Case Study: Oppdage Inhibitorer Av Spenningsstyrte Natriumkanaler

Som en måte å illustrere problemene knyttet til ionkanalens legemiddelfunn som er skissert ovenfor, vil resten av denne artikkelen beskrive en casestudie med fokus på identifisering av spenningsstyrte natriumkanalhemmere for å behandle kronisk nevropatisk smerte. Behandling av smerte er et alvorlig medisinsk problem, og det er en stor innsats i farmasøytisk industri for å utvikle nye terapier for denne tilstanden. Spesielt er behandling av nevropatisk smerte, definert som «kronisk smerte som skyldes en primær lesjon eller dysfunksjon i det perifere nervesystemet» av International Association For The Study Of Pain (Iasp), fortsatt et stort udekket medisinsk behov.Det er klart at spenningsstyrte natriumkanaler (Nav1) spiller en nøkkelrolle i opprinnelsen og utbredelsen av sensoriske nerveaksjonspotensialer som er nødvendige for smertesignalering. Lokale applikasjoner av nonsubtype-selektive natriumkanalblokkere, som novokain, gir fullstendig smertelindring gjennom ledningsblokk. Imidlertid er denne tilnærmingen til smertelindring begrenset til svært få applikasjoner, for eksempel tannprosedyrer, siden natriumkanaler også er avgjørende for ledning i hjertet, CNS, skjelettmuskulatur og ikke-sensoriske nevroner. Nav1 super familien består av 10 medlemmer (Yu og Catterall, 2004). Syv av disse subtypene, Nav1. 1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 Og Nav1.9, finnes i det perifere nervesystemet (PNS). Av Disse er Nav1.7, Nav1.8 og Nav1.9 hovedsakelig uttrykt i nociceptive nevroner Og Nav1.3 er overveiende embryonisk, men er oppregulert i voksen PNS etter skade. Dette begrensede uttrykksmønsteret gjør disse subtypene attraktive mål for utvikling av nye analgetiske midler. Imidlertid er deres relative bidrag til smertesignalering, og spesielt til nevropatisk smertesignalering, uklart og kan variere med forskjellige etiologier og sensoriske kvaliteter av smerte.

i fravær av molekylær selektivitet for En Nav1 subtype, er det mulig å spesifikt målrette Nav1 kanaler i en gitt konformasjonstilstand samtidig bevare natriumkanalavhengig impulsledning. Denne typen tilstandsavhengig hemming er grunnlaget for det terapeutiske vinduet sett med natriumkanalblokkerende antikonvulsiva og antiarytmika, som lamotrigin og lidokain. Disse stoffene har høyere affinitet for kanaler i åpne og / eller inaktiverte tilstander enn for hvilende, lukkede kanaler. Denne inhiberingsmekanismen favoriserer binding i raskt avfyring eller delvis depolarisert vev. Nevropatisk smerte bør være følsom for denne hemmende mekanismen, siden det antas å oppstå fra skadeinduserte områder med depolariseringer, en hypotese som støttes av den kliniske effekten av lidokain administrert systemisk ved subanestetiske doser. Videre kan nonsubtype-selektiv, tilstandsavhengig blokk ha størst effekt, siden individuell knockout Av Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 eller Nav1.9 ga ikke overbevisende bevis for en dominerende rolle av noen av disse kanalene i nevropatisk smertesignalering.basert på denne begrunnelsen ble det besluttet å i utgangspunktet forfølge selektive, tilstandsavhengige Nav1-hemmere, mens molekylær selektivitet overvåkes ved å teste interesseforbindelser På Nav1.7, Nav1.5 (den primære hjertenatriumkanalen) og nav1.8 parallelt.

en membranpotensialbasert analyse ble brukt til å screene ∼200 000 forbindelser På Nav1.8 stabilt uttrykt i en rekombinant cellelinje. DENNE hts-analysen var basert på fluorescensresonans energioverføring (FRET) mellom to medlemmer av et membranpotensialfølsomt fargestoffpar utviklet av Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). Nav1. 8 kanaler ble preinkubert med testforbindelse og den kjemiske agonisten deltametrin i fravær av ekstracellulært natrium. Etterfølgende tilsetning av natrium resulterte i membrandepolarisering Og Nav1-blokk ble kvantifisert som interferens med den cellulære depolariseringsprosessen.

