Resultater

Vi vurderte først OM CD63 og H,K-Atpase befinner seg i samme subcellulære kammer i parietalceller i magesekken. Tidligere arbeid har vist at rotteparietalceller uttrykker høye NIVÅER AV CD63 (22). Immunfluorescensmikroskopi på frosne deler av rottemagen indikerer AT CD63 er tilstede i de fleste celler i rottemagen, inkludert parietalceller (Fig. 1A). CD63 delvis colocalizes Med HKa i parietalceller. I tillegg analyserte vi et høyt renset tve-preparat fra hog mage (en snill gave fra Ct Okamoto). H, k-ATPase bidrar til 50% av proteininnholdet i lignende preparater (23). Western blot analyse indikerer at CD63 er rikelig tilstede i dette rensede preparatet Av TVEs (Fig. 1B).

for å undersøke en mulig in situ interaksjon MELLOM CD63 Og H,K-ATPase, utførte vi nedtrekksforsøk ved bruk av biotinylert tomatlektin. Tidligere studier har vist at dette lektinet binder seg spesifikt og unikt til HKß i magepreparater (24-27). Vi slettet ET tve-preparat med anti-HKß mAb og biotinylert tomatlektin for å bekrefte at lektin assosierer spesifikt med glykosylert HKß (Fig . 1C). Vi brukte deretter biotinylert tomatlektin for å isolere proteiner som interagerer Med HKß i tve-preparatet. Western blot analyse indikerer AT CD63 er utfelt av tomat lectin (Fig. 1D), som viser AT CD63 og H,K-ATPase assosierer in situ og antyder at denne assosiasjonen kan være fysiologisk relevant. Forbehandling AV tve-preparatet med 4% SDS, etterfulgt av en 20 ganger fortynning i lysisbuffer, reduserte SIGNIFIKANT MENGDEN CD63 som ble utfelt. Mengden Av HKß som ble utfelt ble ikke endret ved denne behandlingen(data ikke vist). Disse dataene tyder på AT TILSTEDEVÆRELSEN AV CD63 i nedtrekk skyldes dets tilknytning Til HKß og ikke til en direkte tilknytning MELLOM CD63 og tomatlektin.

for å undersøke den funksjonelle betydningen av samspillet mellom CD63 og HKß videre, transfiserte VI COS-7-celler med en cDNA som koder For kanin HKß enten enkeltvis eller sammen med en cDNA som koder for EN FLAGGMERKET CD63-konstruksjon (CD63-FL). Vi har vist at HKß ikke trenger å montere Med HKa for å nå celleoverflaten i transfiserte COS-celler (20). VI brukte EN CD63-konstruksjon som bærer et flagg epitop-merke på Sin n-ende fordi C-terminalen TIL CD63 inneholder et tyrosinbasert motiv som kreves for intracellulær handel med dette tetraspaninet (13).

COS-celler som ble infisert Med HKß og CD63-FL ble utsatt for immunnedsettelse ved BRUK av anti-FLAGG pAb. Western blot analyse av det immunoprecipiterte materialet indikerer At HKß coprecipitates MED CD63 (Fig. 2, HKß + CD63-FL). CD63-FL og HKß proteiner coimmunoprecipitate i en rekke vaskemidler, inkludert 2% CHAPS, 1% Brij 96 og 1% Triton X-100. Sammenhengen MELLOM CD63 og HKß utgjør et av de få tetraspaninkompleksene som er beskrevet som overlever løseliggjøring I Triton X-100 og er dermed sannsynlig å representere en direkte interaksjon (28). Β-underenheten har to former: ß( moden), som er modifisert med komplekse karbohydrater, og ß (kjerne), som er modifisert med høy mannose karbohydrater (29). Begge former coprecipitate MED CD63, selv om forholdet mellom ßc og ß i bunnfallet varierer som en funksjon av oppløsningsforholdene.

HKß ble ikke påvist i flaggimmunoprecipitasjoner utført på celler transfisert med HKß alene, noe som viser at FLAGG-pAb ikke interagerer med β-underenheten (Fig. 2, HKß). HKß coimmunopresipiterer ikke MED FLAGG pAb fra en blanding (50:50, vol/vol) av lysater fremstilt fra celler transfisert enkeltvis MED CD63-FL og β-underenheten, som bekrefter at interaksjonen skjer in vivo (Fig . 2, andre kjørefelt). Prøver inkubert MED FLAGG pAb utfeller ikke lysosomal protein Lamp-1, noe som indikerer at samspillet MELLOM CD63-FL og HKß er spesifikk og ikke en gjenstand for ufullstendig oppløselighet AV CD63-rommet (Fig. 2).

