Resultater
Identifikasjon AV IL-7 Reseptor α Kjede (CD127) som Markør For Minne-T-Celler. Mens vi søkte etter nye markører for å definere effektor-Og minne-t-celle-undergrupper i musen, analyserte vi overflateuttrykk AV IL-7-reseptor α-kjeden / CD127(Fig . 1a). Under primær respons På Lm kan forskjellige subpopulasjoner av antigen-spesifikke milt-cellepopulasjoner skilles ut basert PÅ CD127-uttrykksnivåer. CD127 lavuttrykkende celler (CD127low) dominerer i den akutte effektorfasen. Under overgangen til minne t-cellefasen forsvinner Imidlertid Cd127lave celler gradvis, mens populasjoner som uttrykker høye nivåer (CD127high) forblir bemerkelsesverdig stabile i størrelse over tid (Fig. 1 a og c ). Disse distinkte kinetiske verdiene tyder sterkt PÅ AT CD127-uttrykk er en selektiv egenskap for T-celler med lang levetid. Under effektorfasen migrerer CD127low CD8+ T-celler fortrinnsvis til ikke-lymfoide organer, mens Bare CD127high CD8 + T-celler oppdages I LN (Fig . 1b). Milten representerer et «mellomorgan» hvor alle forskjellige subpopulasjoner er funnet tidlig etter immunisering (22, 23). Senere i minnefasen karakteriseres antigen-spesifikke T-celler i alle organer Av En Cd127høy fenotype (Fig. 1 b og c ). Sammenligning av Egenskapene Til CD127low Og CD127high antigen-spesifikke T-celler for å proliferere som respons på stimulering viste slående forskjeller mellom de to undergruppene. Som vist I Fig. 1d, renset Listeria-spesifikke Cd127høye T-celler prolifererer raskt etter ANTI-CD3-stimulering, Mens CD127low T-celler prolifererer dårlig. Det er usannsynlig at disse forskjellene i proliferasjon reflekterer en fordel VED CD127-positive celler Gjennom Ab-mediert IL-7R-stimulering fordi forskjellige mAb-kloner med kjent CD127-aktiverende eller blokkerende aktivitet viste samme effekt i kortsiktige in vitro-stimuleringstester (data ikke vist).
CD127 (IL-7R) overflateuttrykk som markør for minne T-celler. (a) en kohort AV BALB/c-mus ble infisert med en sublethal dose (≈0.1 × LD50) AV WT Lm, etterfulgt av sekundær infeksjon (≈10 × LD50) 5 wk senere. Representative punktplott av splenocytter (gated på levende CD8+ t-celler) farget Med H2–Kd/ LLO91-99 tetramere (y-akse) og FOR CD127 overflateuttrykk (x-akse) vises for de angitte tidspunktene under primær (Øvre) og tilbakekallings (Nedre) responser. (B) Lymfocytter fra forskjellige organer ble isolert under primær effektor (7 dager etter infeksjon) og minne (35 dager etter infeksjon) faser. Representative histogrammer er gated PÅ CD8 + og H2–Kd/ LLO91-99 tetramer-positive celler og viser CD127 flekker (åpen) og unstained kontroller (fylt). (c) Kinetikk av de absolutte tallene (y-aksen) AV CD127 høy (fylt) og lav (åpen)-uttrykker CD8 + Og H2-Kd / LLO91-99 tetramer-positive celler; seks individuelle mus per tidspunkt. (d) CD127 HØY-OG lavuttrykkende CD8+, H2-Kd / LLO91-99 multimer-positive celler ble sortert direkte ex vivo 10 dager etter Listeriainfeksjon. Spredning av karboksyfluorescein succinimidylester-merkede celler ble analysert etter anti-CD3 stimulering; CD127high (fet linje) eller CD127low (tynn linje) celler.
