CPZ demper kolitt uavhengig AV TRPV1

for å utfordre mekanismen SOM CPZ enemas demper eksperimentell kolitt, induserte vi dekstransulfat natrium (DSS) kolitt i villtype (WT) OG TRPV1-mangelfulle mus (HVER GRUPPE N = 8). Selv om motstridende rapporter eksisterer, utviklet trpv1-mangelfulle mus dss kolitt og vekttap i samme grad som de kongeniske wt-musene i vårt laboratorium, som overholder våre resultater fra modellen AV tnbs kolitt som vi tidligere hadde publisert7,8,9,10,11,12. FOR BEHANDLING MED CPZ-klyster brukte vi den samme konsentrasjonen AV CPZ (531 µ) som tidligere ble rapportert å dempe dss (5%) kolitt i rotter8. Forløpet av kolitt ble overvåket daglig ved kroppsvektmålinger og endoskopi. TO ganger daglig BRUK AV CPZ (531 µ) enemas dempet DSS kolitt i samme grad i BÅDE WT og TRPV1 – / – mus, noe som ble reflektert av en forbedret endoskopisk score og redusert tap av kroppsvekt (Fig. 1A-C). H &e flekker fra distal kolon på slutten av 7-dagers dss-eksperimentet viste ødelagt slimhinnevevsarkitektur med mange infiltrerende immunceller i kolonene av kontroller. Dette var i sterk kontrast til en vidt intakt slimhinne og fraværet av signifikant immuncelleinfiltrasjon i kolonene AV CPZ-behandlede mus av begge genotyper(Fig. 1D). I samsvar med disse funnene ble den histologiske skåren sterkt redusert i CPZ-behandlede mus av begge genotyper (Fig. 1E).

CPZ aktiverer TRPA1

in vivo observasjon AT CPZ klyster effektivt hemmet kolitt I TRPV1 null mutant mus pålagt spørsmålet OM TRPV1-uavhengige neuronal effekter AV CPZ. SIDEN TRPA1 hadde vist seg å være avgjørende i ulike modeller av betennelse, inkludert kolitt6,12, 14, testet vi om CPZ virker PÅ TRPA1.

CPZ-induserte ioniske strømmer gjennom hTRPA1

Patch klemme eksperimenter ble utført i spenning klemme modus På HEK293t celler uttrykker rekombinante hTRPA1 (hTRPA1-HEK293t celler). VED et holdepotensial på -60 mV induserte CPZ (10 µ) en innadgående strøm som nesten var fullstendig hemmet (93% hemming, n = 5) av den selektive TRPA1-antagonisten HC-030031 (HC, 10 µ) (Fig. 2A). I alle celler der EN CPZ-indusert innadstrøm ble registrert, fremkalte carvacrol (100 µ) en etablert trpa1-agonist også store innadgående strømmer med samme holdepotensial, og demonstrerte funksjonelt uttrykk for hTRPA1. Disse htrpa1-HEK293-cellene ble også utsatt for spenningsramper fra -100 til +100 mV av 400 ms varighet hver 4. s (Fig. 2B). DET CPZ-induserte strømspenningsforholdet viste litt utadrettet utbedring og et reverseringspotensial nær 0 mV(Fig . 2C). Strømmene fremkalt av CPZ (10 µ) ble hemmet av HC (10 µ). Effekten var mer uttalt ved negative potensialer (89% ± 5% hemming ved -80 mV, gjennomsnittlig ± SD, n = 7) enn ved positive potensialer (80% ± 9% hemming ved +80 mV).

