Abstrakt

HIV-1-transkripsjon reguleres AV CDK9 / cyclin T1, som, i motsetning til en typisk cellesyklusavhengig kinase, reguleres ved å assosiere MED 7SK lite nukleært ribonukleært proteinkompleks (snRNP). Mens proteinkomponentene i dette komplekset er godt studert, er mekanismen for den komplekse formasjonen fortsatt ikke fullt ut forstått. Foreningen AV CDK9 / cyclin T1 MED 7SK snRNP er delvis regulert av en reversibel CDK9 fosforylering. Her presenterer vi en omfattende gjennomgang av kinaser og fosfataser involvert I CDK9 fosforylering og diskutere deres rolle i regulering AV HIV – 1 replikasjon og potensial for å bli målrettet for narkotikautvikling. Vi foreslår en ny vei FOR HIV – 1 transkripsjon regulering via CDK9 Ser-90 fosforylering AV CDK2 OG CDK9 Ser-175 defosforylering av protein fosfatase-1.

1. Innledning

Fullstendig utryddelse av HIV-1-infeksjon krever nye tilnærminger for å indusere integrert HIV – 1 provirus som ikke påvirkes av eksisterende antiretrovirale legemidler, og som kommer tilbake ved avslutning av antiretroviral behandling . HIV – 1 latens kan være et resultat av flere faktorer som mangel PÅ HIV-1 transcriptional activator protein (Tat) eller cellulære transkripsjonelle aktivatorer, transkripsjonell interferens med cellulære promotorer, ugunstig integrasjonssted, epigenetikk og sannsynlige andre faktorer . Dermed, bedre forståelse av mekanismene FOR HIV – 1 transkripsjon aktivering er viktig for utformingen av romanen therapeutics rettet mot induksjon samt hemming AV HIV – 1 transkripsjon. Her vurderer vi kinaser og fosfataser involvert I aktivering AV CDK9 / cyclin T1 og diskuterer hvordan disse enzymene potensielt kan brukes til å hemme ELLER aktivere HIV-1 for utvikling av fremtidige terapeutiske inngrep for behandling AV HIV-1-infeksjoner.

2. Aktivering AV HIV-1 Transkripsjon Av P-TEFb

HIV-1 transkripsjon aktiveres AV HIV-1 Tat protein som binder SEG TIL bule AV TJÆRE RNA, en hårnål-loop struktur som ligger på 5 ‘ – enden av alle begynnende HIV-1 transkripsjoner, og rekrutterer CDK9 / cyclin T1, en komponent av positiv transkripsjon forlengelse faktor b (P-TEFb) TIL HIV-1 promoter (anmeldt i detalj i ; se også illustrasjon I Figur 1). UNDER transkripsjonsstart ble TFIIH-assosiert CDK7/cyklin H fosforylater Ser-5 innen 1ysptsps7 heptapeptidsekvensen gjentatt 52 ganger i DET C-terminale domenet (CTD) FOR RNAPII . Ser-5 fosforylert RNAPII akkumuleres ved 20-40 nukleotider (nt) nedstrøms transkripsjonsstartstedet, delvis på grunn av handlingene til det negative virkende forlengelsesfaktorkomplekset, NELF og det DRB-følsomhetsinducerende komplekset, DSIF . NYLIG TFIIH-assosiert CDK7 ble vist å fosforylere OGSÅ CTD Ser-7 rester, som kan prime Ser – 2 fosforylering Av P-TEFb . Rekruttering Av P-TEFb TIL HIV – 1-promotoren lokalisert innenfor U3-R-U5-regionen i 5 ‘ LTR tilrettelegges av Tat som retter SEG MOT CDK9 / cyclin T1 TIL TAR RNA hvor cyclin T1 binder seg Til G-rik sløyfe AV TAR RNA . Rekruttering AV CDK9 / cyclin T1 fremmer transkripsjonsforlengelse av RNA polymerase II (RNAPII) som ellers er pauset etter syntesen AV TJÆRE RNA . Utgivelse AV RNAPII fra pause Ved p-TEFb-komplekset er ledsaget av mRNA-capping og tap AV NELF . P-TEFb utløser forlengelse AV rna-polymerase II (RNAPII) transkripsjon ved fosforylering av den negative forlengelsesfaktoren (NELF) og drb-følsomhetsinducerende komplekset (DSIF/Spt4/Spt5), og dermed fremme frigjøring AV NELF og også fosforylerende ser-2 rester I RNAPII CTD (omtalt i ). Ved dissosiasjon AV NELF, dsif blir en positiv forlengelse faktor og økt prosessivitet RNAPII . Selv Om P-TEFb reiser med forlengelseskomplekset, ER CTD-kinaseaktiviteten ikke lenger nødvendig når komplekset frigjøres fra pause .

