CRBN er effektivt degradert AV vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs
PROTAC teknologi benytter E3 ligaser for å ødelegge målproteiner. Vi lurte dermed på om En E3 ligase selv kan bli ubiquitinert og forringet av en Annen E3 ligase hvis to forskjellige E3 ligaser er plassert i nærheten. VHL-nedbrytere kan potensielt være erytropoietin-substitutter ved aktivering Av HIF1a. For å designe dette, koblet vi pomalidomid, ET CRBN-målretting molekyl, TIL VHL032, EN VHL E3 ligase ligand(Fig. 1A). Linkeren koblet aminogruppen pomalidomid og den terminale acetylgruppen AV VH032; fordi disse er løsemiddeleksponerte regioner, ville en forbindelse mellom dem ikke sannsynligvis forstyrre deres binding til hver e3-ligase. For syntese AV VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs (Fig. 1b Og Utfyllende Fig. S1A), 4-fluorothalidomid (1) OG VHL ligand (5) ble utarbeidet som tidligere rapportert33. 4-Fluorothalidomid (1) ble behandlet med fire aminlinkere (2) som hadde en tert-butylestergruppe i nærvær Av N,N-diisopropyletylamin (DIPEA) i dimetylsulfoksid (DMSO) for å danne et mellomprodukt (3). Etter deproteksjon av tert-butylgruppen i 3 ved behandling med trifluoreddiksyre (TFA) i diklormetan (DCM) ble syren (4) kombinert MED VHL-liganden (5 eller 7) i nærvær av 1–1h-1,2,3-triazolopyridinium 3-oksydheksafluorofosfat (HATU) og DIPEA for å gi PROTACENE (6), TD-158, TD-165, TD-343 og td-487 (8).
CRBN nedbrytes effektivt av vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs. (A) Skjematisk diagram av PROTAC som inneholder pomalidomid og VHL ligand (VH032). B) Struktur AV TD-158, TD-165, td-343 OG td-487. (C) HEK293T-celler ble behandlet MED TD-158, TD-165, td-343 eller TD-487 (0,1, 1 og 10 µ) i 24 timer, OG vhl-proteinnivåer ble analysert ved immunoblotting. L. e. indikerer lang eksponering Av Western blot. (D) dc50 graf AV td-158 og TD-165 forbindelser (TD – 165, DC50 = 20,4 nM; TD-158, DC50 = 44,5 nM). (E) HA-CRBN Og Flag-VHL ble uttrykt I HEK293T celler. Etter 24 h ble cellene behandlet MED TD-158 (500 nM) for 24 h. Hele cellelysater ble analysert ved immunoblotting for de angitte proteinene. (F) HEK293T-celler ble behandlet med 500 nM TD-158 på forskjellige tidspunkter, OG CRBN-nivåer ble analysert ved immunoblotting. L. e. indikerer lang eksponering Av Western blot.
