Abstract

en direkte og svært spesifikk kjemiluminescerende enzymbundet immunosorbentanalyse (CL-ELISA) metode for overvåking av kloramfenikol (CAP) i kosmetikk er utviklet. Antikloramfenikolantistoffet (mab) som ble brukt i dette arbeidet for direkte immunoassay, kunne binde SEG til CAP spesifikt, med ubetydelig kryssreaktivitet (CR) (mindre enn 0,01%) med DE fleste CAP-analoger, inkludert strukturelt relatert tiamfenikol (TAP) og florfenikol (ff). Grensen for deteksjon (LOD), målt VED IC10, var 0,0021 ng mL-1. Deteksjonsområdet (IC20-IC80) varierte fra 0,00979 til 0,12026 ng mL−1. I piggete kosmetikkprøver varierte gjennomsnittlig utvinning fra 82,7% til 99,6%, med intradag og interday variasjon mindre enn henholdsvis 9,8 og 8,2%. Videre, ved HJELP AV HRP-merket anti-CAP mAb, kunne metoden behandles i rask direkte immunoreaksjonsmodus. DENNE CL-ELISA-metoden kan brukes for spesifikk, rask, semiquantitativ og kvantitativ påvisning AV CAP i kosmetikk, noe som letter nøyaktig kvalitetskontroll av CAP-forurensning.

1. Innledning

Kloramfenikol (CAP) er medlem av amphenicol-familien av antibakterielle midler, og de ble produsert Av Venezuelanske streptokokker (struktur vist I Figur 1) . Kloramfenikol utføres vanligvis som et bredspektret antibiotika med effektiv antimikrobiell aktivitet. Det kan vanligvis være mot et spredt utvalg Av Gram-positive og Gram-negative bakterier, inkludert de anaerobe organismer . På grunn av den høye aktiviteten er kloramfenikol mye brukt i husdyr, akvatisk og kosmetikkindustri for forebygging og behandling av bakteriell infeksjon. I nyere publikasjoner ble kloramfenikol rapportert å bli brukt til behandling av epifollikulitt, akne og annen hudtilstand. Kloramfenikol ble også utbredt i kosmetikk som et antiseptisk middel for å hemme veksten av mikroorganismer .

nylige undersøkelser viste imidlertid at amphenikol antibiotika viste potensielle bivirkninger for menneskers helse . Derfor er bruken av kloramfenikol forbudt i MANGE land, inkludert EU-medlemmer, USA og Kina . Selv om det er offisielle regler for disse antibiotika, er kloramfenikol fortsatt ulovlig lagt til kosmetikk, på grunn av sin lave kostnad og gode antibakterielle effekt. For å sikre kosmetikkens sikkerhet og holde menneskers helse, er det fremvoksende å utvikle følsomme, pålitelige og tilgjengelige metoder for kloramfenikoldeteksjon ved sporingsnivåer i kosmetikkprøver.DET ble rapportert mange analysemetoder for CAP og relatert antibiotikadeteksjon, som høyytelses væskekromatografi (HPLC), gasskromatografi (GC) og væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) . Imidlertid krever disse metodene hovedsakelig dyre instrumenter, kompliserte forbehandlingsprosedyrer og velutdannede staber, og de var ikke egnet for rask screening av stort antall prøver. Immunoassays hovedsakelig basert på antistoff-antigen spesifikk anerkjennelse ble vedtatt for høy gjennomstrømning og rask screening av målanalytter. Kjemiluminescerende substrat med høy følsomhet kan brukes i en direkte kjemiluminescerende enzymbundet immunosorbentanalyseplattform (CL-ELISA). Sammenlignet med konvensjonelle kolorimetriske protokoller, kan følsomheten til immunoassays forbedres med minst 2~3 ganger med kjemiluminescerende som substrat.