på grunn Av betydningen Av P-TEFb, regulering må opprettholdes for å sikre riktig funksjon. Fosforylering og defosforylering av spesifikke steder PÅ CDK9 må forekomme gjennom hele transkripsjonsprosessen og må kontrolleres nøye. Denne gjennomgangen fokuserer på regulering AV CDK9 gjennom fosforylering modifikasjoner.

3. Sammensetning Av P-TEFb og Dens Rolle i HIV-1 Transkripsjon Aktivering

P-TEFb Er en heterodimer bestående av cyklin-avhengig kinase 9 (CDK9) og En av c-type cykliner T1, T2a eller T2b hvorav cyklin T1 er den mest tallrike partner . Cyclin K som opprinnelig ble antatt å være EN mindre cyclin AV CDK9 er nå anerkjent for Å være en cyclin partner FOR CDK12 OG CDK13 . Bare cyclin T1 protein danner effektivt et kompleks MED HIV-1 Tat bundet TIL TJÆRE RNA . Dette skyldes tilstedeværelsen av en cysteinrest i cyklin T1 i posisjon 261 i stedet for et asparagin som finnes i cyklin T2a-og T2b-proteiner. Cyclin T1 med mutert Cys-261 binder Seg til Tat, men er ikke i stand til å rekruttere Tat TIL TAR RNA. Interaksjon Av Tat MED TJÆRE RNA og cyclin T1 er avhengig av sinkioner som igjen krever tilstedeværelse Av Cys-261 .DET er to funksjonelle isoformer AV CDK9: en 42 kDa-form hovedsakelig uttrykt i milt, tymus og testis og en 55 kDa-form som uttrykkes i forskjellige vev, men på betydelig lavere nivåer som er 42 Kd-isoformen . Alle cykliner assosieres med begge isoformene AV CDK9 og viser kinaseaktivitet mot CTD i RNAPII . Omtrent halvparten av P-TEFb er i et inaktivt stort kompleks bundet AV 7sk snRNA og flere ekstra proteiner, inkludert hexametylene bisacetamide-inducerbart protein 1 (HEXIM1), La-relatert LARP7 protein og metylfosfatase capping enzym MePCE . Den lavere molekylvektformen Av P-TEFb består AV CDK9 Og cyclin T1 og er enzymatisk aktiv . Den høye molekylvekten P-TEFb er inaktiv på grunn AV HEXIM1 som introduserer sin hemmende PYNTESEKVENS i DET aktive STEDET FOR CDK9 .P-tefb-komplekset med høy molekylvekt tjener som KILDE TIL CDK9 / cyclin T1 for rekruttering AV HIV-1 Tat . I stressinduserte celler dissosierer CDK9/cyclin T1-komplekset fra 7 SK RNA/HEXIM1-proteinet og binder DERETTER BRD4 og danner et transkripsjonelt aktivt lite kompleks som rekrutteres til forskjellige cellulære promotorer . Til tross for inaktiviteten til stort P-TEFb-kompleks in vitro, er det store komplekset, og ikke det lille komplekset, viktig for aktivering AV hiv-1 transkripsjon SOM HIV-1. Tat konkurrerer MED HEXIM1 for binding til cyclin T1 fremme dissosiasjon Av P-TEFb fra det store komplekset . HIV – 1 Tat protein ble også vist å rekruttere store p-TEFb kompleks TIL HIV – 1 promoter HVOR TAR RNA var i stand til å fortrenge 7 SK RNA og aktivere P-TEFb .

