Resultater og Diskusjon

HANCs Stammer Fra Hodet Epidermis Og Krever lb Genfunksjon. Tidligere studier (5, 11, 17, 19) har beskrevet rollen av lb-gener i celle skjebne spesifikasjonsprosesser. I Drosophila har gevinst og tap av funksjonsforsøk vist at lb-gener spesifiserer identiteten til en delmengde av hjerte – og muskelceller, og at denne funksjonen skyldes det svært begrensede, slektsspesifikke mesodermale uttrykket av lb. I tillegg er presis analyse av lbe (Fig. 1) og lbl (data ikke vist) uttrykksmønster ved utbruddet av hjertefusjon viste en trekantet klynge av lb-positive celler som ligger like foran til spissen av hjertet (Fig. 1 A, pilspiss). For å produsere en mer presis beskrivelse av plasseringen av disse cellene med hensyn til hjerte-assosiert lymfekjertler og ring kjertler, vi dobbelt merket embryoer for lb og spesifikke kjertel markører (Fig. 1 B og C). Lymfekjertelen forløpere avslørt med Anti-Slange antistoff flanke hver side av hjertet spissen (Fig. 1B) men overlapper ikke med området merket av lb. På samme måte viser den doble fargingen av l(2)1857 enhancer-fellelinjen, som spesifikt uttrykker LacZ i den embryonale primordia av ringkjertelen (15), at lb-positive celler ligger umiddelbart foran ringkjertelen (Fig. 1C).

for å bestemme opprinnelsen til hjerteassosierte lb-positive celler fulgte vi lb-uttrykket i den fremre delen av embryoene fra tidlig stadium fremover. På embryonale stadier som går foran hjertefusjonen, var vi ikke i stand til å oppdage lb-uttrykk forbundet med den fremre delen av to hjerteprimordia. Dette funnet antydet at de lb-positive cellene ikke opprinnelig er spesifisert i hjerteområdet og kan representere celler av forskjellig opprinnelse som blir assosiert med hjertecellene i senere stadier. Faktisk, på sent stadium 11, en gruppe av lb-positive celler i dorsal hodet epidermis (Fig. 2A) kan oppdages. Disse cellene begynner å invaginere litt senere og danne den ledende delen av brettet epidermis(Fig. 2B). Posisjonen og tidspunktet for denne invaginasjonen ligner en folding av hodehuden, noe som gir opphav til den bakre delen av dorsal posen kalt frontal sac (20). For å sjekke om lb-uttrykksceller samsvarer med spissen av frontal sac, brukte vi escargot-LacZ linje N516 som uttrykker lacZ i dorsale poseformende celler (20). Dobbel flekker av trinn 14 (Fig. 2B) og trinn 16 (Fig. 2C) n516 embryoer som bruker anti-lbe-og anti-β-galaktosidase-antistoffer, viser tydelig at lb og esg er kouttrykt i tuppen av invaginerende frontsekk. En dorsal visning av embryonale hodet regionen (Fig. 2D) bekrefter at disse cellene viser det samme trekantede arrangementet som de hjerteassosierte lb-positive cellene vist tidligere (sammenlign Fig. 2D og 1).