CPZ-indusert kalsium-tilstrømning gjennom hTRPA1

Selektiv VIRKNING AV CPZ PÅ TRPA1 ble bekreftet ved bruk av kalsiummikrofluorimetri teknikken. hTRPA1-HEK293-celler ble stimulert av TO ANVENDELSER AV CPZ (50 µ) i 10 sekunder ved 5-minutters intervaller (Fig. 2D). Selektive antagonister HC (20 µ) og a-967079 (10 µ) ble brukt i 1 min før og under den første CPZ-utfordringen. CPZ-responsen ble fullstendig avskaffet av begge antagonister. Det er verdt å merke seg at fjerning AV HC førte til kalsiumtilstrømning, sannsynligvis på grunn av gjenværende CPZ-virkning, mens denne effekten var fraværende I Tilfelle A-967079 som kan løsne sakte (Fig . 2D). Vi analyserte deretter konsentrasjonsavhengighet AV CPZ-effekter. Økende CPZ-konsentrasjoner (100 nM, 500 nM, 5 µ og 50 µ) ble brukt på hTRPA1-HEK293-celler i 20 sek hver med 3-minutters intervaller. Fra og med 100 nM fremkalte alle konsentrasjoner AV CPZ kalsiumtransienter med stadig større amplituder(Fig. 2E). Carvacrol (100 µ) ble brukt på slutten av forsøket for å kontrollere funksjonell TRPA1-uttrykk, men carvacrol-responsen etter 50 µ CPZ var påfallende liten, noe som tyder på kryss-desensibilisering. Ikke-overførte HEK293-celler ble utsatt for de samme CPZ-applikasjonene, og bare den høyeste konsentrasjonen som ble testet (50 µ) induserte en minimal økning i kalsium. VI forventet AT CPZ ville engasjere de tre kritiske cysteinrester i Kanalens n-terminale domene fordi det er en elektrofil forbindelse. HEK293-celler som uttrykte WT hTRPA1 og celler som uttrykte den trippelcysteinmutante hTRPA1 – 3c (C621S, C641S, C665S) ble utsatt for CPZ-applikasjon (1@M, 20 s) etterfulgt av den ikke-elektrofile agonisten carvacrol (100 µ, 20 s) og den svært elektrofile AITC (50 µ, 30 s). Ionomycin ble brukt på slutten av forsøket som en positiv kontroll. Amplituden til kalsium forbigående fremkalt av 1 µ CPC ble betydelig redusert (>80%) i celler som uttrykker hTRPA1-3c sammenlignet med celler som uttrykker WT hTRPA1 (Fig . 2F), mens forskjellen I CPZ-følsomhet mellom genotypene ble avskaffet ved 100 µ CPZ-konsentrasjon (Fig. 2G). Aitc-responsen ble redusert i mutantcellene, mens carvacrol fremkalte store kalsiumiontransienter i BÅDE WT-og 3c-mutanter. Samlet sett indikerer disse celleresponsene at DEN relativt høye styrken AV CPZ avhenger av de tre kritiske cysteinene. Men når KONSENTRASJONEN AV CPZ er 100 ganger høyere, overtar andre bindingssteder aktiveringen av hTRPA1. Denne høye konsentrasjonen av den lipofile CPZ kan også interagere med den cellulære lipidmembranen, indirekte aktiverende TRPA1, som tidligere vist for lipid a-komponenten av lipopolysakkarider16. I nærvær Av elektrofilt åtseldyr N-acetylcystein (NAC) ved en mettende konsentrasjon (15 mM) var det dessuten ikke mulig å fremkalle noen respons på 50 µ CPZ. VED fjerning AV NAC fremkalte CPZ store kalsiumtransienter i Htrpa1-transfekterte HEK293t-celler (Fig. 2H) som bekrefter AT CPZ fungerer som en elektrofil agonist for hTRPA1.

CPZ aktiverer en subpopulasjon AV AITC-sensitive dorsal root ganglion (DRG) nevroner