Tat letter også dannelsen av superforlengelseskompleks (SEC) som inneholder aktive p-TEFb og ytterligere forlengelsesfaktorer og transkripsjonskoaktivatorer . DISSE faktorene inkluderer AFF4, ENL, AF9 OG forlengelsesfaktor ELL2 . AFF4-proteinet fremstår som det sentrale stillaset som rekrutterer andre faktorer gjennom direkte interaksjoner. AFF4 binder cyclin T1, ELL2 og ENL ELLER AF9 som fungerer som en bro som forbinder dette komplekset Til P-TEFb . Gjennom brofunksjonene Til TAT OG AFF4 kombineres P-TEFb OG ELL2 for å danne et bifunksjonelt forlengelseskompleks som i stor grad aktiverer HIV – 1 transkripsjon . UTEN Tat KAN AFF4 formidle ELL2-P-TEFb-interaksjonen, om enn ineffektivt. Tat overvinner denne begrensningen ved å bringe MER ELL2 Til P-TEFb og stabilisere ELL2 i en prosess som krever aktiv p-TEFb .

4. CDK9 Fosforylering

Aktivitet Av P-TEFb er avhengig av fosforylering av flere serin-og treoninrester, og vi vil diskutere dette nedenfor og som er vist I CDK9 / cyclin T1 / Tat-modellen I Figur 2.

4.1. C-Terminal Cdk9 Fosforylering

en klynge AV CDK9S C-terminale rester (Ser-347, Ser-353 og Ser-357; Thr-350 Og Thr-354) er autofosforylert, og denne fosforyleringen er viktig for bindingen AV CDK9/cyclin T1 TIL TAR RNA . Dette ble påvist ved manglende evne til enzymatisk aktiv C-terminalt avkortet CDK9 til å binde TJÆRE RNA . Rekombinant CDK9 / cyklin T1 som ble autofosforylert in vitro, ble effektivt dephoshorylert av proteinfosfatase 2a (PP2A), men ikke proteinfosfatase-1 (PP1). OGSÅ behandling MED PP2A forhindret binding AV CDK9 / cyklin T1 til Tat og TAR RNA in vitro . Disse observasjonene antydet AT PP2A kan målrette C-terminus AV CDK9 og potensielt kontrollere samspillet Mellom P-TEFb og TAR RNA. Autofosforylering AV CDK9 assosiert med preinitiasjonskomplekset in vitro ble hemmet av TFIIH . PP2A ble senere funnet å være avgjørende for basal HIV-1 transkripsjon in vitro, SOM PP2A depletion hemmet basal HIV-1 transkripsjon og add-back AV PP2A til utarmet ekstrakter restaurert transkripsjon . PP2A-målet ble antatt Å Være Thr – 29 (se nedenfor), men dette ble ikke bevist med sikkerhet og effekten ble ikke gjengitt in vivo. I en tidlig studie observerte vi en mild induksjon av basal, men ikke Tat-indusert HIV-1-transkripsjon av PP2A-hemmende lave konsentrasjoner av okadainsyre . Vi observerte også induksjon av basal og ikke Tat-aktivert HIV-1 transkripsjon med OVERUTTRYKK AV LIS1 protein som vi fant å binde OG hemme PP2A in vitro og interagere med HIV-1 Tat protein . Samlet indikerer disse studiene AT PP2A kan regulere BASAL hiv-1 transkripsjon og også kontrollere interaksjonen Av P-TEFb med TJÆRE RNA ved defosforylering C-terminus AV CDK9.