etter behandling med disse forbindelsene undersøkte vi nivåene AV VHL og CRBN Ved Western blot analyse. Behandling MED TD-158, TD-165 eller TD-343 forårsaket en konsentrasjonsavhengig reduksjon i NIVÅET AV CRBN-proteiner(Fig. 1c, øvre panel). Nivåer av BÅDE vhl lang form og VHL kort form, men økt, antagelig på grunn av stabilisering av kjemisk-protein interaksjon (Fig. 1c, øvre midtre og nedre midtre paneler) 34. VED behandling med 10 µ TD-158 ble CRBN-nivåene gjenopprettet; denne» krok » – effekten er en typisk egenskap som oppstår i sammenheng MED HØYDOSE PROTAC-indusert proteindegradering9,35,36,37. TD-487, en stereoisomer AV TD-165, klarte imidlertid ikke å indusere CRBN-nedbrytning (Fig. 1C). TD-343 hadde relativt svak aktivitet, noe som innebærer at inkorporering av oksygen i linker hemmer PROTAC aktivitet. En kvantitativ revers transkripsjon-polymerase chain reaction (RT-PCR) analyse indikerte at reduksjonen I CRBN nivå indusert AV vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs ikke skyldes endringer i mRNA (Supplerende Fig. S1B). 50% degraderingskonsentrasjon (DC50) og maksimal degradering (Dmax) ble målt for alle syntetiserte forbindelser. De beregnede dc50-og Dmax-verdiene FOR TD-158 var 44,5 nM og 97 nM.1%, henholdsvis, og de tilsvarende verdiene FOR TD-165 var 20,4 nM og 99,6% (Fig. 1d Og Utfyllende Fig. S1D). Den kortere linkerholdende degraderen TD-156 (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) viste svakere aktivitet sammenlignet MED TD-165 (Supplerende Fig. S1C). TD-343 (DC50 = 367.8 nM , dmax = 85.1%), med oksygen innlemmet i linker, førte til ineffektiv nedbrytning AV CRBN. For å teste effekten av koblingen til thalidomid, undersøkte VI nedbrytning AV CRBN ved VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs med en annen kobling. TD-760 (DC50 = 367.7 nM , dmax = 82%), med en glykolbinding og TD-033 (DC50 = 2546.1 nM), med en amidbinding, viste redusert CRBN-nedbrytning, mens TD-759 (DC50 = 28.8 nM), med en glysinbinding, viste en styrke som ligner TD-165. For å avgjøre om relative proteinnivåer kan bidra til denne partiske proteinnedbrytningen, behandlet vi celler som overuttrykker VHL, CRBN eller begge med TD-158, og analyserte CRBN-og VHL-nivåer. I alle tilfeller BLE CRBN-nivåene redusert, MENS VHL-nivåene forble like eller økte (Fig. 1E). I time-course eksperimenter, td-158 degradert CRBN med mer enn 80% innen 3 h og fullstendig degradert det etter 12 h (Fig. 1F). Td-158-indusert CRBN-degradering ble også observert i forskjellige humane cellelinjer (Supplerende Fig. S2A-D).
Degradering AV CRBN ved vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs er avhengig AV CRL2VHL
for å verifisere AT crbn degradering AV TD-158 var avhengig AV UPS eller cullin-ring ubiquitin ligaser (CRL), testet vi bortezomib, en proteasomhemmer, OG MLN4924, EN neddyleringshemmer. Samtidig behandling MED TD-158 og bortezomib ELLER MLN4924 forhindret DEGRADERING AV CRBN (Fig. 2a Og Utfyllende Fig. S3A). Som forventet økte poly-ubiquitin-kjededannelsen markant i nærvær AV TD-158(Fig. 2B). I tillegg dempet knockdown AV VHL ved små forstyrrende RNA (siRNA)td–158-indusert CRBN-nedbrytning i HEK293T-celler (Fig . 2C). I motsetning til DETTE gjenopprettet ekspresjon AV VHL i 786-o-celler, EN VHL-mangelfull nyrekarsinomcellelinje, TD-158-indusert CRBN-nedbrytning (Fig. 2D). I tråd med disse resultatene forhindret siRNA-mediert knockdown Av Cullin2, et stillasprotein FRA CRL2VHL-komplekset, td-158-indusert CRBN-nedbrytning (Fig. 2E). Samlet indikerer disse resultatene AT CRBN-nedbrytning av VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs er avhengig AV CRL2VHL-komplekset.