Tidligere litteratur om immunoassay deteksjon AV CAP kan ikke skille CAP fra sine analoger av amphenicol familien (Figur 1), inkludert tiamfenikol (TAP) og florfenikol (ff), på grunn av høy-bred spesifikke antistoffer . I disse undersøkelsene, er det vanskelig å avgjøre om forurensning CAP, dets analoger, eller summen av dem når et positivt resultat. I denne undersøkelsen brukte vi et høyspesifikt anti-CAP monoklonalt antistoff (mAb) som kan binde SEG TIL CAP-spesifisitet og ubetydelige CR-verdier for de fleste testede analoger. På grunnlag av denne svært mAb ble det utviklet en svært spesifikk OG direkte CL-ELISA-metode for bestemmelse av spormengder AV CAP i kosmetikk. Denne utviklede protokollen trenger ikke kompleks indirekte konjugeringsreaksjon med hrp-merket sekundært antistoff. Med kjemiluminescerende substrat kan følsomheten forbedres betydelig (skjematisk diagram vist i Figur 2). VED BRUK AV HRP-merket anti-CAP mAb ble analysen utført i rask direkte immunoreaksjonsmodus uten komplekse immunoreaksjonsprosedyrer. DENNE CL-ELISA-metoden kan brukes for spesifikk, rask, semiquantitativ og kvantitativ deteksjon AV CAP i kosmetikk, og dette arbeidet vil bidra til kvalitetskontroll og regulering AV CAP.

2. Materialer og Metoder

2.1. Kjemikalier og Reagenser

Kloramfenikol (CAP), ciprofloxacin (CIP), florfenikol, (FF), penicillin (PEN), ractopamin (RAC), salbutamol (SAL), sulfadiazin (SUL) og tiamfenikol (TAP) standarder ble kjøpt Fra Sigma Aldrich (99% purity, St. Louis, MO, USA). CAP-konjugert antigen og HRP-merket CAP antistoff ble oppnådd Fra ZeYang Co. (Beijing, Kina). SuperSignal chemiluminescence substrat løsning ble kjøpt fra Thermo Fisher (USA). Milli-Q Syntese system ble oppnådd Fra Millipore (Bedford, MA, USA) for vannrensing. Andre reagenser (analytisk karakter) ble kjøpt Fra Beijing Reagent Corp. (Beijing, Kina).

2.2. Utstyr og Instrumentering

Costar hvit ugjennomsiktig 96-brønn polystyren mikrotiter plater (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) ble brukt i dette arbeidet. SpectraMax m5 mikroplate leser ble oppnådd Fra Molekylære Enheter(CA, USA). MIKRO 22r sentrifuge ble hentet fra Hettich Laborapparate (Tuttlingen, Tyskland).

2.3. Buffere og Løsninger

for denne utviklede cl-ELISA-analysen ble forskjellige buffere og løsninger forberedt for immunoassay.Fosfatbuffer saltvann (PBS, 0,01 m, pH 7,4): 8,0 g NaCl, 2,9 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4 og 0,2 g KCl ble oppløst i 1 L avionisert vann.

Blokkeringsbuffer (pH 7,4): 0,5% kasein i 0,01 M PBS.

Overflatebehandlingsbuffer (pH 9,6) : 1,59 G Na2CO3 og 2,93 g NaHCO3 ble oppløst i 1 L avionisert vann.

enzym fortynningsbuffer (pH 7,4): 5% føtalt bovint serum i 0,01 M PBS.

Vaskebuffer (PBST): 0,01% Tween-20 i 0,01 M PBS.

2.4. Konkurransedyktig Chemiluminescent ELISA (CL-ELISA) Prosedyre

Costar hvit ugjennomsiktig 96-brønn polystyren mikrotiter plater ble vedtatt for immunoassay reaksjon. 100 µ AV CAP-konjugert antigen ble oppløst i overflatebehandlingsbuffer ved en endelig konsentrasjon ved 0,00042 ng mL-1 som ble tilsatt og inkubert ved 4°C i 20 timer for overflatebehandling. Etter vask med vaskebuffer i tre ganger ble blokkeringsbuffer (150 µ per brønn) tilsatt til hver brønn og inkubert for å oppta overskytende aktive steder ved 37°C for 1,5 h. de belagte platene ble lagret ved 4°C før bruk.

