Tilberedning av proteinkomponenter for rekonstituering

Komponenter I e. coli oversettelsesapparat, inkludert oversettelsesfaktorer og aaRS, ble utarbeidet som tidligere beskrevet46. Fremstilling Av rnasep-komponenter, M1 RNA og c5-protein ble også fremstilt som beskrevet tidligere29. Vi endret protokollen For c5-proteinet ved å utfelle det med 80% mettet ammoniumsulfat, og oppløse det ved å dialyzing mot buffer A (50 mm natriumacetat pH 6,5, 5 mM EDTA, 0,25 M NaCl og 7 mM 2-merkaptoetanol). Det resulterende bunnfallet ble gjenvunnet ved sentrifugering og oppløst ved dialysering mot buffer B bestående av 50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 Mm NH4Cl, 6 m urea Og 10 mM dithiothreitol (DTT). Oppløste proteiner ble påført på En 5 mL HiTrap SP HP kolonne (#17115101, GE Healthcare, USA), vasket med buffer B inneholdende 7 mM 2-merkaptoetanol som erstatning for 10 mM DTT, og eluert med en lineær gradient fra 100 mM Til 2 M NH4Cl i buffer B. Fraksjoner inneholdende c5 protein ble analysert VED SDS-PAGE, gjenvunnet, dialysert mot buffer D (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 0,8 M NH4Cl, 10 mM mgcl2, 2 m urea, 7 Mm 2-MERKAPTOETANOL), deretter videre dialysert MOT BUFFER D uten UREA. Resulterende løsninger ble konsentrert ved Hjelp Av En Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) og dialysert mot buffer D uten urea inneholdende 50% glyserol. Det rensede c5-proteinet ble lagret ved -30 °C. vi merker oss at vi kan dele alle plasmider på forespørsler.

