Prolong Diamond anti-fade mountant met DAPI. De cellen werden gevisualiseerd gebruikend fasecontrast en de fluorescentiemicroscopie op de auto van EVOS FL (het Levenstechnologieën).

resultaten en discussie

strategieën en voorwaarden voor menselijke CD14+ monocytendifferentiatie

we begonnen met het beoordelen welke strategieën het meest effectief waren bij het produceren van homogene populaties van menselijke M1-en M2-macrofagen en modc ‘ s. Menselijke CD14 + – monocyten werden geïsoleerd en op weefselcultuurplaten gezaaid om in vitro te worden gedifferentieerd in macrofagen of modc ‘ s. Vervolgens testten we drie specifieke behandelingsvoorwaarden om de methode te bepalen die de meest uniforme macrofaag-en moDC-populaties opleverde. Voor de eerste voorwaarde hebben we cellen gekweekt met de toevoeging van alleen GM-CSF of M-CSF gedurende 9 dagen (figuur 1). Deze voorwaarde wordt “alleen” genoemd (figuur 1). De tweede behandelingsstrategie was om cellen continu bloot te stellen aan het toepasselijke cytokinemilieu op Dag 0, de media, cytokines en LP ‘ s op Dag 5 aan te vullen en de cellen op Dag 9 te analyseren. Deze voorwaarde wordt “continu” genoemd (figuur 1). De derde strategie was het stimuleren van CD14 + – monocyten met GM-CSF of M-CSF gedurende 5 dagen, gevolgd door de toevoeging van verse media die LPS bevatten voor humane M1-macrofagen en alle toepasselijke cytokines voor een bepaalde behandelingsgroep (GM-CSF, IFN-γ, en IL-6 voor M1-macrofagen of M-CSF, IL-4, IL-13 en IL-6 voor M2-macrofagen). Deze behandelingsstrategie werd “gefaseerd” genoemd (figuur 1). Het behandelen van CD14 + – monocyten met 100 ng/mL GM-CSF en IL-4 gedurende 5 dagen en het vervangen van media en alle cytokines op dag 5 gegenereerde modc ‘ s. De modc ‘ s werden vervolgens gedurende 24 uur gestimuleerd met IL-6 en LPS voor analyse (dag 8) om DC-rijping en activering te bevorderen. Deze kweekmethode werd “gestimuleerd” genoemd (figuur 1). De modc ‘ s die nooit IL-6-en LPS-blootstelling kregen, werden “niet-gestimuleerd” genoemd (figuur 1). Na 9 dagen kweek onder de hierboven beschreven specifieke omstandigheden, werden de cel-oppervlakte receptorexpressie en de celfunctionaliteit geanalyseerd.

IL-6 blootstelling verhoogt de efficiëntie van de M2-polarisatie in vitro

eerdere studies hebben aangetoond dat blootstelling aan cytokine IL-6 niet alleen de differentiatie van monocyten van een dendritische cel naar een fenotype van de macrofaag vertraagt, maar dat blootstelling aan IL-6 ook het mRNA-expressieprofiel van M2-macrofagen verhoogt (15,18). Om deze bevindingen te bevestigen en het effect van IL-6 op de polarisatie van M1 en M2 te testen, werden menselijke CD14+-monocyten onder de continue en gefaseerde kweekomstandigheden met of zonder IL-6 behandeld. Onderzoek van M2 macrofaag oppervlakte marker expressie in M1 gedifferentieerde cellen toonde geen significante veranderingen wanneer gekweekt met IL-6 (figuur 2), wat erop wijst dat IL-6 behandeling niet leidt tot shunt M1 Gepolariseerde macrofagen naar een M2 fenotype.

omgekeerd bleek uit analyse van de continue en gefaseerde M2-macrofaagcultuurgroepen dat behandeling met IL-6 de expressie van M2-macrofaagoppervlaktemarkers verhoogde. In M2 macrofaagpopulaties bleef de expressie van zowel CD206 als CD36 hoog en leek deze onveranderd bij blootstelling aan IL-6 (figuur 2, A en B). CD163 en E-cadherin vertoonden echter een significante toename van de oppervlakte-expressieniveaus en populatiehomogeniteit bij behandeling met IL-6 (figuur 2, C en D). Dit wordt aangetoond door een afname van de CD163-en e-cadherinepieken met lage expressie (rode pijlen in Figuur 2, C en D) en de resulterende verschuiving naar een homogene populatie met hoge expressie.

