Resultater
Modulering Av Cellulære P107 Nivåer Gjennom Kontrollert Proteolyse. Vi har tidligere vist at den endogene p107, et medlem av rb-familien av proteiner, som ikke er et naturlig substrat For Scfßrcp, kan elimineres i c33a cervikale karsinomceller ved ektopisk ekspresjon av en kimær ß ubiquitin-proteinligase (ß-E7N) som bærer et p107-bindende peptid avledet fra de N-terminale 35-aa-rester AV HPV-onkoproteinet, E7 (E7N) (1). Imidlertid dikteres funksjonene til mange cellulære proteiner av deres intracellulære overflod, og ikke bare ved deres tilstedeværelse eller fravær. Hittil har det ikke vært en pålitelig metode for nøyaktig modulering av intracellulære proteinnivåer i pattedyrceller.
Vi undersøkte først om p107-nivåene kunne reduseres systematisk ved kontrollert ekspresjon av forskjellige mengder av ß-E7N. humane c33a cervikale karsinomceller ble infisert med økende doser av rekombinant adenovirus som bærer ß-E7N eller kontrolladenovirus i 24 timer. Infeksjonen var 100%, selv ved den laveste dosen som ble brukt, som bedømt ved ekspresjon AV GFP båret av adenovirus i alle mottakercellene (data ikke vist). Som vist I Fig. 1 (Øvre) ble de endogene p107-nivåene systematisk redusert til 78%, 25% og 5% av steady-state-nivåene når C33A-celler ble transdusert med rekombinant ßcp-E7N adenovirus ved mois på 10, 35 og 80, men ikke de samme dosene Av Ad1 kontrollvirus. Derfor tilbyr den konstruerte SCFßTrCP – BP et enkelt og reproduserbart middel for å redusere de totale mengdene målproteiner på definerte nivåer for å analysere doseringseffekter på biologiske aktiviteter.
Systematisk reduksjon av endogen p107 Med F-TrCP-E7N. c33a-celler ble infisert med økende doser rekombinant ad-F-TrCP-E7N adenovirus i 48 timer. Nivåene av endogen p107, cyklin A, Cdk2 og β-actin (lastekontroll) ble påvist ved immunoblotting med de respektive antistoffene, og i sammenligning med den doseavhengige økningen I ekspresjonen Av F-TrCP-E7N.prosentandelen av p107 som ble igjen i hver adenovirusinfisert celle ble kvantitert ved densitometri-skanning og er indikert.
P107 forbinder stabilt med cyclin A og Cdk2 gjennom et bindingssted med høy affinitet i prolifererende celler (13-15). For å undersøke om disse p107-assosierte proteinene også blir utsatt for målrettet degradering av ßcp-E7N, ble immunoblotting utført I C33A-celler infisert av Ad-F-TrCP-E7N-viruset. Som vist I Fig. 1, de endogene cyklin A og Cdk2 nivåene forble uendret, mens p107 var dramatisk nedregulert. Videre ble nivåene Av ikke-målrettet β-actin ikke påvirket Av F-TrCP-E7N(Fig . 1). Dette resultatet ga sterke bevis for at den konstruerte ß-e7n ubiquitin-proteinligase spesifikt nedbryter målrettet substrat p107, men ikke dets tilknyttede proteiner.
Selektiv Nedbrytning Av En Spesifikk Posttranslationally Modifisert Subpopulation Av Målet Protein. Modifikasjon av et cellulært protein på posttranslasjonsnivå, som fosforylering, er et grunnleggende middel celler bruker til å regulere funksjonen eller å gi nye aktiviteter av proteinet. Eksperimentelle verktøy for å dissekere funksjonen knyttet til en bestemt posttranslasjonell modifikasjonshendelse er for tiden begrenset. Fordi protein knockout opererer på posttranslasjonalt nivå som direkte gjenkjenner målproteiner, er en applikasjon å konstruere en bestemt E3 som er i stand til å velge en subpopulasjon av posttranslationally modifiserte proteiner for nedbrytning, i stedet for å ødelegge hele befolkningen.