Nedbrytning AV CRBN ved vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs er avhengig AV CRL2VHL. (A) HEK293T-celler ble behandlet MED TD-165 (1 µ) i 12 timer, etterfulgt av tillegg av bortezomib (20 nM) eller DMSO i 8 timer.helcellelysater ble utsatt for immunoblotanalyse for de indikerte proteinene. (B) FLAGG-merket CRBN (CRBN-Flagg) og HA-merket Ubiquitin (HA-Ub) ble uttrykt I HEK293T celler. Etter 24 timer ble cellene behandlet MED TD-158 (500 nM) og bortezomib (20 nM), ELLER DMSO og bortezomib (20 nM), for 12 timer. (C) HEK293T celler ble transfisert med siRNA spesifikk FOR VHL eller kryptert (kontroll) siRNA. Etter 24 h ble cellene behandlet MED TD-158 (500 nM) for 24 h. helcellelysater ble analysert ved immunoblotting for de angitte proteiner. (D) 786-o celler OG VHL-uttrykke 786-o celler (786-O + VHL) ble behandlet MED TD-158 (500 nM) for 24 h. Hele celle lysater ble analysert ved immunoblotting for de angitte proteiner. (E) HEK293T – og CUL2-knockdowned HEK293T-celler ble behandlet MED TD-165 (1 µ) eller TD-487 (1@M) for 24 timer og helcellelysater ble analysert ved immunoblotting. (F) CRBN-Flagget ble uttrykt I HEK293T-celler. Etter 36 timer ble cellene behandlet MED TD-158 (1 µ) og bortezomib (20 nM), ELLER DMSO og bortezomib (20 nM), i 12 timer. helcellelysater og proteiner immunoprecipitert Ved Bruk Av Flagg m2 magnetiske kuler ble analysert ved immunoblotting for de indikerte proteinene. (G) Rensede CRBN-og VHL/ELOB/ELOC-komplekse proteiner ble blandet og aliquotert i fire rør. TD – 158 og glutation perler ble tilsatt som indikert og inkubert for 3 h. Etter inkubasjon ble glutation perler vasket og analysert ved immunoblotting og Coomassie Blå flekker.
Effektiv nedbrytning av PROTACs krever dannelse av et ternært kompleks med målproteinet Og e3 ligase9,38. For å teste dette, utførte vi co-immunoprecipitation eksperimenter. Vi fant at eksogent uttrykt Flagg-merket CRBN co-immunoprecipitated endogen VHL i nærvær AV TD-158, men ikke i sitt fravær (Fig. 2F). GST-nedtrekksforsøk ved bruk av rensede proteiner viste at CRBN interagerte direkte MED VHL-Elongin B / C-komplekset i nærvær AV TD-158(Fig . 2G). Dessuten hemmet tilsetningen av overskytende pomalidomid eller VHL-ligand TD-158-indusert CRBN-degradering (Supplerende Fig. S3B, C). Eksogent UTTRYKT CRBN Y384/W386A (AA), en pomalidomidbindende defekt mutant16, ble ikke degradert av TD-158 (Supplerende Fig. S3D). Dermed antyder disse dataene at dannelsen av et ternært kompleks blant CRBN, VHL og TD-158 er en forutsetning for CRBN-nedbrytning.
en global proteomisk analyse viser AT TD – 158 induserer nedbrytning av CRBN
for å undersøke nedbrytningen AV CRBN på en objektiv måte, utførte vi en kvantitativ proteomisk analyse. For å minimere sekundære effekter AV CRBN-nedbrytning behandlet Vi Jurkat-celler, som uttrykte CRBN og IMiD neo-substrater, MED TD-158 eller DMSO (kjøretøykontroll) for 12 h.proteinene fra hver prøve ble fordøyd og de fordøyede peptidene ble merket for isobarisk merking koblet til væskekromatografi-tandem massespektrometri. Denne analysen identifiserte 7148 proteiner som inneholdt mer enn tre ikke-redundante, unike peptider (Supplerende Tabell S1). BARE tre proteiner—CRBN, CNIH1 og LMBRD2-oppfylte kriteriene For En P-verdi = 0,05 og mer enn en 1,5 ganger endring. BLANT DEM VAR CRBN det eneste proteinet som endret seg med mer enn 2 ganger(Fig. 3A). Imidlertid forblir nivåene av ANDRE komponenter I CRL4CRBN-komplekser (CUL4A, CUL4B, DDB1 OG RBX1) og CRL2VHL-komplekser (elongin C, elongin B , CUL2 OG RBX1) uendret (Fig. 3B, C). Interessant, nivåene av tidligere rapporterte neo-substrater Av IMiDs, inkludert IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 OG ZNF653, ble ikke endret VED TD – 158 behandling (Fig . 3B) 39,40,41. Disse resultatene ble bekreftet ved immunoblotting I Jurkat og forskjellige myelomcellelinjer (Fig. 3d Og Utfyllende Fig. S2A-D).