Til sammen indikerer disse dataene at lb-ekspresjonscellene som ligger rett foran hjertet, stammer fra hodehuden og migrerer mot hjertespissen under invaginering av frontal sac. Denne observasjonen reiser et ytterligere spørsmål om rollen som lb-gener i spesifikasjonen av denne gruppen av celler. Vi har tidligere vist at lb-gener spiller en viktig rolle i spesifikasjonen av en delmengde av hjerte – og muskelforløpere (11, 19). Funksjonell analyse av mus lb ortholog lbx1 genet (21, 22) har også avdekket sin implikasjon i kontroll av spesifikasjon og rettet migrasjon av appendicular muskel forløpere. Videre indikerer de nyeste dataene At Lbx1 hos mus spesifiserer en subpopulasjon av hjerte-nevrale kamceller som er nødvendige for normal hjerteutvikling (23).For å teste om Drosophila lb er nødvendig for spesifikasjon av hjerteassosierte celler, har vi analysert dorsal posedannelse i embryoer som mangler for begge lb-gener (Se Materialer og Metoder). Ved hjelp av esg RNA-sonden som markør viste vi at i lbdef-embryoer er esg-uttrykket i den distale delen av frontalsekken som bærer de hjerteassosierte cellene fraværende (sammenlign Fig. 2 E og G med F og H). I tillegg, som vist ved dorsolaterale visninger av trinn 14 embryoer (Fig. 2 g og H), er avstanden mellom plommesekken og de distale esg-positive cellene betydelig forstørret i lb-mangelfulle embryoer. Dette funnet, støttet Av Nomarski optikk observasjon avslører at den bakre delen av frontal sac har endret morfologi (data ikke vist), indikerte At HANCs ikke er spesifisert eller ikke migrere riktig i lbdef embryoer. Fordi den analyserte mangelen også dekker tilstøtende bap-og C15-gener, testet vi frontal sac-dannelse i bap mutantembryoer og Arm-GAL4> uas-RNAiC15-embryoer. I både bap208-og RNAiC15-embryoer var den esg-fargede frontal sac av normal form (data ikke vist), og utelukket dermed påvirkning av bap-og C15-gener på differensiering eller migrasjon av hjerteassosierte celler. Disse dataene tyder sterkt på at det unormale mønsteret av distale esg-positive frontale sac-celler i lbdef-embryoer skyldes tap av lb-funksjon.

Mesodermale Og Nonmesodermale Komponenter Involvert I Mønstringen Av Hjerteutstrømningsområdet. Våre immunostholdende eksperimenter viste at hjerte-forankring lb-positive celler ligger svært nær lb-uttrykke kardioblaster(Fig. 1). Fordi de fremre kardioblaster uttrykker tinn (5), dobbeltmerkede embryoer med anti-Tinn og anti-Lbe antistoffer for å visualisere de respektive posisjonene til hjertespissen og den distale delen av frontal sac. Overraskende overlapper disse to strukturene med omtrent tre cellelengder når de observeres fra dorsalsiden(Fig. 3A). Videre er den laterale konfokale utsikten over den fremre hjerteområdet (Fig. 3B) viser tydelig at spissen av frontal sac, som består av nonmesodermal lb-uttrykke celler, er direkte festet til hjertet. Nærmere bestemt observerte vi at den fremre delen av aorta (delvis overlappende hjerteassosierte lb-celler) bøyer ventralt og danner et morfologisk distinkt område som svarer til hjerteutstrømningsområdet. Denne morfologien antyder at det kan være en ekstra cellulær komponent som favoriserer ventral bøyning av hjertet. Vi bestemte oss for å se etter tilstedeværelsen av en ventralt lokalisert muskel festet til spissen av aorta. Sideriss av embryoet, dobbelt-farget for myosin tung kjede (Myo) Og Lbe (Fig. 3C), viser tydelig at hjerteutstrømningen faktisk er festet til en hodemuskel, som vi foreslår å ringe COM. Mer presis analyse av konfokale seksjoner viste at kardial primordium faktisk er forbundet med to tettliggende COMs som strekker seg fra spiserøret og festes til hver side av hjerteutstrømningsområdet (åpne pilehoder I Fig. 3D). Overraskende nok har disse embryonale hodemuskulaturen ikke blitt beskrevet tidligere til vår kunnskap. Mangelen på publisert dokumentasjon for COMs skyldes trolig at morfologien og opprinnelsen til somatiske hodemuskler i Drosophila-embryoet ikke er systematisk analysert. Ved Å bruke Den eneste tilgjengelige beskrivelsen Av voksenhodemuskulatur Utført Av Miller (24), var vi ikke i stand til å identifisere voksne hodemuskler som kan tilsvare de embryonale COMs som presenteres her.