HPV16 E7 ble funnet å selektivt binde seg til hypofosforylert form AV RB (16). Vi undersøkte om den kimære ④cp-E7N ubiquitin-proteinligase kunne skille hypo – og hyperfosforylert RB og bare velge hypoform for degradering. De humane u2os osteosarkomceller uttrykker begge former FOR RB som lett kan identifiseres, basert på deres forskjellige elektroforetiske mobilitet PÅ SDS / SIDE(Fig. 2a, lane 1) (17). Identiteten til disse to RB-artene ble ytterligere bekreftet ved immunoblotting ved bruk av antistoffer som er spesifikke for enten hypo – eller hyperfosforylerte former FOR RB (Fig. 2a, baner 2 og 3). U2os-celler ble infisert med rekombinant Ad-F-TrCP-E7N eller kontroll Ad1 adenovirus for 48 h, og steady-state nivåer AV RB-P OG RB ble analysert samtidig Ved Western blotting, ved hjelp av et anti-rb monoklonalt antistoff som gjenkjenner begge former. I samsvar MED preferansebindingen AV E7N til hypofosforylert RB, resulterte ektopisk ekspresjon Av F-TrCP-E7N i eliminering av hypofosforylert RB, mens den hyperfosforylerte RB-P ble intakt (Fig. 2b Øvre, sammenlign baner 4-6 med baner 1-3). Dette resultatet fremhever evnen til den konstruerte f-TrCP-E7N ubiquitin-proteinligase ved valg av en spesifikk subpopulasjon AV RB for nedbrytning, som var basert på statusen for visse posttranslasjonelle modifikasjoner av målproteinet.
Selektiv nedbrytning av hypofosforylert form AV RB I u2os-celler. (A) u2os-celler inneholder både hypofosforylerte og hyperfosforylerte former FOR RB. Immunoblotting ble utført for å oppdage RB I U2OS – celleekstrakter ved å bruke antistoffer som gjenkjenner BÅDE RB-former (lane 1) (IF8, Santa Cruz Bioteknologi), eller spesifikk for hypo – (lane 2) (G99–549, BD Biosciences) eller hyperfosforylert RB (lane 3). (B) u2os-celler ble infisert med økende doser (i µ) Av ad1-F-TrCP-E7N eller control pAd1-adenovirus i 48 timer.Celleekstrakter ble fremstilt og immunoblottet med antistoffer mot RB, p107, FLAG (M2), p21waf1, p27kip1 og β-actin.Full lengde HPV16 E7 kunne interagere med de syklinavhengige kinasehemmerne p21Waf1 og p27Kip1, men bindingsdomenet ble kartlagt Til C-terminaldomenet (rester 40-98), i stedet FOR e7n-fragmentet (rester 18-20). For ytterligere å undersøke spesifisiteten Av F-TrCP-E7N ble DE samme u2os-celleekstrakter også undersøkt med antistoffer mot p21Waf1 og p27Kip1. Som vist I Fig. 2b (Midten), forble steady-state nivåene av p21Waf1 og p27Kip1 uendret. Samlet sett viste den konstruerte F-TrCP-E7N proteolytisk spesifisitet mot rb-familiens proteiner, men ikke andre cellesyklusregulatorer som Cdk2, cyclin A, p21Waf1 og p27Kip1.
Strukturbasert Mutagenese For Å Generere En Svært Spesifikk ④cp-E7N Ubiquitin-Proteinligase. Den kimære ④cp-E7N er fortsatt i stand til å binde de endogene ④cp-substratene, inkludert IkB, β-catenin og ATF4 (3-7). Overekspresjon av ④cp-E7N kan forstyrre nedbrytning av disse opprinnelige substratene. Omvendt kan binding av det endogene substratet til ß-E7N forstyrre riktig posisjonering av det tilsiktede substratet for å akseptere ubiquitin fra ubiquitin-konjugerende enzym, og dermed redusere effektiviteten av målrettet nedbrytning (Fig. 3AUpper). Videre interagerer ④cp med et pseudo-substrat hnRNP-U, som binder ß og dets derivater i kjernen og utelukker deres interaksjon med substratene (21). Ved å introdusere spesifikke mutasjoner av aminosyrerester på ß for å eliminere bindingen til β-catenin, IkB eller Hnrnp-U, forventer vi å forbedre ikke bare spesifisiteten, men også tilgjengeligheten til den konstruerte ß-E7N for å rekruttere det tilsiktede substratet (Fig. 3lavere).