Selv om den første skjermen På Nav1.8 ga en rekke treff, bare en enkelt forbindelse ble ansett som en levedyktig bly for medisinsk kjemi innsats. Før du forplikter ressurser til denne ledelsen, ble forbindelsen, et disubstituert succinimid kalt BPBTS (N-{ methyl }-N’-(2,2 ‘ – bithien-5-yl methyl) succinimid), undersøkt i detalj ved manuell helcellespenningsklemme. BPBTS ble funnet å hemme Alle Nav1 subtyper med lignende potens, og hemming var avhengig av membranpotensial og stimuleringsfrekvens. Denne hemmende mekanismen var i samsvar med høyere affinitet av forbindelsen for kanaler i åpen og inaktivert tilstand, sammenlignet med kanaler i hvilemodus. I TILLEGG var BPBTS to størrelsesordener mer potente enn de klinisk brukte antikonvulsive Og antiarytmiske Nav1-blokkere, som hemmer Den inaktiverte tilstanden Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5 og Nav1.2, Med Ki-verdier på henholdsvis 0,09, 0,15, 0,08 og 0,14 µ og hvilestaten med Kr-verdier på henholdsvis 1,5, 1,3, 0,3 og 1,2 µ (Priest et al., 2004).

SOM sådan var BPBTS en attraktiv bly for medisinsk kjemi; dens viktigste forpliktelser er en dårlig farmakokinetisk profil. I løpet av profileringsanaloger AV BPBTS, samt publiserte Nav1–hemmere, ved bruk av membranpotensialbasert fluorescerende screening-analyse, ble strukturbaserte avvik mellom potensialer bestemt i fluorescerende analyse og ved elektrofysiologi notert for noen få forbindelser. Disse avvikene ble sporet til en interaksjon mellom disse forbindelsene og agonisten veratridin som ble brukt Til å åpne Nav1. 7 kanaler. Deretter ble fluorescerende analyse modifisert slik At Nav1 kanaler ble preinkubert med testforbindelse i fysiologiske ekstracellulære natriumkonsentrasjoner Og Nav1-avhengig depolarisering ble initiert ved agonisttilsetning(Fig. 1). Kanalhemmende potenser målt i denne modifiserte analysen korrelerte veldig godt med den inaktiverte tilstandshemming bestemt av elektrofysiologi over mange strukturelle klasser Av Nav1-hemmere (Felix et al ., 2004; Liu Et al., 2006).