Interessant, myo/Lbe dobbeltfarging viste også at de ikke-subkutane HANCs er festet til begge hjertecellene (Fig . 3E) Og COMs (Fig. 3D). Fordi HANCs uttrykker lb og forbinder selektivt med det mest fremre lb-positive paret av hjerteceller (Fig. 3E og 4 D-F), spekulerer vi på at etablering av denne kontakten kan innebære homofile celleinteraksjoner. Testing av celleadhesjonsmolekylene involvert i intercellulær signalering mellom homotypiske celler (25, 26) vil bidra til å definere mekanismer som ligger til grunn for etableringen av tilkobling mellom lb-uttrykkende HANCs og hjerteceller.

for å visualisere den romlige arrangement av spissen av aorta, COMs, Og lb-uttrykke HANCs, brukte vi dataassistert 3d-analyse og rekonstruksjon av confocal skanner. Denne tilnærmingen bekreftet fullt ut våre observasjoner som avslørte at i tillegg Til HANCs er hjerteutstrømningsområdet tett festet Til Et Par COMs(Fig . 3F). Disse musklene overlapper spissen av hjertet fra begge sider og bidrar til sin ventrale bøyning.For å forstå hvordan kontakten mellom hjerte, COMs og HANCs er etablert under utvikling, overvåket vi disse strukturene i tidlig og sent stadium 14 embryoer (Fig. 3 G Og H). Våre data indikerer at både lb-positive hjerteceller og lb-uttrykke HANCs tiltrekke utvide COMs.

kontakten Mellom COMs og HANCs ser ut til å ligge litt foran COMS vedlegg til spissen av aorta og ses i begynnelsen av trinn 14 (Fig. 3G). PÅ DEN tiden strekker COMS fillopodi seg i retning av lb-positive hjerteceller(Fig. 3g) og bli definitivt festet til disse cellene på sent stadium 14 ved utbruddet av hjertefusjon (Fig. 3H). Fordi COMs kommer i kontakt med hjerteceller og HANCs før HANCs blir festet til hjertet, spekulerer Vi på At COMs, i tillegg til å bøye spissen av hjertet, letter kontakten med HANCs. Etablering av kontakt mellom somatiske muskler og deres epidermale festesteder (seneceller) har blitt grundig studert (27), og avslører nøkkelrollen til sinkfingerens transkripsjonsfaktor Stripe (28) Og ET RNA-bindende protein How (29). Vi har brukt begge disse markørene for å teste Om HANCs og hjerteceller Som COMs fester vise egenskaper av sene-lignende celler. Dobbel merking utført PÅ WT-embryoer med anti-Lbe/anti-Stripe og på how-lacZ-embryoer med anti-Lbe/anti-LacZ-antistoffer viste at HANCs og de kom-kontaktende hjertecellene ikke uttrykker senecellemarkører (data ikke vist). Dette funnet indikerer at lb-positive celler tiltrekker COMs ved å bruke en mekanisme forskjellig fra den som brukes av seneceller. De mest interessante kandidatene for å lede COMs er den utskillede proteinspalten som har flere proteinbindende motiver Og dets reseptorer Robo Og Robo2 (30). Slit og Robo dukket opp nylig som sentrale komponenter som styrer tiltrekning og avstøtningsprosesser under morfogenese av somatiske muskler (31), noe som tyder på at de også kan være involvert I com-tiltrekning.