Fremstilling av modifiseringsenzymer for ivttrna

Modifiseringsenzymer for ivttrna ble fremstilt som følger. E. coli-gener Av TsaB, TsaC, TsaD, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE og GidA ble forsterket fra e. coli A19-genom ved hjelp av passende primere (Supplerende Data 5). Forsterkede gener For TsaC, TsaD, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE og GidA ble klonet til pET15b (#69661, Merck Millipore, USA) som små ubiquitin-lignende modifier (SUMO) protein-fusjonsproteiner hvor His-tag, SUMO protein, OG modifikasjon enzymer ble tandemly arrangert. Gener For TsaB og TrmD ble klonet i pET15b som His-tag fusion protein. Alle gener ble klonet Med Gibson monteringsteknikk (#E2611, New England Biolabs, USA). Resulterende plasmider ble omdannet Til en e. coli BL21(DE3) stamme og dyrket i 1 L LB medium TIL EN OD660 på 0,6–1,0 ved 37 °C. Overuttrykk ble indusert ved tilsetning av IPTG til en endelig konsentrasjon på 1 mM For TsaB, TsaC, TsaD, TsaE og TrmD, eller 0,1 mM For GlyA, MnmC, MnmE og GidA. Etter 3 h dyrking ved 37°C ble celler høstet. Tsab -, TsaC -, TsaE -, TrmD-og MnmE-overuttrykkede celler ble resuspendert i 40 mL Lysisbuffer (50 Mm Hepes-KOH, pH 7,6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2 og 7 mM 2-merkaptoetanol) og forstyrret ved sonikering. Resulterende lysat ble sentrifugert og supernatanten ble gjenvunnet og blandet med 5 mL komplett His-tag Renseharpiks (#05893801001, Roche, Sveits) i 1 time med rotator. Harpiksen ble vasket med 100 mL Lysisbuffer og deretter ble proteinet eluert med 25 mL Elueringsbuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl2, 400 mM imidazol og 7 mM 2-merkaptoetanol). TsaB og TrmD ble konsentrert Av Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA)og deretter dialysert mot Lager buffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6500 mM KCl, 10 mM MgCl2, 7 mM 2-merkaptoetanol og 30% glyserol). De ble flashfrosset med flytende nitrogen og lagret ved -80°C. For TsaC, TsaE Og MnmE ble Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) tilsatt til de gjenvunnede fraksjonene til en endelig konsentrasjon på 23 µ / ml for å fjerne DET HIS-merkede SUMO-proteinet. Fraksjonene ble dialysert mot Spaltingsbuffer (50 Mm Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl og 7 mM 2-merkaptoetanol) over natten, mens Spaltingsbufferen inneholdt 500 mM KCl for MnmE-preparering. De dialyserte prøvene ble igjen blandet med 5 mL fullstendig His-tag Renseharpiks med rotator. Deretter ble gjennomstrømmingsfraksjonene som inneholder modifikasjonsenzymer samlet. Gjenvunnet prøver ble konsentrert Av Amicon Ultra 3 kDa For TsaE Eller Amicon Ultra 10 Kda (#UFC901024, Merck Millipore, USA) For TsaC og MnmE. De ble dialysert mot Lagerbuffer, flashfrosset med flytende nitrogen og lagret ved -80 °C. for GlyA-preparering inneholdt all buffer 10% Glyserol og de andre prosedyrene var de samme Som MnmE-preparering. TsaD ble funnet å være uoppløselig etter sonikering. Proteinet ble derfor pelletert ved sentrifugering ved 20 400 × g ved 4 °C i 45 min og resuspendert i Lysebuffer supplert med 4% Triton X-100. Suspensjonen ble igjen pelletert ved sentrifugering ved 20.400 × g i 45 min. Pelleten ble oppløst Med Lysisbuffer supplert med 6 m urea. Den andre prosedyren var den samme Som MnmE-preparatet, bortsett fra at alle buffere inneholdt 2 m urea. For MnmC forberedelse, alle trinn til fjerning Av HANS-merket SUMO protein var samme Som GlyA forberedelse. Fordi MnmC uspesifikt bundet Til His-tag rensing harpiks, rensing med anion-utveksling kromatografi ble valgt. Oppløsningen etter Ulp1-behandling ble dialysert mot IEX-buffer (50 Mm Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2 og 7 mM 2-merkaptoetanol) og deretter påført På En 5 mL HiTrap Q HP-kolonne (#17115401, GE Healthcare, USA). Kolonnen ble vasket med 25 mL IEX buffer og Deretter MnmC ble eluert med en liner gradient fra 100 mM til 1 M KCl I IEX buffer. Fraksjoner som inneholdt MnmC ble konsentrert Av Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, USA), dialysert mot Lagerbuffer, flashfrosset med flytende nitrogen og lagret på -80°C. vi merker oss at vi kan dele alle plasmider på forespørsler.

Fremstilling av iVTtRNA

Gener for hver iVTtRNA (Tilleggsdata 1) ble klonet i pgemex-1-vektoren (#p2211, Promega, USA) mellom XbaI-og BamHI-restriksjonssteder. VED hjelp av de resulterende plasmider som maler, DNA maler for in vitro transkripsjon BLE PCR-forsterket ved Hjelp Av En T7 promoter primer som forward primer og passende revers primere for hver iVTtRNA (Supplerende Data 1). Hver omvendt primer inneholdt en 2 ‘- metoksy modifikasjon ved det andre nukleotid fra 5 ‘ – terminus for å forhindre maluavhengig tilsetning av et ekstra nukleotid28. Produktene ble renset ved fenol / kloroform / isoamylalkohol (25:24:1) ekstraksjon, etterfulgt av etanolutfelling, og utfellingsmidler ble oppløst i vann. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). Rnase p-komponenter sammensatt Av C5-protein og M1-RNA ble deretter tilsatt til reaksjonsblandinger ved 150 nM for fjerning av de 27 ekstra nukleotidene, og reaksjoner ble inkubert i 1 time ved 37 °c. Transkribert ivttrna ble deretter behandlet med sur fenolekstraksjon etterfulgt av kloroform / isoamylalkohol (10:1) ekstraksjon, deretter rensing ved anionbytterkromatografi. Prøver som inneholdt ivttrna ble lastet på 10 mL HiTrap Q HP kolonner (#17115401, GE Healthcare, USA) og vasket Med Q buffer (20 mM HEPES-KOH pH 7,6 og 200 mM KCl). ivttrna ble eluert med en lineær gradient fra 200 mM til 1 M KCl I Q buffer. Fraksjoner som inneholdt mål-ivttrna, bestemt av urea-SIDE, ble gjenfunnet ved isopropanolutfelling, og utfelte ivttrna ble oppløst i vann og lagret ved -80°C til bruk. Vi merker oss at vi kan dele alle plasmider på forespørsler.