Globale proteomiske endringer ved td-158-behandling. (A) Vulkanplott av proteiner identifisert ved kvantitative proteomiske analyser, sammenligning av lysater fra Jurkat-celler behandlet i 12 timer med 1 µ TD-158 eller DMSO. Data representerer tre biologiske replikater. X-aksen representerer fold-endringen i proteinnivåer i logaritmisk skala, og y-aksen representerer P-verdi i logaritmisk skala. (B) Relativ overflod AV CRL4CRBN-kompleks, CRL2VHL-kompleks OG neo-substrat AV CRBN (*P < 0,05, * * P < 0,1). Den røde linjen indikerer en 1,5 ganger forskjell. (C) Jurkat-celler ble behandlet MED TD-158 (1 µ) eller DMSO i 24 timer. hele cellelysater ble analysert ved immunoblotting for CRL4CRBN komplekse proteiner. (D) Jurkat-celler ble behandlet med ELLER uten DMSO, TD-158 (1 µ), pomalidomid (1 µ) eller VHL ligand (1 µ) i 24 timer. helcellelysater ble analysert ved immunoblotting for de indikerte proteinene.
CRBN-nedbrytning ved VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs rekapitulerer EN CRBN-mangel
et endogent substrat AV CRL4CRBN er glutaminsyntetase LIM, som er et nøkkelenzym i biogenesen av glutamin. Acetyltransferasen CBP / p300 acetylerer to n-terminale lysinrester AV LIM under forhold med høye nivåer av glutamin, og den resulterende acetylerte LIMMEN fanges og ubiquitineres AV CRL4CRBN og fjernes deretter av proteasomer22. For å undersøke effekten AV TD – 158 PÅ LIMNIVÅER sultet Vi Hep3B-celler av glutamin i 48 h og deretter resupplied glutamin i nærvær eller fravær AV TD-158. TD-158 induserte CRBN-degradering uavhengig av glutaminstatus, og NIVÅENE AV LIMTRE sank langsommere over tid i NÆRVÆR AV TD-158 enn i fravær (Fig. 4A, B). Videre viste in vivo ubiquitination analyser at ubiquitination AV LIM redusert i nærvær AV TD-158 (Fig. 4C). Vi undersøkte også om TD – 165-behandling gir cellulær resistens mot IMiD. To IMiD-sensitive cellelinjer, WSU-DLCL2 og RPMI8226, ble forhåndsbehandlet MED TD-165 eller DMSO i 24 timer og deretter behandlet med pomalidomid, TD-165 eller begge for 3 d. Forbehandling MED TD-165 reduserte pomalidomids antiproliferative effekter i begge cellelinjene (Fig . 4D, E). Samlet sett indikerer disse dataene AT CRBN-nedbrytning ved VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs rekapitulerer EN CRBN-mangel.