De Fremre lb-Uttrykkende Hjertecellene Spiller En Sentral Rolle I Mønsteret Av Hjerteutstrømningsområdet. Observasjonen at Både COMs og HANCs valgte å feste til de fremre lb-positive hjerteceller bedt oss om å teste om deregulering av lb uttrykk i hjertet kan påvirke mønster av hjerte utstrømming regionen. For å utføre denne testen brukte Vi Gal4/UAS-målrettet uttrykkssystem (16). To FORSKJELLIGE GAL4 effektor linjer, 24B-GAL4 og Tin-GAL4, ble brukt (Fig. 4 A og C). 24b-GAL4-linjen tillater målrettet uttrykk i alle hjerte – og muskelceller(Fig. 4A) med et jevnt og høyt uttrykksnivå i de fremre hjertecellene (pil I Fig. 4A). Tin-GAL4-linjen (vennligst levert Av R. Uas transgen ekspresjon selektivt i fire kardioblaster i hver hemisegment (disse inkluderer lb-positive celler), men nivået av induksjon i de fremre hjerteceller er lavere (pil I Fig. 4C) enn DEN AV 24b-GAL4-linjen. For å utvide hjerte-lb-uttrykk, har BEGGE GAL4-effektorlinjene blitt krysset med uas-lbe-linjen. Ektopisk lb-hjerteuttrykk drevet av tin-GAL4-linjen var svakere enn det endogene lb-uttrykket i hjertet, og det er ikke observert noen åpenbare endringer i mønsteret i hjerteutstrømningsområdet (data er ikke vist). I kontrast viste 24b-GAL4>uas-lbe-embryoer markert utvidelse av lb-uttrykk i hjertet (Fig . 4G), som fører til unormal kontakt Av COMs med spissen av hjertet. Mest presist fant Vi At COMs festes direkte til de fremre hjertecellene som danner hjerteutløpet (stjerne I Fig. 4G) og ikke til det andre paret av hjerteceller som I WT (Fig. 4D). Den endrede forbindelsen Til COMs skyldes sannsynligvis ektopiske attraktive signaler generert av forstørret hjerteuttrykk av lb. Som en konsekvens var den ventrale bøyningen av den fremre delen av hjertet mer uttalt (sammenlign Fig. 4 D og G). Vi har også lagt merke til en endret morfologi Av COMs (open arrowhead In Fig. 4 D og G), som kan skyldes det 24b-GAL4-drevne ektopiske muskulære uttrykket av lb. Kontakten Mellom hancs og hjerteceller ble ikke påvirket av eksperimentelle misuttrykk forhold. For å teste om hjerte-lb-uttrykk er nødvendig for tiltrengning Av COMs, tok vi fordel av den tidligere beskrevne negative regulatoriske innflytelsen av even-hoppet (eve)som er i stand til å spesifikt undertrykke lb i hjerteceller (5). IGJEN ble 24b-GAL4 og Tin-GAL4 effektor linjene brukt til å drive eve uttrykk i hjertet. Vi fant at begge disse driverne krysset MED UAS-eve linje (Tin-GAL4 med lavere penetrance) føre til undertrykkelse av lb aktivitet i hjertet (Fig. 4 H og I). Til tross for misspecification defekter, hjerte primordia dannes normalt I UAS-eve gevinst av funksjon embryoer (ref. 5 Og Fig. 4B), slik at vi kan overvåke COMs og HANCs i en sammenheng der hjerteuttrykket av lb er utarmet. Våre data viser at i slike lb-utarmet embryoer (se fravær av hjerte lb uttrykk I Fig. 4 H Og I) COMs festes ikke til spissen av hjertet. Vi observerte At COMs utvidet anteriorly og festet til invaginerende HANCs (Fig. 4 H og I), som ikke lenger er i stand til å forankre riktig spissen av hjertet. Den viktigste com-grenen som normalt festes til hjerteutstrømningsområdet (sammenlign Fig. 4 E Og F Med H og I) var fraværende eller smeltet sammen MED HANC-festegrenen. Dermed tror vi at unormal FORM AV COM og et komplett tap av kontakt med spissen av hjertet er forårsaket av hjerte lb utmattelse. Denne antagelsen støttes av det faktum at de samme fenotypene ble observert i embryoer med ektopisk hjerte (Tin-GAL4-drevet) og hjerte pluss muskulær (24B-GAL4-drevet) uttrykk for eve (sammenlign Fig. 4 H og I). Den endrede kontakt og posisjonering Av COMs dukket opp i sent stadium 14 embryoer når myosin tung kjede er ennå ikke påvises i kardioblaster (Fig . 4 E Og H). Analysen av trinn 15 embryoer viste i tillegg at tap av hjerte lb-uttrykk er ledsaget av nedregulering av β 3-tubulin (sammenlign Fig. 4 F Og I) i hjerteutstrømningsområdet, noe som indikerer at lb-uttrykk i hjertet har en viktig innvirkning på endelig hjertemorfogenese. Disse dataene utfyller de siste rapportene som beskriver morfogenetiske roller AV ET COUP-TF-reseptor familiemedlem, Seven-up, uttrykt i det bakre paret kardioblaster i hvert segment og kreves for dannelsen av ostia I magesegmentene A5–A7 (32, 33). I denne sammenheng øker demonstrasjonen av lbs rolle i mønsteret av hjerteutstrømningsområdet en mulighet for at lb i abdominale segmenter spiller en lignende rolle i å etablere kontakt mellom hjerteceller og hjerteforankrende alary muskler. Denne hypotesen gjenstår å bli undersøkt.

