Resultater

ALDH1-Ekspresjon I Embryonale Og Voksne Pankreas.

Basert på tidligere studier som dokumenterte høye NIVÅER AV ALDH1 enzymatisk aktivitet i nevrale, hematopoietiske og brystepiteliale progenitorer (17-19), karakteriserte vi tidsmessige og romlige mønstre AV ALDH1-proteinuttrykk i embryonale og voksne musepankreaser (Fig. 1). Ved Å bruke E-cadherin som markør for epitelceller i bukspyttkjertelen, fant VI AT ALDH1-protein først kan detekteres i det utviklende pankreasepitelet På E12.5 (Fig. 1A). På dette punktet er uttrykket begrenset til tipsene til forgreningsrørene, som nylig ble foreslått å representere et flerpotensielt stamfardomene (20). Et lignende uttrykksmønster er tidligere rapportert For Aldh1a1-transkripsjoner (21). Uttrykk i de rørformede spissene (og ikke i de sentrale koffertene) fortsetter Gjennom E14.5 (Fig. 1 B og B’), og blir deretter nedregulert i differensierende akinarceller. I voksen pankreas observeres EPITELIAL ALDH1-ekspresjon hyppigst i sentroacinære og terminale duktale epitelceller (Fig. 1 C-E). Mesenkymale (e-cadherin-negative) ALDH1-ekspresjonsceller ble også påvist rundt endokrine øyer og eksokrine acini (Fig. S1).

for ytterligere å karakterisere ALDH1-ekspresjon og ALDH1-enzymatisk aktivitet i voksne terminale kanal – /sentroacinarceller, brukte vi preparater av perifere akinar-duktale enheter som nylig ble isolert fra kollagenase-fordøyd eksokrin bukspyttkjertel fra mus (22). Det er viktig at disse isolerte perifere akinar-duktale enhetene er markert utarmet av store kanal-og endokrine elementer. Sammenlignet med total bukspyttkjertel viste perifere acinar-duktale enheter en > 400 ganger uttømming i insulinutskrifter, vurdert VED RT-PCR (Fig . S2A). NÅR FACS-analyse ble utført på perifere acinar-duktale enheter høstet fra transgene Ins1: dsred-mus som uttrykte rødt fluorescerende protein i β-celler, var bare 3 av 10 000 celler (0,03%) fra dette preparatet positive For DsRed.Ytterligere tredimensjonal karakterisering AV ALDH1 – proteinuttrykk ble oppnådd ved bruk av helmontert fluorescerende merking av isolerte perifere acinar-duktale enheter. ALDH1-protein ble lokalisert i kombinasjon Med E-cadherin som markør for epitelceller, og med ENTEN FITC-konjugert Dolichos biflorus agglutinin (dba) eller FITC-konjugert peanut agglutinin (PNA), markører for henholdsvis duktale og akinarceller. Multikanalavbildning bekreftet en overveiende sentroacinar / terminal duktal plassering AV ALDH1-uttrykkende epitelceller i voksen bukspyttkjertel (Fig. S3). ALDH1-ekspresjonsceller ble oftest interposed mellom terminal ductal epitel og mer perifere akinarceller. I tillegg ble enkeltepiteliale ALDH1-ekspresjonsceller også observert umiddelbart ved siden av terminal ductal epitel (Fig. S3 a og B). BÅDE DBA-positive OG DBA-negative ALDH1-positive celler ble identifisert, MENS ALDH1-positive pna-positive celler bare sjelden ble identifisert.

Isolering AV ALDH1-Uttrykkende Sentroacinar Og Terminale Duktale Celler.

i håp om å isolere ALDH1-uttrykke celler fra voksen mus bukspyttkjertel, tok vi fordel av et fluorogent substrat kjent som «Aldefluor» (StemCell Technologies), som tidligere har blitt brukt i FACS-basert isolering av hematopoietiske, nevrale og brystepiteliale stamceller (17-19). Før vi forsøkte FACS – basert isolering AV ALDH1-uttrykkende epitelceller i bukspyttkjertelen, brukte vi først dette reagenset for å visualisere levende ALDH1-uttrykksceller i perifere acinar-duktale enheter (Fig. 2). Som vist I Fig. 2 E og F, disse studiene bekreftet sentroacinar / terminal ductal plassering av Lav-overflod Aldefluor-positive celler i voksen mus bukspyttkjertel. Aldefluor-positive sentroacinar / terminale duktale celler ble lett skilt fra tilstøtende akinarceller på grunn av deres lille størrelse og mangel på zymogengranulat. Ytterligere eksempler på levende celleavbildning ved Bruk Av Aldefluorreagenset er gitt I Fig. S4. Disse funnene antydet at anti-ALDH1 immunfluorescens og Aldefluorbasert cytofluorescens merket en lignende centroacinar / terminal ductal populasjon, og videre antydet at disse cellene kunne isoleres med FACS.