For mer direkte å demonstrere at T-celler med lang levetid utelukkende er tilstede i CD127 high expressing-rommet tidlig etter in vivo-priming, utførte vi adoptivoverføringsstudier ved å bruke en nylig utviklet reversibel MHC multimer-fargingsteknikk (21) for å funksjonelt isolere antigen-spesifikke T-celler direkte ex vivo. Etter adoptiv overføring Av CD127high LLO91-99-spesifikke T-celler fra mus infisert i 10 dager med Lm, var de overførte cellene fortsatt detekterbare flere uker senere i milten av naive mottakermus (Fig. 2a), mens celle tallene etter overføring Av Cd127lave celler var på deteksjonsgrensen. Denne observasjonen var ikke på grunn av forskjeller i in vivo migrasjon av overførte CD127 høy og CD127low celler, fordi vi fant lignende forskjeller for lungen(Fig . 2a) og andre organer (LN og lever, data ikke vist). For ytterligere å støtte tolkningen at CD127high T-celler utelukkende opprettholder antigen-spesifikke minneceller, ble mottakermus utfordret etter adoptivoverføring med Listeriainfeksjon. Igjen, bare hos mus som hadde fått CD127high T-celler før infeksjon var rask utvidelse av overførte LLO91-99-spesifikke T-celler detekterbare (Fig. 2b). Igjen var dette resultatet ikke på grunn av forskjeller i migrasjon fordi vedlikehold eller utvidelse av overførte CD127low T-celler ikke kunne påvises i noe annet organ (Fig. 2b og data ikke vist). Selv om disse resultatene fra adoptivoverføringsstudier sterkt støtter hypotesen om at T-celler med lang levetid utelukkende er tilstede I CD127high T – cellekammeret, observerte vi også betydelige begrensninger av denne eksperimentelle tilnærmingen. Spesielt synes minne-t-celler med umiddelbar effektorfunksjon å være ganske følsomme for adoptivoverføringsforsøk og dø raskt etter rensing og iv-applikasjon; selv om de overlever i måneder til år hvis de blir uberørt in vivo (11). Således, selv om våre resultater fra adoptivoverføring er i samsvar med tolkningen at CD127 er en markør For T-celler med lang levetid, kan vi ikke utelukke at iboende problemer med overlevelse av forskjellige t-celledelpopulasjoner også bidrar til utfallet av disse forsøkene.
Costaining Av Antigen-Spesifikke T-Cellepopulasjoner MED CD127 Og CD62L Tillater Diskriminering Mellom Minne T-Celle Subpopulasjoner. Videre karakterisering Av CD127high t-cellepopulasjonen viste at den kan deles inn i subpopulasjoner som uttrykker høye OG lave NIVÅER AV CD62L(Fig . 3). Direkte ex vivo-funksjonsanalyse (21) av rensede t-celler (10-12 dager etter infeksjon, når alle subpopulasjoner samtidig kan påvises i milten) avdekket ytterligere funksjonelle forskjeller. Mens CD62Llow t-celledelmengder viser kraftig og umiddelbar ex vivo cytolytisk aktivitet, Viser CD127high / CD62Lhigh T-celler svært dårlig lys av peptidbelagte målceller (Fig. 3). Intracellulær cytokin-farging av sorterte underpopulasjoner viste At CD127high/CD62Llow T-celler, som CD127low/CD62Llow-undergruppen, produserer effektor cytokiner INF-γ og tumor nekrosefaktor α; I motsetning produserer CD127high / CD62Lhigh-undergruppen IL-2, MEN ikke IFN-γ og tumor nekrosefaktor α. Således muliggjør markørkombinasjonen AV CD127 og CD62L identifisering Av T-celledelpopulasjoner med egenskaper som er svært lik de som tidligere er beskrevet hos mennesker. CD127low / CD62Llow t-celler viser alle kjente egenskaper ved en reell effektor t-cellepopulasjon (TE, dårlig proliferativ aktivitet, begrenset in vivo overlevelse og umiddelbar effektorfunksjon). Cd127high / CD62Lhigh-delsettet samsvarer med egenskapene TIL TCM, Og CD127high / CD62Llow T-cellene passer til beskrivelsen av TEM.