FOR CAP-analyse ble de belagte mikrotiterplatene forhåndsbestemt ved romtemperatur i 30 min. Deretter ble 30 µ av behandlede prøver eller CAP-standard og 70 µ AV HRP-merket anti−CAP-antistoff (2,46 ng mL-1) fortynnet med enzymfortynningsbuffer tilsatt hver brønn etter tur. Platene ble inkubert ved 37°C i 30 min for direkte konkurransereaksjon. Etter vasking av platen med vaskebuffer i fem ganger ble SuperSignal kjemiluminescenssubstratløsning (100 µ/brønn) tilsatt og kjemiluminescensintensiteten til hver brønn ble målt med En SpectraMax m5 mikroplateleser.

2.5. Standardkurve

Ti forskjellige konsentrasjonsnivåer ble testet for evaluering av kalibreringskurver. Den høyeste konsentrasjonen var ved 1000 ng mL-1, og følgende konsentrasjoner ble serielt fortynnet med en tredjedel av den forrige. Hver konsentrasjon ble kjørt i tre ganger i HENHOLD TIL CL-ELISA-protokollen.

B / B0 er definert for kjemiluminescensforholdet til resultatene. Her Står B For kjemiluminescensintensiteten til forskjellige CAP standardkonsentrasjoner, Og B0 står for kjemiluminescensintensitet uten CAP standard i hver test.Standardkurver ble evaluert ved å plotte B / B0 ved forskjellig CAP standardkonsentrasjon og tilpasse dataene til Følgende fire-parameter logistisk ligning ved Hjelp Av Origin (versjon 7.5, OriginLab, Northampton, MA, USA): I denne ligningen står A for den øvre asymptoten (kjemiluminescensforhold B/B0 uten CAP standard). B er skråningen av kurven ved bøyningspunktet. C, som representerer 50% av maksimal absorbans, Er x-verdien ved bøyningspunktet. D er den nedre asymptoten (bakgrunnssignalet).

2.6. Prøvepreparering for CL-ELISA Analyse

Kosmetikkprøver (2,00 g ± 0,02 g) ble veiet nøyaktig og overført til 50 mL polypropylensentrifugerør. Deretter ble 20 mL PBS tilsatt og vortexed i 30 s, og deretter ultra-sonikering i 3 min for utvinning AV CAP. Hver prøve ble sentrifugert ved 12000 g til 10 min ved 4°C, og supernatanten ble oppsamlet og filtrert gjennom en 0.22 µ membran. Tretti mikroliter aliquots av supernatanten av hver prøve ble tilsatt til en belagt 96-brønnplate for analyse i henhold til den utviklede CL-ELISA-prosedyren.

2,7. Nøyaktighet og Presisjon

Negative primer lotion kosmetikk prøver ble tidligere bekreftet AV UPLC-MS / MS analyser. Deretter ble hver prøve spiked MED CAP standard ved tre forskjellige konsentrasjoner av 5, 20 Og 100 ng L-1. Analysen ble behandlet i henhold til DEN utviklede CL-ELISA-protokollen med fem replikater hver (n = 5). Konsentrasjonene av prøver ble beregnet i henhold til kalibreringskurven, og nøyaktigheten og presisjonen ble vurdert på grunnlag av gjenvinning av alle prøvene.

3. Resultater og Diskusjon

3.1. Analysespesifisitet

spesifisiteten til metoden ble vurdert ved å evaluere omfanget av kryssreaktivitet (CR) med strukturelt relaterte forbindelser AV CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL og TAP. CR-verdiene ble evaluert med følgende ligning:I DENNE ligningen ER IC50 den halve maksimale hemmende konsentrasjonen av et stoff. Spesifisitet resultatene av anti-CAP mAb ble vist I Tabell 1. Fra resultatene ble ubetydelige CR-verdier (mindre enn 0,01%) oppnådd for alle analogene undersøkt i denne undersøkelsen, inkludert de mest strukturrelaterte TAP og FF. Det kan konkluderes med at denne utviklede cl-ELISA-analysen kunne brukes til spesifikk CAP-deteksjon.