IL-6 wordt vaak gebruikt om moDC-rijping te induceren (18,19). Om te bepalen of IL-6 behandeling kon resulteren in ongewenste modc ‘ s binnen de macrofaag-Gepolariseerde populaties, werd mature DC surface marker (CD83) expressie onderzocht. Flow cytometrische analyse toonde aan dat geen van de M1-of M2-kweekomstandigheden een significante toename van CD83-expressie bevorderde (figuur 2E). Dit suggereert dat er geen modc-besmetting binnen deze macrofaagpopulaties was of dat om het even welke besmettende modc ‘ s il-6 ongevoelig waren.

gefaseerde polarisatie leidt tot verhoogde expressie van canonieke M1 -, M2-en moDC-celoppervlaktemarkers

om te bevestigen dat menselijke CD14+-monocyten op Dag 9 volledig waren gedifferentieerd in macrofagen of modc ‘ s, werd flow cytometrie gebruikt om celoppervlaktemarkers te analyseren en morfologische verschillen te beoordelen (Figuur 3, A-C). Menselijke CD14 + monocyten werden gedifferentieerd (figuur 1) om te beoordelen welke strategie hoge expressie van celtype geschikte oppervlaktetellers zou opleveren. Een paneel van cel-oppervlakte tellers werd getest voor elk van de celtypes. Ons M1 cel-oppervlak marker Paneel bestond uit de canonieke markers CD86, en CD80 (Figuur 3, A-C). Voor het M2 macrofaagpaneel gebruikten we CD206, CD163, CD124 (IL-4 receptor-α), E-cadherin en CD36 (klasse B scavenger receptor) (Figuur 3, A-C). Voor moDCs werden CD83, CD86 en CD1a gebruikt. Voor alle geteste markers werden de oppervlakexpressieniveaus voor alle celtypen bepaald (aanvullend figuur S1). De mediane fluorescentieintensiteit (MFI) werd berekend en weergegeven als vouwverandering ten opzichte van de overeenkomstige niet-beklede controle (zie tabellen in Figuur 3).

interessant is dat analyse van de M2-celoppervlaktemarkers, CD36 en IL-4Ra, in de M1 GM-CSF-only Gepolariseerde macrofagen een dramatische toename aan het licht bracht (figuur 3A). Bij vergelijking van met GM-CSF behandelde cellen met alle M1-behandelingsgroepen had de GM-CSF-only-groep een aanzienlijk hogere CD36-expressie. Deze GM-CSF-only cellen vertoonden ook lage concentraties van de M1-geassocieerde markers CD86 en CD80. Op dezelfde manier leverde de continue conditie cellen op die niet alleen laag waren in CD86 en CD80, maar ook hoog waren in CD36 en IL-4RA expressie. Omgekeerd, wanneer menselijke CD14 + monocyten werden onderscheiden onder de M1 gefaseerde voorwaarde, werden CD86 en CD80 merkbaar up-gereguleerd, terwijl CD36 en IL-4Ra expressie laag bleven. Verdere flowcytometrische analyse van de cel-oppervlakte markerexpressie toonde aan dat M1-macrofagen een lagere expressie hadden van CD206, CD36 en CD163 ten opzichte van M2-macrofagen onder zowel gefaseerde als continue blootstelling (aanvullende figuren S1 en S4). Bovendien genereren deze gevarieerde kweekvoorwaarden cellen met verschillende morfologische kenmerken en structuur (figuur 3A). Terwijl de GM-CSF-slechts behandelde cellen groter lijken te zijn, toonden de voorwaartse verspreiders (FSC) gegevens minimale verschillen in grootte tussen de groepen (aanvullende cijfers S2 en S3). Het vergelijken van de interne complexiteit (SSC) tussen de behandelingsvoorwaarden heeft een toename van de granulariteit in de GM-CSF en gefaseerde groepen aan het licht gebracht (aanvullend figuur S2). Samen tonen deze resultaten aan dat alleen GM-CSF en continue behandeling cellen opleveren die lage M1-markers en hoge niveaus van bepaalde M2-markers uitdrukken, evenals morfologische veranderingen vertonen.