4.2. N-Terminal Thr-29 Fosforylering

Fosforylering AV CDK9S Thr-29 ble vist å være indusert AV HTLV – 1 Skatteprotein . CDK9 / cyclin T1 rekrutteres TIL kromatinisert HIV-1 LTR og andre promotorer AV BRD4 . Denne BRD4 rekruttering var knyttet til fosforylering AV CDK9 Thr-29 og kravet OM PP2A defosforylering Av John Bradys gruppe . Qiang Zhous gruppe rapporterte imidlertid AT CDK9 er nødvendig for å bli fosforylert på Ser-175 for å binde SEG TIL BRD4, som nylig ble bekreftet Av Jonathan Karns gruppe(se detaljert diskusjon nedenfor). CDK9S Thr – 29 er homolog Til Thr-15 PÅ CDK2, hvor fosforylering hemmer CDK2-aktivitet . Faktisk ble fosforylering Av Thr-29 vist å hemme CDK9-aktivitet og HIV – 1-transkripsjon . Imidlertid klarte vi ikke å oppdage CDK9 Thr – 29 fosforylering i celler behandlet med okadaic acid som hemmet BÅDE PP2A og PP1 ved hjelp Av En kombinasjon Av Hunter 2d tynt lag elektroforese og høyoppløselig massespektrometri som bare viste fosforylering Av C-terminal Ser/Thr-klynge og Ser-175 hvorav Bare Ser-175 fosforylering ble indusert av okadaic acid . DERMED KAN CDK9 Thr – 29 fosforylering ikke kontrolleres AV PP2A og må videre valideres for å klargjøre sin rolle under HIV-1 transkripsjon.

4.3. CDK9S T-Loop Thr-186 Fosforylering

CDK9 T loop inneholder flere fosforyleringssteder, inkludert Ser-175 Og Thr-186 (Figur 2). Fosforylering av den konserverte Thr-186 er nødvendig FOR DEN enzymatiske aktiviteten TIL CDK9 . Også foreningen AV CDK9 / cyclin T1 med 7SK RNA snRNP krever CDK9S Thr – 186 fosforylering . I CDKs utløser fosforylering Av T-sløyfen store konformasjonsendringer som åpner ATP-bindingslomme og et substratbindingssted som gjør CDKs fullt aktiv som en kinase .nylig viste kjemisk-genetisk analyse ved bruk av selektiv kjemisk hemming AV CDK7 at DEN alene er ansvarlig for CDK9 Thr-186 fosforylering og For P-tefb-avhengig CTD Ser-2 fosforylering og histon H2B ubiquitylering in vivo . SÅLEDES, CDK7 / cyclin H som tidligere ble identifisert SOM CDK-aktivering kinase (CAK) For Cdk involvert i cellesyklusen SOM CDK1, 2, og 4 fungerer også SOM CAK for Cdk involvert i regulering av transkripsjon som inkluderer CDK8, 9, 12, og 13 (anmeldt i ). Global analyse av kinaser som kan fosforylere CDK9 T-loop ved hjelp av siRNA identifisert Ca (2+) / calmodulin-avhengig kinase 1d (CaMK1D) slå ned ved siRNA redusert thr-186 fosforylering . Følgelig reduserte liten molekylhemming Av Ca(2+) signalvei Thr-186 fosforylering og hemmet Tat-indusert HIV-1 transkripsjon, men ikke Skattemediert HTLV-1 transkripsjon . Fordi Skattemediert transkripsjon drives Av P-TEFb, gjenstår det å bli nærmere undersøkt hvorfor BARE HIV – 1 transkripsjon ble påvirket.CDK9 Thr-186 fosforylering kan også styres av cellulære fosfataser. Våre studier for det siste tiåret fokusert PÅ PP1 som vi først observert å stimulere Tat-avhengig HIV – 1 transkripsjon in vitro . Når vi overexpressed en av de store kjernefysiske regulatoriske underenheter AV PP1, nipp1 (nuclear inhibitor AV PP1), vi observert PP1-spesifikk hemming AV HIV – 1 transkripsjon og