CRBN-nedbrytning ved vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs rekapitulerer EN CRBN-mangel. (A) Hep3B-celler ble glutamin-sultet og behandlet MED TD-158 (500 nM) for 48 h. cellene ble deretter behandlet med glutamin (4 mM) på forskjellige tidspunkter. Nedbrytning AV LIM BLE analysert ved immunoblotting. (B) Kvantitative resultater fra tre uavhengige eksperimenter. (C) LIM-Myc og V5-Ub ble uttrykt I HEK293T-celler. Etter 24 timer ble cellene behandlet MED TD – 158 (500 nM) eller DMSO i 12 timer og deretter behandlet med bortezomib (100 nM) eller DMSO i 12 timer. (D,E) wsu-DLCL2 (D) – og RPMI8226 (E) – celler ble forhåndsbehandlet MED TD-165 (1 µ) eller DMSO i 24 timer og ble etter høsting delt inn i fire grupper. Hver gruppe ble deretter behandlet med pomalidomid (1@m) og DMSO, eller pomalidomid (1 µ) og TD-165 (1 µ), i 3 d. Celleviabilitet ble målt ved Bruk Av CellTiter-Glo (**P < 0,001, * P < 0,01).
for å undersøke in vivo-effektene AV VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs, forsøkte VI å avgjøre om TD-165 kan indusere CRBN-nedbrytning i dyremodeller. Selv om aminosyrerester i MUS CRBN (mCRBN) som er viktige for teratogenitet, ikke er bevart, ble mCRBN tydelig degradert, om enn i litt mindre grad, AV TD-165 i musembryonale fibroblaster (Supplerende Fig. S4A). Vi administrerte deretter td-165 intraperitonealt til mus for å avgjøre om TD – 165 induserer CRBN-nedbrytning in vivo. CRBN-nivåene ble imidlertid ikke endret i milten, mononukleære celler i perifert blod (pbmc) eller lever (Supplerende Fig. S4B). Gitt at farmakokinetikken til TD-165 er rimelig (Supplementstabell S2), kan dette fraværet av en effekt skyldes DEN høye plasmaproteinbindingen (99,9%) AV TD-165 (Supplementstabell S3).
n-terminalt avkortet CRBN blir ikke degradert av vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs
for å bestemme hvilket DOMENE AV CRBN som er viktig FOR TD-165–mediert CRBN–nedbrytning, genererte vi en serie CRBN delesjonsmutanter (D1-D4), som vist I Fig. 5a. Celler som uttrykte CRBN i FULL LENGDE eller individuelle delesjonsmutanter ble behandlet med ENTEN DMSO eller TD-165, og cellelysatene ble undersøkt for degradering etter TD-165-behandling. Overraskende nok ble ingen AV DE fire crbn-slettemutantene degradert AV TD-165, mens FULL lengde CRBN ble effektivt degradert (Fig. 5B). Spesielt VAR VHL-nivåene litt forhøyet antagelig på grunn av stabilisering av kjemisk-protein-interaksjon i nærvær AV TD-165, men ikke endret ved uttrykk for avkortede CRBN-mutanter i nærvær AV TD-165(Fig . 5B). En mulig forklaring på dette ville være manglende evne til delesjonsmutanter til å danne et ternært kompleks. Imidlertid dannet d1-mutanten et trefoldig kompleks MED TD-165 og VHL(Fig. 5c), og ubiquitination Av D1 økt i nærvær AV TD-165 (Fig. 5D). Vi hypotese at amino-terminal lysin rester AV CRBN er nødvendig for ubiquitination. For å teste denne ideen, erstattet vi alle tre lysinrester i N-terminus AV CRBN (a.a. 1-80) med arginin, individuelt og i kombinasjon, og undersøkte deretter cellelysater for CRBN-nedbrytning. TD-158 degraderte effektivt alle mutanter i samme grad SOM villtype CRBN (Fig. 5E), som indikerer at de tre lysinrester Ved n-enden AV CRBN ikke er nødvendig for nedbrytning indusert AV vhl-CRBN heterodimerizing PROTACs.