3.2. Optimalisering AV CL-ELISA-Prosedyren

antigen til antistoffforholdet i et konkurransedyktig reaksjonssystem påvirker immunoreaksjonen betydelig. I DENNE cl-ELISA-protokollen ble forholdet mellom antigen og antistoff evaluert og optimalisert. Antigen til antistoffforhold av 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, og 30: 70 ble undersøkt. Resultatene ble optimalisert I HENHOLD TIL IC50 og rlumax (maximum relative light units) og vist I Tabell 2. IC50-verdien økte betydelig med økende antistoffforhold. Når antigen til antistoffforholdet var 70: 30, ble det mest sensitive resultatet med den laveste IC50-verdien oppnådd. I tillegg førte en høy andel antistoff til en høy rlumax-verdi. For de testede antigen-til-antistoffforholdene var imidlertid alle rlu-verdiene egnet for påvisning AV CAP. På grunn av den høye sensitiviteten til kjemiluminescerende substrat, var det ingen tilsynelatende forskjell I rlumax-verdi. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.

3.3. Følsomhet

IC50, LOD (målt VED IC10) og deteksjonsområdet (IC20−IC80) ble oppnådd fra sigmoidal kalibreringskurve for å evaluere følsomheten til den foreslåtte CL-ELISA-protokollen (Figur 3). I denne undersøkelsen var LOD 0,0021 ng mL-1 mens IC50-verdien var 0,016 ng mL-1 FOR CAP. Deteksjonsområdet for denne metoden var 0,00979-0,12026 ng mL-1. Sammenlignet med etablerte immunoassays, viste denne metoden høyere følsomhet og lavere LOD for CAP .

3.4. Nøyaktighet og Presisjon

for nøyaktighet og presisjon undersøkelse, inngang AV CAP i befestede prøver ble beregnet først. Og nøyaktigheten og presisjonen ble evaluert med fem replikater hver på tre valideringsdager. På tre forsterkede nivå av 5, 20 og 100 ng L−1 varierte gjennomsnittlig gjenoppretting for CAP i spiked primer lotion kosmetikk prøver fra 82.7% til 99.6%. Intradag-og interdagvariasjon var henholdsvis mindre enn 9,8% og 8,2% (resultatene ble vist I Tabell 3).

4. Konklusjoner

i denne undersøkelsen ble det utviklet en ny OG svært sensitiv CL-ELISA-metode for CAP-deteksjon i kosmetikk. MAb benyttes i analysen viste høy spesifisitet TIL CAP med ubetydelig CR verdier til sine analoger, spesielt for de fleste struktur relatert TRYKK og FF. På grunnlag av denne meget mAb kunne den foreslåtte CL-ELISA-metoden brukes til påvisning av CAP spesifikt i stedet for blandinger AV CAP og andre analoger. Dette er den første rapporten FRA EN CL-ELISA for bestemmelse AV CAP i kosmetikk. METODEN LOD var 0,0021 ng mL-1, IC50 var 0,016 ng mL-1, og deteksjonsområdet var 0,00979-0,12026 ng mL-1. I piggete kosmetikkprøver varierte gjennomsnittlig utvinning fra 82,7% til 99,6%, med henholdsvis intradag-og interdagvariasjon mindre enn 9,8% og 8,2%. Analysen gir fordelene med høy spesifisitet, enkelhet, raske analysetider og kostnadseffektivitet. Med hensyn til sensitivitet og spesifisitet er DEN utviklede CL-ELISA-metoden bedre enn de fleste rapporterte immunoassays for CAP-deteksjon. Det kan konkluderes med at denne utviklede CL-ELISA-metoden kan brukes for spesifikk, rask, semiquantitativ og kvantitativ påvisning AV CAP i kosmetikk.

Datatilgjengelighet

dataene som brukes til å støtte funnene i denne studien, er tilgjengelige fra den tilsvarende forfatteren på forespørsel.

Interessekonflikter

forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter angående publisering av dette papiret.

Takk

Vi vil gjerne takke LetPub (www.letpub.com) for å gi språklig hjelp under utarbeidelsen av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet Av Det Nasjonale R & D-Nøkkelprogrammet I Kina (nr. 2017yfe0110800), National Natural Science Foundation Of China (nr. 31871718) og EU Horizon 2020 Research And Innovation action (nr. 727864-EU-China-Safe).