viral replikasjon . Vi la merke til At Tat inneholder en sekvens som ligner på et konservert PP1-bindende rvxf-motiv og viste at dette motivet medierer Tat-binding TIL PP1 in vitro og in vivo, og at mutasjon av rester I PP1-bindingsmotivet (V36A OG F38A) forhindret Tat fra å indusere HIV – 1 transkripsjon . CDK9 som ble fosforylert i dyrkede celler spiked med (32P)ortofosfat og behandlet med okadainsyre ble effektivt depofosforylert in vitro av PP1, men IKKE PP2A i motsetning til in vitro autofosforylert CDK9 som ble defosforylert AV PP2A og ikke AV PP1 . Disse resultatene antydet AT PP1 kan kontrollere CDK9 fosforylering UNDER HIV – 1 transkripsjon. Faktisk, alfa katalytisk subenhet AV PP1, PP1a, ble vist å virke kooperativt og sekvensielt med (Ca2+) – calmodulin-protein fosfatase 2B (PP2B) I UV bestrålt eller hexametylene bisacetamide (HMBA)-behandlede celler Der P-TEFb frigjøres FRA 7SK snRNP kompleks . MENS PP2B induserer en konformasjonsendring I 7sk snRNP, pp1a defosforylerer CDK9 Thr – 186 og letter utgivelsene Av P-TEFb FRA 7SK snRNP . CDK9 forble defosforylert mens den var assosiert MED BRD4 og ble rekruttert til preinitiasjonskomplekset, hvor DET kan reaktiveres av TFIIH-assosiert CDK7. I samsvar med denne studien observerte vi økt CDK9 Thr-186 fosforylering i cellene som stabilt uttrykte ET PP1-hemmende peptid, det sentrale domenet TIL NIPP1, og også observert økt forening AV CDK9 / cyclin T1 MED 7SK RNA . Stabilt uttrykk for cdNIPP1 forstyrret samspillet Mellom Tat og PP1 og hemmet HIV – 1 transkripsjon, noe som tyder på at en balanse må opprettholdes mellom fosforylering og defosforylering AV CDK9 Thr-186 og at skiftende denne balansen mot fosforylering er hemmende FOR HIV – 1 transkripsjon. Ekspresjon av cdNIPP1 på en fysiologisk relevant måte som EN DEL AV HIV – 1-genomet i stedet for nef-potent hemmet HIV – 1-replikasjon, noe som videre tyder på AT PP1-målrettede hemmere kan være til nytte som potensielle ANTI-HIV-1-legemidler. MENS PP1 er en kandidat For Thr-186 defosforylering, fant vi også at DET defosforylerer CDK9 Ser-175 (se nedenfor). EN EKSTRA CDK9 Thr – 186 fosfatase, magnesium-avhengig protein fosfatase 1a (Tidligere 2c) (PPM1A) ble identifisert ved hjelp av en fosfatase uttrykk bibliotek Og Thr-186-fosfospesifikke antistoffer . PPM1A overuttrykk redusert thr-186 fosforylering og siRNA-mediert uttømming økte det, Og P-TEFb OG PPM1A også coprecipitated sammen tyder på AT CDK9 kan være et fysiologisk substrat FOR PPM1A . EN nyere studie viste AT CDK9S thr-186 fosforylering er redusert i hvilende CD4(+) T-celler som ikke er permissive FOR HIV-1-replikasjon, og at denne reduksjonen korrelerte med overflod AV PPM1A og begrenset rekruttering AV CDK9 til det store P-TEFb-komplekset . Dette funnet støtter videre nødvendigheten av det store komplekset FOR HIV – 1-transkripsjon og den kritiske rollen SOM PPM1A i HIV – 1-undertrykkelsen i hvilende T-celler. FORDI PPM1A uttrykket ikke ble endret Ved t-celler aktivering, ennå ukjente regulatoriske faktorer kan være involvert i reguleringen AV PPM1A aktivitet.