Strukturbasert mutagenese av substratbindende rester på engineered ④cp-E7N ubiquitin-protein ligase. (A) Skjematiske diagrammer av det forventede SCFßTrCP-BP/IkB/mål og SCFßTrCP (m1)-BP/målkomplekser. BP, bindende peptid; T, mål. (B) Tredimensjonal modell AV WD40-gjentakelser av ß. De fem positivt ladede rester er cyan. (C) den modifiserte F-TrCP (m1)-E7N ubiquitin–proteinligase kan ikke binde Seg Til IkB, men beholder sin interaksjon med p107. HeLa-celler ble transfektert forbigående Med IkB, sammen med pcDNA3 (lane 1), f-TrCP (lane 2), F-TrCP-e7n (lane 3) og F-TrCP(m1)-E7N (lane 4), og behandlet MED mg132 for2hand deretter MED TNF-α i 15 min. Celleekstrakter ble forberedt for immunopresipitasjon med Anti-FLAG (M2) antistoff, og undersøkt med enten fosforylert IkB antistoff eller anti-p107 polyclonal antistoff. F-TrCP (m1) – E7N migrerer som en dublett på SDS geler av grunner som ennå ikke er bestemt (lane 4). (D) Effektiv nedbrytning av p107 Av F-TrCP (m1) – E7N I c33a celler. C33a-celler transfisert med indikerte plasmider og 1 µ pCMV-CD19 ble beriket ved immunomagnetisk seleksjon, og nivåer av endogen p107 ble undersøkt ved immunoblotting. (E) Indirekte immunfluorescensanalyse ble utført for å oppdage endogen p107 (Senter) som respons på forbigående transfeksjon Og ekspresjon Av F-TrCP, F-TrCP-E7N eller F-TrCP (m1)-E7N (Venstre) i individuelle c33a-celler (merket med piler). Bilder av samme felt av celler counterstained med 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ble vist å identifisere kjernene til både transfiserte (merket med piler) og ikke-transfiserte celler.
substratbindingsdomenet til ß inneholder syv wd40-repetisjoner I C-terminalområdet, som brettes inn i den typiske syvbladede β-propellstrukturen som er bevart blant WD40-proteiner (3-7). Fordi den generelle integriteten TIL wd40-proteinenes struktur er kritisk for deres funksjoner, vil standard delesjonsmutagenese-tilnærming trolig indusere brutto strukturelle endringer, og er derfor ikke anvendelig for å definere substratbindingssteder på ß. Den kjente krystallstrukturen TIL wd40-proteiner kan imidlertid utnyttes for å identifisere overflaterester involvert i bindende ß. En strukturbasert mutagenese-tilnærming ble designet for å identifisere og mutere fem positivt ladede rester (R285, K365, R474, R521 og R524), som antas å ligge på TOPPEN av WD40 β-propellen, som er involvert i binding TIL WD40-assosierte proteiner(Fig. 3B) (22). Denne tilnærmingen ble beskrevet I Støtte Metoder, som er publisert som støtte informasjon PÅ PNAS nettsted. Se Også Fig. 6, som er publisert som støtteinformasjon på PNAS nettsted. Videre vil substitusjoner av Disse Lys / Arg-rester ikke sannsynligvis endre den totale ß strukturen.