vi undersøkte deretter om samspillet mellom HKß og CD63 påvirker den subcellulære lokaliseringen av β-underenheten. HKß er tilstede ved celleoverflaten i transitttransfekterte COS-celler (Fig. 3 A-C). Det er en uttalt omfordeling av β-underenheten til intracellulære cd63-holdige vesikler når COS-celler er cotransfected med Både HKß og CD63-FL (Fig . 3 D-F). For å utelukke muligheten for at denne endrede lokaliseringen kan være en uspesifikk effekt AV CD63-overuttrykk, undersøkte vi effekten AV CD63-uttrykk på fordelingen AV AQP4. AQP4 er en vannkanal som er tilstede i de basolaterale plasmamembranene i parietalceller. Det gjennomgår ikke regulert endocytose og eksocytose Med H,K-ATPase (30, 31). Denne kanalen coimmunoprecipitate IKKE MED CD63-FL I En Triton X-100 lysat av cotransfected COS celler (Fig. 4A). Når cotransfected celler visualiseres ved immunfluorescens konfokal mikroskopi, ER AQP4 ikke tilstede I CD63-holdige rommet (Fig. 4B), som indikerer AT CD63-indusert omfordeling til intracellulære vesikler er spesifikk for proteiner som interagerer med dette tetraspaninet.

for å undersøke mekanismene FOR CD63-mediert omfordeling Av HKß, tok vi fordel av nyere arbeid som har preget INTRACELLULÆR handel MED CD63. Rous et al. (13) demonstrert at det tyrosinbaserte motivet som er tilstede ved den ekstreme c-enden AV CD63, samhandler med adapterens underenheter μ2 og ④3. Μ 2-proteinet er medlem av det heterotetrameriske AP-2-komplekset. Dette komplekset er tilstede ved plasmamembranen og forbinder lastproteiner med clathrin-kappen, som formidler endocytosen (14). Μ 3-proteinet er medlem av det heterotetrameriske AP-3-komplekset. Dette komplekset deltar i lysosomal målretting og finnes både i trans-Golgi-nettverket og i et vesikulært rom som delvis kolokaliserer med endosomer (12). Når DET YEVM-tyrosinbaserte motivet av CD63 er mutert til AEVM, kan CD63 ikke samhandle med enten μ2 eller μ3 og primært uttrykkes på celleoverflaten (13). Når HKß er samuttrykt med DEN FLAGGMERKEDE CD63-AEVM-konstruksjonen, fordeles BÅDE CD63-AEVM og β-underenheten på celleoverflaten (Fig. 3 G-I). Dermed påvirkes Den intracellulære distribusjonen Av HKß av trafficking signaler innebygd I CD63 cytoplasmatiske halen.

når YEVM-sekvensen i halen PÅ CD63 er mutert TIL YEVI, fortsetter det modifiserte motivet å samhandle med μ3, men forbinder ikke lenger med μ 2 (13). CD63-YEVI er lokalisert primært til det sene endosomale-lysosomale rommet, mest sannsynlig fordi det endrede tetraspaninproteinet beveger seg direkte til dette rommet etter den første biosyntetiske passasjen Gjennom Golgi (13). Den lille populasjonen AV CD63-YEVI som når plasmamembranen, har nedsatt internalisering fordi den ikke lenger kan interagere med μ 2 (13). Når HKß og EN FLAGGMERKET CD63-YEVI-konstruksjon er coexpressed i COS-celler, er mye AV CD63-YEVI lokalisert til det sene endosomale-lysosomale rommet; imidlertid forblir den β-underenheten på celleoverflaten og omfordeles ikke til et intracellulært rom (Fig. 3 J-L). Coimmunoprecipitasjonsanalysen bekrefter at HKß kan assosieres med BÅDE CD63-YEVI og CD63-AEVM (data ikke vist). Disse dataene tyder på at Disse proteinene må interagere på celleoverflaten og bli endocytosert som et kompleks for At HKß skal distribueres TIL ET CD63-positivt intracellulært kompartment.