Den n-terminale forstyrrede REGIONEN AV CRBN er nødvendig for nedbrytning, men ikke for allestedsnærværende, ved VHL-CRBN heterodimerizing protacs. (A) Skjematisk diagram som illustrerer CRBN avkortingsmutanter. LON, lon protease domene; TB, thalidomid bindende domene. (B) xpress-merkede FULL-lengde CRBN eller d1, D2, D3 eller D4 delesjonsmutanter ble uttrykt I HEK293T celler. Etter 24 timer ble cellene behandlet MED TD-165 (3 µ) eller DMSO i 24 timer. Helcellelysater ble analysert ved immunoblotting for de angitte proteinene. (C) Plasmider som koder For Xpress-merket D1 og His-SBP-merket VHL ble transfisert til HEK293T-celler. Etter 48 timer ble celler behandlet MED TD-165 (1 µ) eller DMSO i 24 timer. helcellelysater og proteiner som ble trukket ned ved bruk av streptavidinperler ble analysert ved immunoblotting for de indikerte proteinene. (D) Plasmider som koder FOR XPRESS-merkede CRBN, K39R, K42/43 r eller k39/42/43 r mutanter ble transfisert til HEK293T-celler. Etter 24 timer ble cellene behandlet MED TD-158 (2 µ) eller DMSO i 24 timer. Helcellelysater ble analysert ved immunoblotting for de angitte proteinene.
den uordnede regionen av det målrettede proteinet er nødvendig for effektiv PROTAC-indusert nedbrytning
Vi forsøkte deretter å bestemme strukturelle forskjeller mellom FULL lengde CRBN og CRBN delesjonsmutanten D1. N-terminus AV CRBN (a.a. 1-80) ble spådd å inneholde en utfoldet eller iboende uordnet region, basert på En IUPred2A analyse (Supplerende Fig. S5A). Denne uordnede regionen (a.a. 1-48) var faktisk indiscernible I CRL4CRBN krystallstruktur på grunn av sin fleksibilitet (PDB entry; 6BN7). Det har blitt vist at den iboende uordnede regionen er en av hovedkomponentene i proteasomal degron, og det virker som initiator for proteasomal proteolysis25. Alternativt kan det p97/valosinholdige proteinkomplekset (p97/VCP) utfolde den sekundære strukturen, noe som letter proteinenes proteasomale nedbrytning. For å undersøke forholdet MELLOM protac-indusert proteindegradering og p97 / VCP-komplekset, testet vi effekten Av N2, N4-dibenzylkinazolin-2,4-diamin (DBeQ), en p97/VCP-hemmer, PÅ TD-165-indusert CRBN-nedbrytning. Disse forsøkene viste AT crbn-nedbrytningen ikke ble påvirket Av DBeQ-behandling (Fig. 6A). Nivåene AV DNA-skade-induserbar transkripsjon 3 (DDIT-3; CHOP) og lipidated LC-3II, brukt som positive kontroller, ble forhøyet ved DBeQ-behandling. Knockdown av p97 ved siRNA-eller DBeQ-behandling svekket ERAD-og autofagibaner, noe som fører til oppregulering av CHOP, en veletablert UPR-markør, og akkumulering av HENHOLDSVIS lc-3II, en representativ autofagimarkør (Fig . 6A) 42. Derfor, for å undersøke om den uordnede regionen AV CRBN letter PROTAC-indusert proteasomal nedbrytning, festet vi den uordnede regionen (a. a. 1-80) AV CRBN Til d2, D3 og D4 mutanter og undersøkte kimære proteiner for nedbrytning. Alle kimære proteiner, spesielt d4-kimæren, ble degradert AV TD-165 på en konsentrasjonsavhengig måte (Fig. 6B). Innføring av EN CRBN-uordnet region til Enten N – eller C-enden AV VHL induserte imidlertid ikke nedbrytning av fusjonsproteinet (Fig. 6C), som indikerer at vedlegg av den uordnede regionen ikke er tilstrekkelig for alle målrettede proteiner. FOR å utvide denne ideen til nedbrytning indusert av Andre PROTACs, testet VI ARCC4, en tidligere rapportert androgenreseptor (AR) PROTAC43, fordi AR også har en utfoldet region Ved n-terminus (a.a. 1-330), som bestemt ved bruk av Analyseverktøyet IUPred2A (Supplerende Fig. S5B). VED ARCC4-behandling ble AR uten Den n-terminale forstyrrede regionen (Δ 330) degradert mindre effektivt enn AR i FULL lengde. Intriguingly, vedlegg AV CRBN uordnede regionen (a.a. 1-80) TIL AR Δ 330 økt degradering effektivitet (Fig. 6D Og Utfyllende Fig. S5C). I tråd med dette, vedlegg AV AR uordnede regionen (a.a. 1-170) TIL CRBN D1 mutant også fremmet proteolyse AV TD-165 (Fig. 6E Og Utfyllende Fig. S5D).