ved å bruke QuikChange multisite-directed mutagenesis kit (Stratagene), har vi samtidig mutert disse rester Til Glu. DENNE FLAGGMERKEDE sammensatte mutanten, betegnet F-TrCP (m1)-E7N, ble testet for binding til både De endogene (IkB) og de tiltenkte (p107) knockout-målene. HeLa-celler ble transponert med F-TrCP(m1)-E7N eller F-TrCP-E7N, og deres interaksjoner Med IkB og p107 ble bestemt ved coimmunoprecipitation. F-TrCP-E7N og F-TrCP viste lignende slektskap til det fosforylerte IkB-proteinet, mens de sammensatte m1-mutasjonene avskaffet f-TrCP(m1)-E7N-bindingen (Fig. 3c Midten). I kontrast ble lignende nivåer av p107 påvist i immunkompleksene Av F-TrCP-E7N eller F-TrCP (m1)-E7N (Fig. 3c Lavere), noe som indikerer at den konstruerte F-TrCP (m1)-E7N ubiquitin–protein ligase er fullt funksjonell i å rekruttere de tiltenkte cellulære mål. Disse resultatene er i samsvar med strukturelle spådommer I Fig. 3b, og videre definere aminosyrerester på ß kritisk for endogent substratgjenkjenning.den konstruerte F-TrCP (m1) – E7N ble videre analysert for dens styrke i nedverdigende endogen p107. C33a celler ble cotransfected Med F-TrCP, F-TrCP-E7N, Eller F-TrCP (m1)-E7N, sammen MED EN CD19 uttrykk plasmid. Førtiåtte timer etter transfeksjon ble celler høstet og beriket for de som mottok de transfiserte plasmidene ved å bruke de immunomagnetiske perlene konjugert til ANTI-CD19 monoklonale antistoffet. Endogene p107-nivåer ble deretter bestemt ved immunoblotting. Som vist I Fig. 3d, ektopisk ekspresjon Av F-TrCP (m1)-E7N resulterte i en 95% reduksjon av endogene p107 nivåer, mens en 82% nedregulering av p107 ble observert For F-TrCP-E7N (Fig . 3d Øvre, sammenlign baner 4 og 3). Videre hadde ekspresjon Av F-TrCP(m1)-E7N ingen observerbar effekt på tumor nekrosefaktor (TNF)-α indusert degradering Av IkB ved den native Scf@trcp, eller på destruksjon av p27kip1 ved SCFSkp2 ubiquitin–protein ligaser (data ikke vist). Ektopisk ekspresjon av den konstruerte F-TrCP(m1)-E7N forstyrrer derfor ikke DEN totale scf-ubiquitinasjonsaktiviteten ved å knuse KJERNEKOMPONENTENE (Skp1, CUL-1 og Rbx1 / Roc1) som deles av de endogene f-box-proteinene.
målrettet p107 degradering ble videre vurdert i individuelle c33a-celler ved indirekte immunfluorescensanalyse. Konsekvent ble p107 i stor grad utryddet I c33a-celler som uttrykte F-TrCP-E7N eller F-TrCP (m1)-E7N, men Ikke F-TrCP alene (Fig. 3E). Samlet sett indikerer disse resultatene at ved å eliminere bindingsstedene til de endogene hryvcp-substratene, viste den konstruerte f-TrCP(m1)–E7N ubiquitin-proteinligase økt spesifisitet og robust proteolytisk aktivitet mot det tiltenkte målet.
Minimal Bindende Domene Som Målretting Peptid For Effektiv Substrat Rekruttering. For å oppnå høy spesifisitet av substratrekruttering og for å minimere ikke-spesifikk målretting av andre cellulære proteiner, testet vi om det minimale p107 / RB-interaksjonsdomenet TIL E7N (betegnet E7m), som omfatter rester 21-29 Av E7 som spenner OVER LXCXE-motivet (23), kunne oppnå effektiv binding og nedbrytning av p107. En kimær ubiquitin-protein ligase ble konstruert der ß og E7m ble kovalent koblet sammen av en fleksibel 20-aa spacer bestående av 10 kopier Av Gly-Ser repetisjoner (betegnet 10GS). F-TrCP-E7N eller F-TrCP-10gs-E7m ble transponert til c33a-celler, og deres binding til den endogene p107 ble vurdert ved immunopresipitasjon i ekstrakter fremstilt etter behandling med proteasomhemmeren MG132 for å hemme nedbrytning som en konsekvens av denne interaksjonen. Som vist I Fig. 4A (baner 2 og 3), F-TrCP-10gs-E7m hadde noe økt affinitet til p107 enn den opprinnelige F-TrCP-E7N. F-TrCP-E7N Og F-TrCP-10gs-E7m ble ytterligere evaluert for deres effektivitet i p107 nedbrytning ved forbigående transfeksjon I C33A celler Som I Fig. 3D. som vist I Fig. 4B, F-TrCP-E7N og F-TrCP-10gs-E7m induserte opptil 92% og 95% nedregulering av p107, noe som indikerer at det konstruerte ß som bærer det minimale p107-bindende domenet, fungerer like effektivt som det opprinnelige F-TrCP-E7N i nedverdigende målproteiner.