4.4. CDK9S T-Loop Ser-175 Fosforylering

NÅR CDK9 / cyclin T1 dissosierer fra det store p-TEFb-komplekset, KAN CDK9 bli fosforylert på Ser-175. Mens thr-186 defosforylering helt hemmet CDK9 / cyclin T1 kinase aktivitet, ingen forskjell ble funnet i kinase aktiviteter AV CDK9 S175A og CDK9 S175D mutanter Av David Price og kolleger . I motsetning viste Qiang Zhou og hans gruppe AT CDK9 s175a mutant var inaktiv, MENS CDK9 S175D mutant var aktiv som kinase . De viste også At Ser-175 fosforylering fremmer binding AV CDK9 / cyclin T1 Til Brd4 . Det ble foreslått at fosforylering Av Ser-175 kan forårsake en konformasjonsendring I CDK9, slik AT BRD4 kan binde seg til cyclin T1 . I vår siste studie fant vi at dynamisk hemming AV PP1 førte til eksklusiv fosforylering AV CDK9 Ser-175 som bestemt av En kombinasjon Av Hunter 2D peptid kartlegging og lc-MS analyse in vivo . Hemming av PP1 førte til hemming AV CDK9-aktivitet og reduksjon av rnapii-fosforylering in vitro og in vivo . VI fant AT CDK9 s175a mutant var enzymatisk aktiv OG indusert HIV – 1 transkripsjon . Interessant, MENS CDK9 s175d mutant var mindre aktiv som kinase, dannet det lettere lite P-TEFb-kompleks, spesielt når PP1 ble hemmet. Dermed konkluderte vi med AT PP1 aktiverer HIV-1 transkripsjon av defosforylering CDK9 Ser-175 rester. Vi la også merke til At Ser-175 fosforyleringsaktivitet var mye mer rikelig enn Thr – 186-aktivitet i celleekstrakter, noe som tyder på AT CDK9-aktivitet naturlig kan undertrykkes gjennom overfosforylering Av Ser-175. En nylig studie av Jonathan Karns gruppe viste at aktivering av T-celler gjennom T – cellereseptor (TCR) eller phorbolester (PMA) signaliserer sterkt indusert fosforylering AV CDK9 Ser-175 . Basert på molekylær modellering foreslo de at fosforylert Ser-175 danner en hydrogenbinding Med Tat Lys-14 som styrker bindingen Av Tat til CDK9 / cyclin T1 og fremmer HIV-1 transkripsjonsaktivering . OGSÅ I samsvar med de tidlige observasjonene BLE CDK9 s175a-mutasjonen funnet å avskaffe bindingen TIL BRD4 . OGSÅ, i samsvar med våre observasjoner, CDK9 s175a mutant ble funnet å sterkt indusere Tat-avhengig latent HIV – 1 reaktivering, Som Jonathan Karn og hans kollegaer tilskrives manglende evne til denne mutanten til å binde BRD4 mens de kunne binde Seg til Tat . DE fant også AT CDK9 fosforylert Ved Ser-175 er utelukket FRA 7SK RNP-komplekset , som paralleller vår tidligere observasjon AT CDK9 s175d fosfomimetisk mutant ble funnet i små P-TEFb-kompleks . Dermed peker denne siste studien På Ser – 175 som et viktig mål FOR HIV-1 reaktivering og potensiell utvikling av småmolekyleterapeutika.

vi har nylig utviklet pp1-målrettede små molekyler som ble modellert for å passe Til rvxf-imøtekommende hulrom PÅ PP1 . Vi screenet nesten 300 000 forbindelser og deretter fysisk screenet rundt 1000 forbindelser og identifiserte EN hitforbindelse, 1H4, som hemmet HIV-1 transkripsjon og replikasjon ved ikke-cytotoksiske konsentrasjoner . 1H4 forhindret pp1-mediert defosforylering av et substratpeptid som inneholdt En rvxf-sekvens in vitro, forstyrret forbindelsen MELLOM PP1 og Tat i dyrkede celler og forhindret translokasjon AV PP1 til kjernen . Vi er for tiden i ferd med å raffinere hit-forbindelsen og også utvikle PP1-målrettede forbindelser for aktivering av latent provirus.