den uordnede regionen av det målrettede proteinet er nødvendig for effektiv nedbrytning av PROTACs. (A) HEK293T-celler ble behandlet MED TD – 165 (1@m), P97/VCP-hemmeren DBeQ (10 µ), eller begge for 6 timer. helcellelysater ble analysert ved immunoblotting for de indikerte proteinene. (B) N-terminal CRBN (a.a. 1-80) ble satt inn I N – eller C-terminus Av Hans-SBP-merket VHL plasmid, og plasmider ble uttrykt I HEK293T celler. Etter 8 h ble cellene høstet og delt inn i fire grupper. Hver gruppe ble deretter behandlet med økende konsentrasjoner AV TD-165 for 48 h. helcellelysater ble analysert ved immunoblotting for de indikerte proteinene. (C) Plasmider som uttrykker N-terminus AV CRBN (a. a. 1-80) smeltet Til D2, D3 eller D4 ble transfisert TIL HEK293T celler. Etter 8 h ble cellene høstet og delt inn i fire grupper. Hver gruppe ble deretter behandlet med økende konsentrasjoner AV TD-165 for 48 h. helcellelysater ble analysert ved immunoblotting for de indikerte proteinene. (D) Plasmider som uttrykker AR I FULL LENGDE, n-terminalt slettet AR (ΔN330), ELLER N-terminalen TIL CRBN (a.a. 1-80) smeltet TIL Δ 330 (CRBN (a.a. 1-80) +Δ 330) ble overført til HEK293T-celler. Etter 8 h ble cellene høstet og delt inn i fire grupper. Hver gruppe ble deretter behandlet med økende konsentrasjoner AV ARCC4 for 24 h. helcellelysater ble analysert ved immunoblotting for de indikerte proteinene. (E) Plasmider som uttrykte CRBN i FULL LENGDE, d1 delesjonsmutant Eller N-terminus AV AR (a.a. 1-170) fusjonert Til D1 (AR (1-170) +D1) ble transfisert til HEK293T-celler. Etter 8 h ble cellene høstet og delt inn i fire grupper. Hver gruppe ble deretter behandlet med økende konsentrasjoner AV TD-165 for 48 h. helcellelysater ble analysert ved immunoblotting for de indikerte proteinene.
for ytterligere å forsterke disse funnene valgte Vi PROTACs med høy styrke (DC50 < 1 µ) basert på et litteratursøk, og analyserte dem deretter for en iboende uordnet region ved Hjelp av IUPred2A-verktøyet. Interessant, to tredjedeler av de utvalgte PROTAC målrettede proteiner ble funnet å ha en uordnet region på mer enn 40 aminosyrer, enten ved en av deres termini eller internt (Tabell 1) 44, selv om aminosyresekvensbasert prediksjon av uordnede eller ustrukturerte regioner ikke tar andre faktorer, slik som protein-protein interaksjon eller post-translasjonelle modifikasjoner, i betraktning44,45, 46. I tråd MED DETTE har VHL-Homo-PROTAC vist seg å indusere nedbrytning AV VHL lang form, som har en uordnet region ved Sin N-ende, men IKKE VHL kort form47. Dermed støtter dette vår ide om at den uordnede regionen av målrettede proteiner er nødvendig for effektiv nedbrytning av PROTACs.