DRG nevroner ble opprettholdt i primær kultur og undersøkt av kalsium mikrofluorimetri. Cellene ble stimulert av CPZ (50 µ, 20 s), etterfulgt av AITC (100 µ, 30 s), capsaicin (CAP, 1 µ, 10 s) og KCl (60 mM, 30 s). Figur 3A illustrerer eksempler PÅ DRG-nevroner som reagerer på alle disse fire stimuli. En typisk fraksjon AV drg-nevroner ble aktivert AV AITC (301 av 906 nevroner, 33%, n = 8 mus) som indikerer funksjonelt uttrykk FOR TRPA1. En subpopulasjon av disse aitc-sensitive nevronene ble også aktivert AV CPZ (185 av 301 nevroner, 61%). Følsomheten for CPZ var nesten helt begrenset TIL AITC-responsive nevroner. Av totalt 200 CPZ-sensitive nevroner ble 185 (93%) også aktivert AV AITC, noe som indikerer en sterk sammenheng mellom følsomhet OVERFOR CPZ og AITC (Fig. 3). Som for HTRPA1-uttrykte HEK293-celler var kalsiumtransientene fremkalt AV CPZ i DRG-nevroner konsentrasjonsavhengige med EN EC50-verdi estimert til 30 µ CPZ og den lille aitc-responsen etter 100 µ CPZ igjen foreslått kryss-desensibilisering (Fig . 3B, C). Figur 3D viser overlappingen AV CPZ, CAP og AITC-respons i WT DRG-nevroner ved gitte konsentrasjoner: 14% AV DRG-nevronene reagerte PÅ AITC, men ikke PÅ CAP (125/906), 16% reagerte PÅ CAP, men IKKE PÅ AITC, mens CPZ induserte kalsiumtransienter i 78% av nevronene som reagerte på BÅDE aitc og CAP (137 av 176). FOR å demonstrere spesifisiteten av de observerte effektene ble trpv1−/− og TRPA1−/ – DRG-nevroner utsatt for ovennevnte protokoll. Omtrent 90% AV DE TRPV1-mangelfulle drg-nevronene som VAR aitc-sensitive responderte også PÅ CPZ (509/572 celler), mens ingen av de 448 TRPA1-mangelfulle DRG-nevronene som ble testet viste kalsiumtilstrømning som respons PÅ CPZ (100 µ) som illustrert av representative eksempler I Fig. 3E, F.

siden gjentatte klyster er en ubehagelig administrasjonsvei, testet vi for en mulig anti-nociceptiv effekt av peroral CPZ (531 µ) i drikkevannet. Drikkeregimet over 10 dager ble godt tolerert uten åpenbare bivirkninger. I løpet av kontinuerlig oral CPZ-administrasjon økte paw-abstinensforsinkelsen til strålevarme stimulering (hargreaves-metoden) gradvis i begge bakpaws (Fig . 4E). Toleransetiden var omtrent doblet på dag 7 og forble signifikant forhøyet fra dag 2 til 10. Etter 2 uker med utvinning med rent drikkevann, tilbaketrekning ventetid hadde returnert til baseline nivå. Den mekaniske respons til stimulering med lineært økende kraft av en elektrodynamisk von Frey filament ble ikke signifikant påvirket i løpet av de ti dagene AV CPZ drikking (Fig. 4F). Spørsmålet oppstod om varmen og kjemisk hypoalgesi representerte en klasseeffekt av desensibiliserende trpa1-agonister eller om den var spesifikk for CPZ. DERFOR administrerte VI AITC i en tilsvarende og godt tolerert konsentrasjon (500 µ) via drikkevannet. Det samme doseringsregimet for AITC som beskrevet for CPZ resulterte i en progressiv økning av paw-abstinensforsinkelse til strålevarme stimulering som var signifikant mindre enn DET som ble indusert AV CPZ (Fig. 4E). Mekanisk respons ble ikke endret under aitc drikking regime (Fig. 4F).

CPZ forårsaker vedvarende desensibilisering AV TRPA1 / TRPV1 som uttrykker peptidergiske sensoriske nevroner