M2 kweekomstandigheden voor macrofaag leverden iets dubbelzinniger resultaten op dan die voor de M1 kweekomstandigheden voor macrofaag (figuur 3B). Ten opzichte van de alleen m-CSF-groep vertoonden de gefaseerde en continue groepen verhoogde expressieniveaus van CD206. Omgekeerd waren de IL-4Ra oppervlakteniveaus in m-CSF-alleen-omstandigheden aanzienlijk hoger, in vergelijking met zowel continue als gefaseerde omstandigheden. E-cadherin expressie bleef uniform over de groepen, terwijl CD163 significant hoger was in zowel de M-CSF-only als de gefaseerde groepen. Een opmerking is dat de continue blootstellingsgroep consequent veel minder homogeen was wat betreft de cel-oppervlakte markerexpressie. Dit wordt geïllustreerd door de bimodale verdeling en grote variantie in expressieniveaus die op het histogram worden gevonden. Bovendien kunnen dramatische morfologische verschillen worden gezien tussen de behandelingsgroepen. Op basis van de fasecontrastbeelden produceerde de M-CSF-only groep cellen die kleiner en zeer korrelig lijken te zijn (figuur 3B). De cytometrische analyse van de stroom toont aan dat deze cellen gelijkaardige grootte (FSC) hebben, nochtans, is er een verhoging van cellulaire granulariteit in de gefaseerde en ononderbroken behandelingsvoorwaarden (aanvullend cijfer S2). Ten slotte veranderde glutamine-deprivatie de M2-polarisatie, wat aantoont dat metabole producten noodzakelijk zijn in het kader van deze strategie (aanvullende figuur S5). Al met al suggereren deze gegevens dat de gefaseerde omstandigheden de grootste efficiëntie opleveren voor M2 macrofaag polarisatie.

we onderzochten vervolgens oppervlaktemarkerexpressie van modc ‘ s die niet werden gestimuleerd of gestimuleerd met IL-6 en lps 24 h voorafgaand aan flow cytometrische analyse. Stimulatie met IL-6 en LPS resulteerde in een toename van CD80 -, CD83-en CD86-expressie (figuur 3C). Volwassen DC marker CD83 cel-oppervlak expressie dramatisch verhoogd bij activering met behulp van IL-6 en LPS op Dag 8 ten opzichte van de niet-gestimuleerde groep. Dit bevestigde dat IL-6 en LPS de rijping van dendritische cellen konden bevorderen (aanvullend figuur S1L). CD1a expressie bleef uniform tussen de niet-gestimuleerde en gestimuleerde groepen. Interessant is dat de gestimuleerde DCs in suspensie bleven, maar ze leken wel samen te komen en zich aan elkaar te hechten (figuur 3C). Deze resultaten bevestigen vorige bevindingen betreffende moDC polarisatie en verstrekken een extra controle voor oppervlakte teller analyse om ongewenste modc populaties binnen de diverse macrophage culturing voorwaarden te identificeren.