selv om analoger AV BPBTS ikke klarte å overgå den opprinnelige bly i potens, lyktes medisinsk kjemi til å forbedre den farmakokinetiske profilen, og til slutt genererte trans-n – {metyl } – n-metyl-n ‘ -cyklopentan-1,2-dikarboksamid (CDA54)med 44% oral biotilgjengelighet, en times halveringstid og en clearance rate på 14 ml/min/kg, som ble profilert omfattende in vivo (Brochu et al ., 2006). I to rottemodeller av nevropatisk smerte reduserte CDA54 (10 mg/kg, gitt oralt) signifikant nerveskade–indusert atferdsoverfølsomhet med 44-67%. Samme dose / plasmakonsentrasjon AV CDA54 påvirket ikke akutt nociception( analyse av kokeplate hos rotter), motorisk koordinasjon (analyse av rotterotorod) eller hjerteledning (elektrofysiologiske parametere målt i kardiovaskulær hund). Disse egenskapene er i kontrast til de av nåværende natriumkanalblokkere som brukes i klinikken, noe som forårsaker nedsatt motorisk koordinasjon hos rotter og CNS-bivirkninger hos mennesker ved alle effektive doser. Ved oral dosering var forholdet mellom hjerne og plasma for CDA54 0,03. I MOTSETNING til dette akkumuleres klinisk brukte Nav1-blokkere i CNS, med et hjerne-til-plasma-forhold større enn 10 for mexiletin. Disse dataene fra CDA54 antydet sterkt at hemming av pns-natriumkanaler alene er effektiv i dyremodeller av nevropatisk smerte, og at begrensende CNS-eksponering For Nav1-hemmere er en levedyktig tilnærming til å utvikle Nav1-hemmere med en forbedret terapeutisk indeks.EN UHTS-kampanje, ved hjelp av membranpotensialbasert analyse beskrevet for skjerm for hemmere Av Nav1.7, oppdaget de nye 1-benzazepin-2-en-kanalhemmere (Hoyt et al., 2007; Thomas Et al., 2007). Denne klassen av inhibitorer viste et definert struktur-aktivitetsforhold, og når det ble evaluert in vivo, var medlemmer av denne serien oralt effektive i gnagers nevropatiske smerter og epilepsimodeller. Det er viktig at noen medlemmer av denne klassen viste molekylær selektivitet For Nav1. 7 kanaler (Williams et al., 2007). For eksempel, sammensatt 2 Av Fig. 2 var svært tilstandsavhengig og ∼10 ganger selektiv For Nav1. 7 over Nav1. 8 Og Nav1. 5. Det mest potente, om enn ikke subtype-selektive, medlemmet Av Denne klassen Av Nav1. 7-hemmere (forbindelse 1, BNZA; Fig. 2) det ble trekt. BNZA bindes med høy affinitet (Kd på 1,6 nM) til rekombinante Nav1. 7 kanaler. Dette er den første demonstrasjonen av høyaffinitetsligandbinding Til Nav1. 7 og gir et verdifullt screeningsverktøy for å søke Etter Nav1. 7-selektive forbindelser. Data oppnådd med 1-benzazepin-2-en strukturell serie antyder At Nav1.7-selektive analoger kan identifiseres, og med passende farmakokinetiske og legemiddelmetabolismeegenskaper, kan slike forbindelser utvikles som smertestillende midler, som potensielt viser forbedret toleranse over eksisterende legemidler som brukes til å behandle nevropatisk smerte. Støtte for muligheten for å utvikle subtype-selektive natriumkanalhemmere som nye analgetika kommer fra den siste rapporten av En Høy affinitet Nav1.8 selektiv agent, som gitt intraperitonealt var effektiv i et bredt spekter av gnager smerte modeller (Jarvis et al., 2007).

en potensiell alternativ tilnærming til å søke etter subtype-selektive natriumkanalhemmere ville være å skjerme for forbindelser som retter seg mot kanalstyringsmekanismer. Flere peptider har tidligere vist seg å modifisere gating av natriumkanaler, men få små molekyler, spesielt inhibitorer, har blitt beskrevet for å fungere på denne måten. Et slikt middel Er ProTx-II, et 30-aminosyrepeptid renset fra tarantellgift; dette peptidet blokkerer natriumkanaler og viser selektivitet For Nav1.7 (Smith et al., 2007). ProTx-II binder seg til hviletilstanden til natriumkanaler og skifter spenningsavhengigheten av kanalaktivering til flere depolariserte potensialer. Sterke depolariseringer overvinne kanal hemming, som er et kjennetegn på denne type gating modifier peptid. En mulig strategi for å identifisere små molekyl mimetikk av et gating modifier peptid er å radiomerke ProTx-II i biologisk aktiv form, og å utvikle en bindende analyse Med Nav1. 7 kanaler heterologt uttrykt i en cellelinje. Screening for små molekyler som modulerer ProTx-II binding kan avsløre nye klasser av kanalhemmere som partisjonerer i membranen og forstyrrer bevegelsen av gating padle, og dermed hindre kanalåpning. EN ekstra fordel med DENNE TYPEN UHTS er at høye konsentrasjoner av testforbindelser kan benyttes, en situasjon som er utelukket i fargestoffbasert screening på grunn av fluorescensinterferens som vanligvis oppstår med høye konsentrasjoner av mange små organiske molekyler. Gitt at noen gating modifier peptider binder seg til regioner som er unike for bestemte kanaler i en super familie, subtype-selektive hemmere kan identifiseres ved hjelp av en slik strategi.