CD127 / CD62L dobbeltfarging skiller mellom forskjellige CD8 + T-celleundergrupper; lignende resultater kan bli funnet hos mennesker. Dobbel farging AV CD8+, H2-Kd / LLO91-99 multimer-positive celler for overflateuttrykk AV CD62L (y-akse) og CD127 (x-akse) etter infeksjon Med Lm; relative prosenter av subpopulasjoner i kvadranter er indikert. CD127low/CD62Llow, CD127high/CD62Llow og CD127high / CD62Lhigh subpopulasjoner ble sortert direkte ex vivo 12 dager etter Listeriainfeksjon og overført til forskjellige funksjonelle analyser. Cytolytisk aktivitet ble vurdert etter inkubasjon av sorterte celler i nærvær av målceller og LLO91-99 peptid (kvadrater) eller ingen peptid (sirkler). Intracellulær cytokin-farging av EX vivo-sorterte LLO91-99-spesifikke subpopulasjoner (som angitt ovenfor) ble utført FOR IL-2 (Øverst), IFN–γ (Midt) og tumornekrosefaktor α (Nederst) etter kort in vitro restimulering med LLO91-99 peptid (svarte områder; hvite områder representerer ustimulerte kontroller); prosenter av cytokinpositive celler er indisert.
Generering Av Distinkte Minne T Celle Subpopulasjoner Avhenger AV CD40L-Mediert T Celle Hjelp. Fordi vi følte at det kan være problematisk å utelukkende basere tolkningen AT CD127 uttrykk kan brukes som en markør for å skille mellom effektor Og lang-levende minne T-celler på adoptiv celle overføring eksperimenter, bestemte vi oss for å analysere mus mutant linjer med defekter I generering Av t-celle minne. HVIS CD127 faktisk er en «tidlig» minne t-cellemarkør, bør vi kunne identifisere forskjeller under tidlige og sene tidspunkter innenfor CD127-positive delmengder hos mus med minnefeil.Fordi nyere studier viste betydningen Av t-cellehjelp for generering av langvarige minnesresponser (2-4), bestemte vi oss for å avgjøre om tilstedeværelsen ELLER fraværet AV CD4+ t-cellehjelp under CD8+ T-celleprimering fører til forskjeller i antigenspesifikke t-cellesammensetninger oppdaget i tidlig posteffektorfase. MHC II-mangelfulle mus, som mangler konvensjonelle CD4 + T-celler, har en defekt CD8 + minnerespons, og kvaliteten på beskyttelsen minker over tid (2-4). Farging For T-celle subpopulasjoner 10 dager etter primær infeksjon viste At CD127high / CD62Llow undergruppe er nesten helt fraværende I MHC II – / – mus (Fig. 4a ); de andre subpopulasjonene er tilstede ved frekvenser som ligner DE I WT C57BL / 6 mus. Disse dataene viser at fraværet Av t-cellehjelp forhindrer effektiv generering av En t-celledelmengde med en effektorminnefenotype, som synes å være avgjørende for rask in vivo-utvidelse og effektorfunksjon.