Retroviral-Mediert Levering Av konstruert ß for Vedvarende Nedbrytning av Endogene Mål. Vi undersøkte deretter om de konstruerte ubiquitin-proteinligasene kunne uttrykkes stabilt for å oppnå vedvarende nedbrytning av det tiltenkte målet. Hl-60 promyelocytiske leukemiceller ble transdusert med rekombinante retrovirus som uttrykte PBMN-GFP, F-TrCP (m1) – E7N eller kontroll F-TrCP-E7N(Δ), der RB / p107-bindingsstedet ble slettet (1). Infiserte celler med kromosomalt integrerte kimære f-TrCP-transgener ble isolert VED FACS sortering, basert på ekspresjon AV GFP fra virusene, og nedbrytning av den endogene p107 ble vurdert fra infiserte hl-60-celler enten umiddelbart etter infeksjon (Fig. 5A), eller etter 3 måneders dyrking i vekstmedium (Fig. 5B). Videre, fordi to andre medlemmer AV rb-familiens proteiner, RB og p130, også uttrykkes I hl-60-celler, undersøkte vi om en enkelt F-TrCP-E7N samtidig kan målrette nedbrytning av hele rb-familien av proteiner som interagerer med samme LXCXE-motiv AV E7N. Ektopisk uttrykk for retroviralt transdusert F-TrCP-E7N indusert dramatisk nedregulering av hypofosforylert form AV RB, så vel som p107(Fig . 5A) og p130 (data ikke vist) I hl-60 celler, enten umiddelbart etter infeksjon og FACS sortering (Fig. 5A), eller 3 måneder etter infeksjon og kontinuerlig dyrking (Fig. 5b, lane 3). I motsetning hadde stabilt uttrykk For F-TrCP-E7N (Δ) I HL – 60-celler ingen effekt på å endre p107, RB( Fig . 5a, lane 3), og p130 nivåer(data ikke vist). I samsvar med observasjonen at F-TrCP-E7N fortrinnsvis nedbryter hypofosforylert RB I u2os-celler(Fig. 2), reduksjon av hyperfosforylerte rb-arter ved stabilt uttrykk For F-TrCP-E7N var mindre uttalt, sammenlignet med den hypofosforylerte formen I HL – 60-celler(Fig . 5a, sammenlign kjørefelt 2 av pRB og pRB-P).
VED behandling med all-trans retinsyre (ATRA) går hl-60-celler ut av cellesyklusen og gjennomgår terminal differensiering. En akkumulering av hypofosforylert RB ble observert, som tidligere ble rapportert å bidra TIL ATRA-indusert vekststans, mens den hyperfosforylerte RB ikke var detekterbar (24, 25). FOR å undersøke om SCFßTrCP-maskineriet også kan utnyttes under cellesyklusutgang, ble hl-60-celler som stabilt uttrykte F-TrCP-E7N eller F-TrCP(m1) – E7N behandlet med 1 µ atra i 72 timer, og nedbrytning av RB-familieproteinene ble evaluert. Hl-60-celler som stabilt uttrykker F-TrCP-E7N resulterte i henholdsvis 95%, 98% og 85% reduksjon av rb -, p107-og p130-nivåene, sammenlignet med celler infisert med kontroll pBMN-GFP-viruset (Fig . 5b, kjørefelt 2). Fordi ATRA aktiverer også transkripsjon av gener under kontroll Av Moloney murine leukemi VIRUS LTR av pBMN-GFP (26), den økte ekspresjon Av F-TrCP-E7N PÅ ATRA behandling trolig ytterligere bidratt til effektiv nedregulering av p107, p130, og hypophosphorylated RB (Fig . 5B).