4.5. CDK9S Ser-90 Fosforylering

Vi og andre har tidligere vist at HIV-1 transkripsjon aktiveres av Tat I g1-fasen, men ikke I G2-fasen . Dermed antydet Vi at Tat kan engasjere en cellesyklus regulatorisk kinase, som vi viste Å VÆRE CDK2 / cyclin E . HIV-1 er hemmet I CDK2 knockdown celler og også i makrofager differensiering fra induserte pluripotente stamceller MED CDK2 knockdown, videre tyder PÅ AT CDK2 er viktig FOR HIV – 1 transkripsjon og replikasjon. Den funksjonelle koblingen MELLOM CDK2 OG CDK9 ble funnet da vi analyserte inhibering AV HIV-1 av jernkelatorer. HIV – 1-transkripsjon ble hemmet I T-celler behandlet med jernkelatorer 311 og ICL670, som også hemmet CELLEAKTIVITETEN TIL CDK2 og CDK9 . Mer potente di-2-pyridylketontiosemikarbazonbaserte tridentatjernkelatorer hemmet HIV – 1-transkripsjon og virusreplikasjon ved mye lavere konsentrasjoner enn 311 ELLER ILC670 og hemmet OGSÅ CDK2-og CDK9-aktivitet . Selv om MEKANISMEN FOR CDK2-hemming ennå ikke er klarlagt, er det sannsynlig at den inkluderer induksjon av p21 gjennom oppregulering av hypoksiindusert faktor 1 (HIF-1), da jernmangel fjerner jern fra prolyl-hydroksylase og øker hif-1-og HIF-2-proteinnivåene som etterligner effekten av hypoksi . Vi analyserte CDK9 fosforylering AV CDK2 in vitro og identifiserte et motiv (90SPYNR94) som representerte ET KONSENSUS CDK2 fosforyleringssted og som ble effektivt fosforylert . Fosforylering AV CDK9 På Ser-90 ble påvist med fosfospesifikke antistoffer, og det ble redusert etter knockdown AV CDK2. CDK9 s90a mutant tilknytning til det store p-TEFb-komplekset ble redusert og dets overuttrykk hemmet HIV – 1 transkripsjon. I kontrast viste CDK9 s90d mutant uendret tilknytning til store Og små P-TEFb-komplekser og indusert Tat-avhengig HIV – 1 transkripsjon. Den fosfomimetiske s90 viste imidlertid en generell reduksjon I CDK9-uttrykk som tyder på at en fosforylerings – / defosforyleringsbalanse må opprettholdes for å danne de store Og små P-TEFb-kompleksene. Molekylær modellering viste At Ser-90 AV CDK9 var plassert på en fleksibel sløyfe utsatt for løsemiddel, noe som tyder på at det kan være under fosforylering (også sett På Figur 2). Dermed identifiserte våre nyere studier et nytt regulatorisk fosforyleringssted PÅ CDK9 som kan være målrettet for aktivering eller hemming AV HIV-1 transkripsjon.

5. Konklusjon

Fosforylering og defosforylering av spesifikke steder PÅ CDK9 skjer gjennom hele transkripsjonsprosessen og må kontrolleres nøye. Modifikasjoner ved visse treonin/serinrester bestemmer om CDK9 assosierer med stort P-TEFb-kompleks for å bli tilgjengelig for rekruttering og om dissosiasjonen av det store komplekset vil skje effektivt. Fosforylering Av Thr – 186 I T-sløyfen TIL CDK9 Og Ser-90 som ligger utenfor T-sløyfen, bestemmer om CDK9 forblir sekvestrert i det inaktive store komplekset, og også om kinasen er enzymatisk aktiv når den er dissosiert FRA 7SK snRNP. Defosforylering på noen av disse stedene fører til destabilisering av det store komplekset og frigjøring AV CDK9 / Cyclin T1, og begrenser dermed tat-rekruttering TIL HIV-1 LTR. Modifikasjoner I CDK9S C-terminus tillater syklin T1: TJÆREBINDING og defosforylering på disse stedene forhindrer binding av toTAR RNA. I motsetning hemmer fosforylering Ved Thr-29 eller Ser-175 rester CDK9. Dermed synes det fremvoksende bildet AV CDK9-regulering gjennom fosforylering å være komplisert og delvis paralleller det som er kjent for andre Cdk-er. DE nylig identifiserte CDK9-målrettede kinaser, CDK7, CDK2 og fosfataser, PP1 og PPM1A vil trolig fremstå som nye mål for ANTI-HIV-1 og kreftbehandling.

Interessekonflikt

forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt angående publisering av dette papiret.

Takk

dette prosjektet ble støttet Av District Of Columbia Developmental Center FOR AIDS Research (P30AI087714), RCMI-NIH 2G12RR003048 Fra Research Centers in Minority Institutions (RCMI) Program (Divisjon For Forskningsinfrastruktur, Nasjonalt Senter For Forskningsressurser, NIH), russisk Stiftelse For Grunnforskning (nr. 12-04-91444-NIZ) og russisk Departement for Utdanning og Vitenskap (nr. 2012-1.5-12-000-1001-030). Forfatterne vil også takke Medlemmer Av Nekhai lab for forslag og beklager de som ikke ble sitert på grunn av mangel på plass.