Redusert Generasjon Av T-Celleundergrupper Med En Effektorminnefenotype Tidlig Etter Priming Overføres Til Sent Minne T – Cellepool. Våre data viser at i fravær AV CD4 + T-celler ELLER CD40L, Er CD127high/CD62Llow T-celledelen betydelig redusert tidlig etter priming. Videre har Vi (Fig. 4b) og andre (3-5) viste at svekket t-cellehjelp under t-celleprimering fører til endringer i kvaliteten på beskyttende immunitet mot reinfeksjon Med Lm eller lymfocytisk choriomeningittvirus. For å tydeligere knytte den observerte defekten i tidlig generasjon CD127high / CD62Llow T-celler med kvaliteten på etterfølgende t-celleminne i disse musene, analyserte vi antigen-spesifikke t-cellepopulasjoner i minnefasen (5 uker etter primær Listeriainfeksjon) mer detaljert. På dette tidspunktet må analyse av antigen-spesifikke T-celler utføres på celler avledet fra forskjellige vev på grunn av deres distinkte migrerende oppførsel. I tillegg til milten valgte VI LN som et representativt vev for lymfoide organer og lungen som et typisk perifert, ikke-lymfoidrom. På dette tidspunktet er de antigen-spesifikke t-cellene i disse organene nesten Alle CD127high(Fig. 1b); cellene i lungen Er CD62Llow (data ikke vist), mens de fleste antigen-spesifikke minne T-celler I LN Er CD62Lhigh (Fig. 5b). For å bestemme antall antigen – spesifikke minne-t-celler med klar umiddelbar effektorfunksjon i de forskjellige organene, utførte vi intracellulær cytokin-farging FOR IFN-γ. Som vist I Fig. 5A, CD40L – / – mus er preget av betydelig redusert antall antigen-spesifikke minne T-celler med umiddelbar effektor funksjon sammenlignet MED WT mus. Dette resultatet er sant på nivået av frekvenser (prosent) I CD8 + t-cellekammeret og i absolutte tall(Fig. 5a). IMIDLERTID MHC tetramer farging AV ln-avledede lymfocytter (Fig. 5b) viste nesten identiske antall antigen-spesifikke t-celler Med En Cd62lhøy fenotype. Noen CD62Llow antigen-spesifikke T-celler kan også påvises i LNs HOS WT-mus, korrelerer med frekvensene AV IFN-γ-produserende celler (Fig. 5a). Denne populasjonen er i utgangspunktet fraværende i LNS AV CD40L–/– mus; HELE CD8+/ CD62Llow– undergruppen er redusert I CD40L–/ – mus, noe som tyder på en generell defekt i genereringen av DENNE t-celledelen. Oppsummert viser våre data at fraværet AV CD40L-avhengig CD4 + T-cellehjelp i løpet av priming-perioden resulterer i kvantitative forskjeller i antigen-spesifikk CD8 + T – celledelpopulasjoner, med sterkt redusert antall celler som viser en effektorminnefenotype (CD127high/CD62Llow). Disse kvantitative forskjellene i celler med umiddelbar tidlig effektorfunksjon overføres til minnefasen og påvirker kvaliteten på beskyttende immunitet.
CD40L-avhengige endringer i t-celleundergrupper tidlig etter t-celleprimering overføres til det etterfølgende minnet T – cellepool. (A) Lymfocytter ble isolert fra lunger, milt og LN avledet FRA WT BALB / c-mus eller CD40L – / – 35 dager etter primær infeksjon Med Lm (0,1 × LD50). Intracellulær IFN-γ-farging ble utført etter kort in vitro restimulering i NÆRVÆR AV LLO91-99 peptid for å identifisere T-celler med umiddelbar effektorfunksjon. Punktplott viser representative resultater for ulike organer( som angitt); tall angir de totale frekvensene AV IFN-γ-produserende celler. Den første raden med stolpediagrammer oppsummerer dataene for frekvenser AV IFN-γ-produserende, LLO91–99-spesifikke T-celler innenfor CD8+-rommet; raden med stolpediagrammer til høyre oppsummerer dataene for absolutte tall FOR IFN–γ-produserende, LLO91-99-spesifikke T-celler i forskjellige organer . (b) ln-celler ble tatt 35 dager etter primær infeksjon som beskrevet i a; LLO91-99-spesifikke T-celler ble detektert VED MHC multimer-farging (dot plot, y-akse) sammen med costaining FOR CD8 og CD62L (dot plot, x-akse) overflateuttrykk. Representative dot tomter vises for celler gated PÅ CD8 + T-celler; frekvenser innenfor hver kvadrant er angitt. Søylediagram til venstre oppsummerer data for frekvenser AV MHCS multimer-og CD62L-positive t-celler i CD8 + – rommet; raden med søylediagram til høyre oppsummerer dataene for absolutte tall FOR LLO91-99 / H2-Kd multimer-positive T-celler I LN (CD40L – / – (fylt) og WT BALB / c (åpen); n = 3 per gruppe).