Vi spurte spørsmålet om desensibiliseringen av HELE dyr VED CPZ kunne reproduseres på mobilnivå. Til dette formål utførte vi kalsiumbildningsforsøk med isolerte DRG-nevroner som var oppnådd fra kontrollmus og fra dyr behandlet i 7 dager to ganger daglig med CPZ-enemas. Disse nevronene ble nødvendigvis holdt i kultur for 16 til 24 h, i nærvær AV NGF. Totalt 399 nevroner fra kontrollmus og 584 nevroner fra enema-behandlede mus ble lastet med Fura-2 og kalsiumtransienter fremkalt av AITC, carvacrol, CAP og En kcl-rik løsning ble registrert. Responsen på disse TRPA1-agonistene (AITC og carvacrol) og TRPV1-agonistene (CAP) var ikke signifikant forskjellig I drg-nevroner fra kontrolldyr og klyster-behandlede dyr (Fig. S1). TRPA1 mRNA-uttrykk (qPCR) var imidlertid omtrent to ganger oppregulert i lumbosakral DRG tilberedt umiddelbart etter den endelige CPZ-enema (Fig. S2) mens ingen endring I TRPA1-uttrykk ble påvist når 24 timer hadde gått in vivo etter siste enema. TRPV1 mRNA endret seg ikke under begge omstendigheter. Dermed hadde transkripsjonell oppregulering AV TRPA1 – genuttrykket funnet sted, på grunn av de flere CPZ-enemasene, men ble raskt reversert da CPZ-forsyningen ble avviklet. UNDER drg dyrkingsforhold hadde den samme epigenetiske reverseringen sannsynligvis funnet sted, og all gjenværende CPZ ble sannsynligvis utvasket, slik at ingen gjenværende desensibilisering faktisk kunne forventes. Da de cellulære modellene ikke reflekterte den utdaterte CPZ-induserte desensibiliseringen av hele dyrene in vivo, så vi etter en annen sterk indikator på den overraskende systemiske effekten. Flertallet av nociceptive nevroner er peptidergic, som uttrykker overveiende kalsitonin genrelatert peptid (CGRP) og substans P (SP)15,17. Ved depolarisering, som Ved KCl og kalsiumtilstrømning, på grunn av aktivering av spenningsstyrte kalsiumkanaler, frigjøres disse neuropeptidene fra nervefibrene i en kvasi-efferent funksjon (nevrogen betennelse). På den annen side er aktiverte TRP-kanaler meget gode kalsiumledere av seg selv og krever ikke støtte av spenningsstyrte natrium – eller kalsiumkanaler for å fremkalle vesikulær eksocytose AV CGRP18. Dermed kan stimulert frigjøring AV CGRP tjene som en indeks for (peptidergisk) nociceptor-aktivering. På samme måte har vasoaktive nevropeptider forskjellige effekter på betennelsesprosessen i seg selv, og uttømming eller desensibilisering av den peptidergiske sensoriske neuronpopulasjonen har vist seg å dempe kolitt19, 20, 21. For å avgjøre OM CPZ (531 µ) enemas desensibiliserer gjennom TRPA1, lokalt og systematisk, brukte vi isolerte musekolon og hudpreparater. Kolon med friske C57BL / 6 mus (n = 8)ble eksponert FOR CPZ (100 µ) som induserte massiv cgrp-frigivelse (Fig. 5); etterfølgende anvendelser AV AITC (100 µ) 5 min eller 15 min etter CPZ (Fig . 5A, B) kunne ikke lenger indusere cgrp-frigjøring, noe som tyder på en dyp akutt funksjonell kryss-desensibilisering TIL TRPA1-agonisten. Denne effekten kan ikke skyldes uttømming, da den påfølgende kcl (60 mM) responsen var normal. Kolon fra mus som gjentatte ganger hadde blitt behandlet med CPZ (531 µ) klyster in vivo, to ganger daglig i 7 d ble isolert og testet 12-16 timer etter siste klyster. VERKEN CPZ (100 µ) eller AITC (100 µ) induserte NOEN cgrp-utgivelse i denne tilstanden(Fig . 5C,D); SPESIELT CAP (30 nM)-indusert cgrp-frigjøring ble sterkt redusert, Men ikke avskaffet (Fig. 5E). I motsetning Til Dette ble KCl (60 mM)-indusert cgrp-frigjøring ved uspesifikk depolarisering ikke bare unreduced, men faktisk forbedret etter CPZ-enemasene. Dette indikerte at de koloniske nervefibrene ikke var tømt FOR CGRP, men heller overfylt, men likevel i det vesentlige desensibilisert på en vedvarende måte til kjemisk aktivering GJENNOM TRPA1 og TRPV1 (n = 6). Endelig viste også hudpreparatet, isolert 12-16 timer etter siste CPZ-klyster, at AITC (100 µ) og CAP (1 µ)-indusert CGRP-frigivelse ble sterkt redusert i samsvar med den generelle desensibiliseringen observert i atferdstestene (Fig . 5F, G, Se Fig. 4A-F) (n = 6).