Videre er de presenterte fenotypene (Fig. 4) foreslå at lb-uttrykket eksperimentelt utarmet i hjertet påvirker utslipp eller mottak av attraktive signaler av hjerteceller og som følge fører til forstyrrelse av kontakten Med COMs. Den samme eller lignende muskel attractant er sannsynlig å bli produsert eller mottatt av lb-positive HANCs, og dermed tyder på at lb regulerer ekspresjon av gener involvert i celle–celle kontakt. Interessant, i mus lb-homolog, Ble lbx1-genet funnet å være nødvendig for rettet migrasjon av en delmengde av muskelforløpere (21, 22), noe som indikerer at de konserverte cellebevegelsesmekanismer kan eksistere som styres av lb-gener.Til sammen, gjennom analyse av embryoer hvor hjerte lb-uttrykk ble utvidet eller eksperimentelt utarmet, har vi vist at lb er nødvendig for riktig vedlegg Av HANCs og COMs og som følge av riktig mønster av hjerteutstrømningsområdet. Dette funnet gir innsikt i funksjonell betydning av anterior-posterior diversifisering av hjerteforløpere innenfor hvert segment av Drosophila-hjertet.

Kan HANCs Representere En Drosophila Prototype Av Nevrale Kamceller? Virveldyr hjerte morfogenese innebærer to forskjellige celletyper, mesodermal hjerte primordia og en subpopulation av nevrale crest celler som migrerer fra hodet regionen. I Denne artikkelen har vi vist at I Drosophila bidrar en gruppe nonmesodermale celler som stammer fra hodehuden (Som Vi har kalt HANCs) til den endelige morfogenesen av hjertet. Som i vertebrate nevrale kamceller, gjennomgår HANCs rettede bevegelser, kommer i kontakt med hjerteceller, og deltar i mønsteret av hjerteutstrømningsområdet. Vi har vist at homeobox gener lb kjent for å være involvert i diversifisering av hjerteforløpere (5, 11) er uttrykt I HANCs og kreves for deres spesifikasjon. På samme måte ble ortologien til lb, lbx1-genet, nylig funnet å være nødvendig for spesifikasjonen av en delmengde av hjerte-nevrale kamceller i mus (23), noe som indikerer at lb/Lbx1-gener spiller en bevart rolle i spesifikasjonen av nonmesodermale komponenter i hjertet. I denne visningen kan HANCs faktisk sammenlignes med vertebrate nevrale kamceller. Imidlertid indikerer våre data også At HANCs viser minst to funksjoner som bare er spesifikke for Drosophila: (i) de beveger seg som en del av foldet hode ektoderm og ikke som delaminerte nevrale kamceller; og (ii) de danner et funksjonelt kompleks Med COMs, som ikke har homologe strukturer hos vertebrater. Dermed er det nødvendig med ytterligere analyser for å belyse Den nøyaktige rollen Til HANCs og deres potensielle nevrale kamcellelignende funksjoner.