M2 macrofagen gegenereerd door gefaseerde cytokineblootstelling bezitten M2-geassocieerde functionaliteit

De mannose-receptor (CD206) is een endocytische en recyclingreceptor die in onze M2-macrofaagpopulaties onder gefaseerde behandelingsomstandigheden sterk tot expressie komt. Vervolgens wilden we de cd206-gemedieerde endocytische opname in onze macrofagen beoordelen. Dit werd bepaald met behulp van PBI-12-Man, een biocompatibel middel dat fluoresceert bij binding aan de mannose-receptor (17). Na een 1 uur durende behandeling van zowel M1 als M2 macrofagen met PBI-12-Man was de rode fluorescentie van PBI-12-Man voornamelijk intracellulair in M2 macrofagen onder gefaseerde en continue behandelingsomstandigheden (Figuur 4, A en B). Dit vinden stelt voor dat de cel-oppervlakte die aan CD206 en endocytose bindt in vesiculaire localisatie resulteert. Dit stemt met de vorige gegevens van cytometry stroom overeen, die aantoonden dat onder gefaseerde behandelingsvoorwaarden, de macrofagen van M2 een hogere cel-oppervlakte uitdrukking van CD206 ten opzichte van de macrofaagpopulatie van M1 vertoonden. Interessant, vonden we dat GM-CSF-alleen cellen vertoonden hoge niveaus van PBI-12-Man endocytose (Figuur 4, A en B). Dit correleert met onze flow cytometrische gegevens (Figuur 2), die aantoonden dat GM-CSF-alleen kweekvoorwaarden M1 cellen produceren met M2-geassocieerde oppervlakte marker expressie. Al met al tonen we aan dat deze cellen de normale eigenschappen van macrofagen hadden en dat CD206 functioneel was in de M2 macrofaagpopulatie.

na 14 dagen kweek vertoonden M2 macrofagen ook de mogelijkheid om te fuseren, met een grootte van meer dan 200 µm en met meerdere kernen per cel (figuur 4C). Deze leken op multi-nucleated giant cells (Mngc ‘ s) die zijn gemeld om fagocytic en andere capaciteiten te bezitten (20). Daarnaast zijn MNGCs geassocieerd met vreemd materiaal in het lichaam, tuberculose en kanker (20-23). Deze cellulaire fusie werd uitsluitend gevonden in onze M2 macrofaag populaties en was veel belangrijker in de M2 gefaseerde conditie. Hoewel de M-CSF-only groepen enkele meerkernige cellen hadden (figuur 4C), waren hun grootte en aantallen veel lager dan de gefaseerde groep. Gezien de capaciteit van deze cellen om deze macrophage geassocieerde functie uit te voeren, wijzen deze resultaten verder erop dat de gefaseerde het kweken voorwaarden hoogst M2-als macrophages produceert.

hier beschreven we ons nieuw ontwikkelde phased protocol voor macrofaag polarisatie. We vonden dat het opnemen van IL-6 en gefaseerde polarisatiebehandelingstiming absoluut cruciaal zijn voor het genereren van de meest M1 – en M2-achtige macrofagen in vitro. Deze bevinding werd grondig getest in vergelijking met andere polarisatiemethoden. Daarom zijn wij van mening dat de gefaseerde polarisatiemethode een aanzienlijke stap voorwaarts betekent. Dit zal onderzoekers uniforme experimentele normen te produceren homogene populaties van macrofagen te gebruiken in vitro en de mogelijkheid om hun resultaten te vergelijken. Hoewel dit protocol een aantal verbeteringen biedt ten opzichte van de huidige polarisatiestrategieën, zijn wij van mening dat aanvullend onderzoek en optimalisatie van de belichtingstijden en de cytokinecocktail nuttig zou zijn. Dit zal ons helpen om de complexe rollen van M1 en M2 macrofagen in verschillende vormen van ziekteprogressie verder te begrijpen en de ontwikkeling van nieuwe therapeutica te bevorderen.