Modifikasjon av iVTtRNA

t6a37 modifikasjon ble utført i reaksjonsblandingen inneholdende 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM pyridoxal-5′-fosfat, 1 mM Ser, 1 mM Gly, 36.4 µM SAM, 0.1 enhet/µL rekombinant RNase-hemmer (#2313 En, TaKaRa, Japan), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2.5 µM MnmC, 6 A260 enhet/mL tRNAGluUUC eller tRNAGluCUC. Etter inkubasjon ved 37°C i 2 timer for t6a37 og m1g37 modifikasjon eller 4 timer for mnm5U34 modifikasjon, ble trna behandlet med sur fenol ekstraksjon etterfulgt av kloroform / isoamylalkohol (10: 1) ekstraksjon og gjenvunnet ved isopropanolutfelling. Utfelte trnaer ble oppløst i vann og lagret ved -80 °C. For mnm5U34 modifikasjon ble reaksjonen igjen utført med gjenvunnet trna. De ble behandlet med sur fenolekstraksjon etterfulgt av kloroform / isoamylalkohol (10:1) ekstraksjon, desaltet Av MicroSpin G-25 Kolonner (#27532501, GE Healthcare, USA), og gjenvunnet av isopropanolutfelling. Utfelte trnaer ble oppløst i vann og lagret ved -80 °C. for å kvantifisere modifikasjonseffektiviteten ble 57.1 µ thr brukt i stedet for 1 mM Thr og blandingen Uten TsaD ble brukt som kontroll for t6a37 modifikasjon. 36.4 µ s–adenosyl-Metionin ble brukt og blandingen uten TrmD ble brukt som kontroll for m1G modifikasjon og Uten GidA ble brukt som kontroll for mnm5U34 modifikasjon. Etter inkubasjon ved 37 °C ble alikvoter (10 µ) trukket tilbake og oppdaget På Whatman 25 mm GF/C filterdisker (#1822-025, GE Healthcare, USA). Filterskiver ble vasket to ganger med 10% TCA, deretter etanol, etterfulgt av måling av radioaktivitet ved en flytende scintillasjonsteller. For kvantifisering av mnm5U modifikasjon, tRNAs ble renset som ovenfor, og deretter 0,02 a260 enhet ble oppdaget på filterdiskene i stedet.

Aminoacylering

aminoacyleringsforsøk ble utført i henhold til en tidligere rapport47. Reaksjonsblandinger (10 µ) inneholdt 100 MM HEPES-KOH pH 7,6, 15 mM MGCL2, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mM ATP, 1 enhet/µ REKOMBINANT rnasehemmer (#2313 A, TaKaRa, Japan), 50 nM eller 1,5 µ aaRS tilsvarende hver aminosyre, 20 µ-aminosyre eller 68 µ Asn for asparaginaminoacylering og 2 A260 enhet/mL tRNA. For måling av metylering ble det brukt en blanding av 0.6 µ Met og 3.4 µ kald L-metionin. Cys ble oppnådd ved å redusere-cystin med 50 mM DTT ved 37 °C i 15 min. FOR måling av cysteinylering var DTT-konsentrasjonen 5 mM. når innfødte trna-blandinger ble brukt, ble 40 a260 enhet/mL tRNA-blandinger (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) tilsatt i stedet. Etter inkubasjon ved 37°C i 30 min ble alikvoter (8 µ) trukket tilbake og oppdaget På Whatman 25 mm GF/C filterdisker (#1822-025, GE Healthcare, USA). Filterskiver ble vasket to ganger med 10% TCA, deretter med etanol, etterfulgt av måling av radioaktivitet ved en flytende scintillasjonsteller.