EFFEKTEN AV RB-familieproteinene på normal cellesyklusprogresjon har blitt undersøkt i musembryofibroblaster med forstyrrelser I rb -, p107-og p130-gener, og funnet å ikke reagere på signaler Som induserer g1-arrest, som vekstfaktoruttak eller DNA-skade (27, 28). De kollektive effektene AV RB-familiemedlemmene i tumorcelleproliferasjon er imidlertid ikke studert på grunn av mangel på effektive revers genetiske verktøy. De stabile hl-60-cellene som uttrykker F-TrCP (m1)-E7N fra denne studien tillot oss å vurdere hvordan tumorceller mangelfull for alle tre rb-familieproteinene reagerte På g1-arrestsignaler. I eksponentielt voksende hl-60-celler som uttrykker F-TrCP (m1) – E7N som induserte konstitutiv nedbrytning AV rb-familiens proteiner, ble det observert en markert akselerasjon av cellesyklusprogresjon sammenlignet med de som ble infisert av kontroll pBMN-GFP-viruset (Fig. 5c Venstre). Dette resultatet er i samsvar med nedsatt kontroll Av g1-s overganger observert I RB–/–, p107–/–, og p130 – / – triple knockout mus embryo fibroblaster (27, 28).
ATRA-behandling hemmet G1-Til-s-faseovergang i hl-60-celler infisert av kontroll pBMN-GFP (Fig. 5c) eller f-TrCP-E7N(Δ) virus (data ikke vist), som er i samsvar med det som ble rapportert for uinfiserte HL-60-celler (Fig . 5C) (24). En innledende forsinkelse I G1 – s overgang ble også observert i pbmn-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60 celler ved 48 timer etter ATRA. Imidlertid kunne en fullstendig g1-arrest ikke oppnås på senere stadium (72-96 h) og celler fortsatte løpet av cellesyklusprogresjon (Fig. 5C). I kontrast, kontroll pBMN-GFP / HL – 60 celler ble alle blokkert I G1 mellom 72 og 96 h. disse observasjonene tyder På At F-TrCP (m1)-E7N-mediert degradering AV rb familiemedlemmer svekker en sen ATRA-respons hendelse som er nødvendig for fullføring av vekst arrest, mens tidlig demping Av G1 – s progresjon var i stor grad upåvirket. Videre ble det observert en dramatisk reduksjon i celletall mellom 72 og 96 timer etter ATRA-behandling på grunn av massiv celledød under atra-indusert cellesyklusutgang og differensiering (29). Påfallende viste HL-60-celler som uttrykte F-TrCP(m1)-E7N en gjennomsnittlig økning på 2 til 3 ganger i subG1 – populasjonene sammenlignet med kontrollvirusinfiserte HL-60-celler (data ikke vist), noe som stemmer overens med økt celledød i RB–/–, p107–/– og p130–/– triple knockout musembryonale fibroblastceller under veksthemmende forhold (28). Samlet sett induserte konstitutiv ekspresjon Av F-TrCP(m1)-E7N nedregulering av HELE rb-familien proteiner, noe som fører til en hemming av vekststans og en økning i celledød på ATRA-behandling.
ATRA-indusert g1 arrest innebærer koordinert regulering av flere cellulære signaler / komponenter som negativt styrer cellesyklusen (omtalt i ref. 30). Dimberg et al. (31) rapportert AT ATRA utløser en sekvens av hendelser i myeloide celler som involverer en tidlig økning i p21waf1 ekspresjon, stabilisering av p27kip1, og senere, defosforylering AV RB ved utbruddet Av g1 arrest. Fordi ß kun degraderer RB-familiemedlemmer og ikke har noen effekt på stabiliteten til p21waf1 og p27kip1, er det sannsynlig at bare den sene, RB-avhengige ATRA-responsen påvirkes, noe som er i samsvar med motstanden til pBMN-F-TrCP(m1)–E7N/HL-60-celler for å fullføre g1-arrestat72-96 h (Fig. 5C). Observert tidlig veksthemming av ATRA ved 48 timer (Fig. 5C) kan tilskrives, i det minste delvis, til opp-regulering av p21waf1 og p27kip1, hvis stabilitet ikke påvirkes av konstitutiv F-TrCP (m1)-E7N uttrykk (Fig. 2 og 5).