For å avgjøre om HKß påvist i intracellulære vesikler tilsvarer protein som ble endocytosed fra overflaten av cellen, observerte vi internaliseringen av β-subenheten i nærvær og fravær av eksogent CD63-uttrykk. COS-cellene ble gjennomgått med HKß og CD63-FL. Cellene ble deretter avkjølt til 4°C for å stoppe endocytose og overflate merket Med HKß mAb. De merkede cellene ble inkubert ved 37°C i 40 min for å tillate endocytose å gjenoppta. Etter inkuberingen ble cellene avkjølt til 4°C og overflate merket Med Cy5-konjugert geit anti-mus IgG. Celler ble festet og inkubert med anti-FLAGG pAb og ble deretter merket med både fluorescein isotiocyanat-konjugert geit anti-mus IgG og rhodamin-konjugert geit anti-kanin IgG. Dermed Ble HKß som ble igjen på overflaten visualisert på Cy5-kanalen, internalisert HKß ble visualisert på fluoresceinisotiocyanatkanalen, OG CD63-FL ble visualisert på rhodaminkanalen. Denne analysen viste at internalisert β-subenhet kolokaliserer MED CD63, noe som tyder på at pool Av HKß som er kolokalisert MED CD63 er avledet gjennom endocytose fra cellemembranen (Fig. 5 E-H). Celler som IKKE overuttrykker CD63, viser mye mindre internalisert β-underenhet etter en 40-min inkubasjon (Fig. 5 A-D).

for å kvantifisere internaliseringen Av HKß og verifisere videre At HKß og CD63 assosierer på overflaten av cellen, utførte vi celle-overflate biotinyleringsforsøk. I det første forsøket ble COS-celler transfisert med β-subenheten alene og biotinylert med biotin-SS-n-hydroksysuccinimidester ved 4°c. Dupliserte prøver ble deretter inkubert ved 37°C i ulike tidsrom for å tillate endocytose å gjenoppta. Cellene ble returnert til 4°C, og en plate fra hvert tidspunkt ble fjernet av gjenværende celleoverflatebitin ved eksponering For membranimpermeant reduksjonsmiddel MesNa. Cellene ble lysert og inkubert med streptavidin perler. Proteiner som er forbundet med streptavidin-perlene ble separert AV SDS / PAGE, og membranene ble undersøkt Med HKß mAb (Fig. 6A). Brøkdelen av β-underenhet på celleoverflaten endres ikke nevneverdig etter hvert som 37°c internalisering fortsetter. Etter de første 10 minuttene er en liten brøkdel av den overflatemerkede HKß sekvestrert inne i cellen, og forholdet mellom overflate og internalisert HKß forblir høyt. Disse dataene tyder på at β-underenheten som ikke er forbundet med CD63, enten internaliserer veldig sakte eller internaliseres, men resirkuleres raskt tilbake til overflaten, akkurat som transferrinreseptoren.

Vi forsøkte å karakterisere oppførselen Til HKß som forbinder MED CD63. COS-cellene ble gjennomgått med HKß og CD63-FL. Cellene ble biotinylert og strippet som beskrevet ovenfor. For å isolere populasjonen Av HKß som er forbundet MED CD63, ble cellelysatet inkubert MED FLAGG pAb og protein A-konjugerte agaroseperler. Det immunpresipiterte materialet ble eluert med en liten mengde buffer inneholdende 3% SDS, fortynnet 30 ganger med 1% Triton X-100, og inkubert med streptavidin perler. Proteiner som er forbundet med streptavidin-perlene ble separert AV SDS / PAGE og undersøkt Med HKß mAb (Fig. 6B). For celler som ikke ble utsatt for en strippingsprotokoll, representerer signalet som ble oppdaget i Denne Western blot det totale bassenget av overflatemerket β-underenhet assosiert MED CD63, inkludert komplekser som fortsatt var i plasmamembranen og komplekser som hadde blitt internalisert i vesikler. For celler som ble utsatt for en strippingsprotokoll, representerer signalet populasjonen av β-underenhet assosiert MED CD63 som var tilstede på celleoverflaten under biotinylering og ble deretter internalisert og beskyttet fra MesNa-stripen.

på 0-min-tidspunktet oppdages biotinylerte HKß lett i ANTI-FLAGGIMMUNOPRECIPITATER fra ustrippede celler, noe som viser At HKß og CD63 er i stand til å assosieres på celleoverflaten. Alle biotinylerte HKß gjenvunnet på 0-min-tidspunktet er følsomme for MesNa-stripen. Mengden CD63-assosiert, biotinylert β-underenhet beskyttet mot MesNa-reagensen øker etter hvert som cellene får inkubere til 37°C. faktisk er mengden Av HKß som er tilstede på overflaten og assosiert med CD63 ved 0 min, omtrent det samme som mengden HKß som er assosiert med CD63 og beskyttet mot stripping ved 45 min. Disse funnene tyder på at β-underenhet assosiert MED CD63 er internalisert og ikke går tilbake til celleoverflaten.