Oktapeptidsyntese med PURE-systemet

DNA-maler som koder for oktapeptider, BLE PCR-forsterket med passende primere (Supplerende Data 2) ved bruk av pURE1-vektoren (#PUREV001, BioComber, Japan) som inneholdt En t7-promoter-sekvens og ribosombindingsstedet (Shine-Dalgarno-sekvens) som en mal. Forsterkede DNA-maler ble renset ved Hjelp Av Et QIAQUICK PCR-rensesett (#28104, QIAGEN, Tyskland). Oktapeptidsyntesereaksjoner inneholdt 50 mM HEPES-KOH pH 7.6 100 mm kaliumglutamat, 13 mm magnesiumacetat, 2 mM spermidin, 1 mM DTT, 2 MM ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP, 20 mM kreatinfosfat, 10 µ/mL 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolsyre, 0,2 µ ribosom, 4 nM DNA-mal, proteinholdige rene systemkomponenter inkludert oversettelsesfaktorer og enzymer, aminosyrer og trna. Konsentrasjonene av proteinholdige RENE systemkomponenter var som beskrevet i en tidligere protokoll46. Vi merker oss at alle 20 aaRSs ble inkludert i dette eksperimentet, uavhengig AV DNA-maler og testkodoner. Sammensetningen og konsentrasjonen av aminosyrer, som avhenger av testkodonene, er oppført i Tilleggsdata 2. Sammensetningen av ivttrna avhenger av malen, og reaksjoner ble utført ved bruk av basal ivttrna (Tilleggsdata 2) i nærvær eller fravær av test ivttrna (Tilleggsdata 2). Konsentrasjonen av hver iVTtRNA var fast til 6 µ Når innfødte trna-blandinger ble brukt, ble 56 a260 enhet/mL trna-blandinger (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) tilsatt i stedet. Reaksjoner ble utført i 60 min ved 37 °C og alikvoter ble trukket tilbake, oppdaget På Whatman 3 MM filterpapir (#1822-025, GE Healthcare, USA), kokt i 10% TCA ved 90 °C i 30 min til deacylataminoacyl-Rna. Radioaktiviteten i 10% tca-uoppløselig fraksjon ble målt med en flytende scintillasjonsteller.

Proteinsyntese MED PURE-systemet

proteinsynteseforsøk ble utført Med Et PUREfrex 2.0-sett (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japan) uten tRNA-blandinger I Løsning I (Bufferblanding). Vi har i tillegg lagt til 0.2 µ Oppfylt, 4 nM PCR-forsterket DNA-mal for DHFR – eller sfGFP-uttrykk (Tilleggsdata 3), og en spesifisert mengde iVTtRNA-blanding eller innfødt tRNA-blanding. Reaksjoner ble utført ved 30 Eller 37 °C i 12 timer, og syntetiserte proteiner ble analysert.

Analyse av syntetiserte proteiner

Syntetisert DHFR og sfGFP inneholdende radioaktivt Met ble analysert ved 15% SDS-SIDE, og gelbildet ble visualisert ved HJELP AV EN bas-5000 bio-imaging analyzer (GE Healthcare, USA). Time-course analyse av sfGFP uttrykk ble utført ved å måle sfGFP fluorescens hver 3 min ved Hjelp Av En StepOne qRT-PCR system (#4376373, Applied Biosystems, USA). Fluorescensbilder av syntetisert sfGFP i reaksjonsblandinger ble oppnådd ved BRUK AV ET LAS-4000-instrument (GE Healthcare, USA). AKTIVITETEN til syntetisert DHFR ble målt som beskrevet tidligere44. Reaksjonsblandinger (2 mL) inneholdt 50 MM MES-KOH pH 7,0, 25 mM TRIS-HCl pH 7,0, 25 mM etanolamin, 100 mM NaCl, 10 mM 2-merkaptoetanol, 0.1 mM EDTA, 100 µ dihydrofolsyre og en 10 µ av DEN RENE reaksjonsblandingen, og de ble inkubert til 37°C i 15 min. DERETTER ble 20 MM NADPH tilsatt til en endelig konsentrasjon på 200 µ, og reduksjonen i absorbans ved 340 nm ble målt over en periode på 10 min med Et v-550 spektrofotometer (Jasco, Japan). EN ENHET DHFR ble definert som mengden enzym som kreves for å behandle 1 µ dihydrofolsyre i 1 min ved 37 °C.

LC-MS analyse av syntetiserte proteiner

DHFR med FLAGGSEKVENS ved dens endepunkt (Tilleggsdata 3) ble syntetisert Med En PUREfrex 2.0 kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japan) uten tRNA-blandinger I Løsning I (Bufferblanding). Vi i tillegg lagt 4 nM PCR-forsterket DNA mal FOR DHFR merket MED FLAGG sekvens på Sin C-terminus (Supplerende Data 3) og en spesifisert mengde iVTtRNA blanding eller native tRNA blanding. Reaksjoner ble utført ved 30 °C i 12 timer. Syntetisert DHFR ble renset Med Anti-FLAGG M2 Magnetiske Perler (#M8823, Sigma-Aldrich, USA). Alikvoter (55 µ) av reaksjonsblandingene ble blandet med 245 µ AV FLAGGVASKEBUFFEREN (50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM NaCl, 20 Mm Mg(OAc)2), og videre blandet med 30 µ perler i 1 t. perlene ble vasket med 210 µ AV FLAGGVASKEBUFFEREN etterfulgt av vasking med bufferen uten Mg (OAc)2 to ganger (210 µ og 180 µ). DERETTER BLE DHFR eluert med 50 µ AV FLAGGVASKEBUFFEREN uten Mg (OAc) 2, men supplert med 100 µ/mL 3xflag peptid (#f4799, Sigma-aldrich, USA) etter forsiktig blanding i 1 time. Klargjøring av prøver for LC-MS-analyse ble utført i henhold til en phase transfer surfactant (pts)-støttet protokoll48. 4 µ av en tett PTS-buffer (100 mM natriumdeoksykolat, 100 mM natrium N-lauroylsarkosinat og 500 MM NH4HCO3) ble tilsatt til 40 µ av de eluerte prøvene. De ble redusert med 10 mM TCEP ved 37 °C i 30 min, alkylert med 20 mM jodacetamid ved 37 °C i 30 Min, og slukket med 20 mM Cys. Hver reaksjonsløsning ble delt inn i to deler. En ble fordøyd av 10 ng / µ Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) og 10 ng/µ trypsin (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) ved 37 °c over natten. Den andre ble fordøyd av 10 ng / µ Asp-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA)ved 37 °. Etter fordøyelsen ble 10% trifluoreddiksyre (TFA) tilsatt til en endelig konsentrasjon på 1%, og reaksjonsløsningene ble sentrifugert ved 15 000 × g i 5 min for å utfelle vaskemidler. Supernatanter ble avsaltet ved hjelp av selvforberedte trinntips49 og tørket Med SpeedVac. LC-MS analysen ble utført ved Hjelp Av Et Orbitrap massespektrometer (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, USA) utstyrt med en nanospray ion kilde (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, USA) og et nano-LC system (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA). De tørkede peptidblandingene ble oppløst i en oppløsning inneholdende 5% acetonitril og 0,1% TFA, og hver prøve ble påført nano-LC-systemet. Peptider ble konsentrert ved hjelp av en fellekolonne (#164535, 0.075 × 20 mm, 3 µ, Anerkjennelse PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA) og deretter separert ved hjelp av en nano kapillær kolonne (#NTCC-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 µ, C18, Nikkyo Technos, Japan) ved bruk av to mobile faser A (0,1% maursyre) og b (acetonitril og 0,1% maursyre) med en gradient (5% B for 5 min, 5-45% B på 45 min, 45-90% B på 1 min og 90% B på 4 min) med en strømningshastighet på 500 nL/min. Eluering ble direkte elektrosprayed (2.2 kV)I MS (positiv modus, skanneområde på 200-1500 m / z, 60.000 FWHM oppløsning) 50.