vi neste forfulgt FACS-basert karakterisering og sortering av enkeltceller dissosiert fra perifere acinar-ductal enheter. Som et innledende middel for å etablere spesifikk gating AV ALDH1-ekspresjonsceller, benyttet vi EN farmakologisk hemmer AV ALDH1 enzymatisk aktivitet (DEAB). Som vist I Fig. 2 A-D, denne strategien tillot isolering av en lav-overflod cellepopulasjon preget av høye nivåer AV DEAB-sensitiv ALDH1 enzymatisk aktivitet, bestående av 0,9% ± 0.2% av alle sorterte celler i voksen mus bukspyttkjertel. Ved bruk Av et e-cadherin-antistoff for samtidig å identifisere epitelceller, ble Det funnet At Aldefluor (+) e-cadherin ( + ) – celler representerer 0,5% ± 0,13% av alle sorterte celler i pankreas hos voksne mus (Fig. 2D).Ved å bruke kvantitativ RT-PCR for å sammenligne Aldefluor-positive, E-cadherin-positive (A+E+), Aldefluor-negative, E-cadherin-positive (A−E+), Aldefluor-positive, E-cadherin-negative (a+E−) og Aldefluor-negative, e-cadherin-negative (a−E−) populasjoner isolert fra voksen mus bukspyttkjertel, fant Vi a+E+ populasjonen å være betydelig beriket for transkripsjoner koding aldh1a1 og aldh1a7, og utarmet av Transkripsjoner For To andre aldh1 Isoformer, aldh1a2 Og Aldh1a3 (Fig. 3G). Aldh8a1 ble ikke påvist i noen av prøvene. Sammenlignet med A−e+-populasjonen ble a+e+-celler beskjedent utarmet av transkripsjoner For Pdx1 (P 0,09), Amylase (P 0,001) og Cytokeratin-19 (P 0,01) (markører uttrykt i Henholdsvis Differensierte Β-celler, Akinarceller og kanalceller). I kontrast ble a+ E + – celler preget av høyt nivå ekspresjon Av Ptf1a, til tross for at de var utarmet av Både Amylaseutskrifter og amylaseprotein (Fig. 3g Og Fig. S5). I tillegg ble disse cellene beriket for transkripsjoner som koder For Sca-1, SDF1, c-Met, Nestin, Sox9, Hey1 og Hey2, markører som tidligere var assosiert med stampopulasjoner i bukspyttkjertel og andre vev. Ved hjelp av immunfluorescerende merking på cytospin preps AV FACS-sorterte celler, bekreftet vi markert anrikning FOR ALDH1 og Sox9 protein, og uttømming av amylase I a+ E + celler (Fig. S5). I TILLEGG utførte VI OGSÅ FACS-analyse for å bestemme frekvensen Som Aldefluor ( + ) – celler også var positive for stamcellemarkører som CD133 og Sca-1-protein, og observerte at over 90% Av Aldefluor ( + ) – cellene i tillegg coexpressed begge disse stamcellemarkørene. Derimot var bare 0,11% Av Aldefluor ( + ) – cellene også positive for DEN vaskulære endotelmarkøren PECAM, mens 0,08% var positive FOR hematopoietisk markør CD45. NÅR FACS-analyse ble utført på perifere acinar-duktale enheter høstet fra transgene Ins1 – dsred-mus som uttrykte rødt fluorescerende protein i β-celler, ble Alle Aldefluor ( + ) – celler funnet å være negative for dsRed.

Pankreatosfæreanalyse Av Endokrin Og Eksokrin Stamfarfunksjon.

som en innledende skjerm for stamfar-lignende aktivitet analyserte Vi Aldefluor ( + ) og Aldefluor ( – ) celler for evnen til å danne pankreatosfærer (Fig. 3), i likhet med nevrosfæreanalysen som vanligvis brukes til å identifisere nevrale progenitorer (23). I disse analysene var a+ E + centroacinar / terminal ductal celler unikt i stand til å danne sfærer i suspensjonskultur. A+ e + celler viste en sfæreformende effektivitet >100 ganger den Av Deres A−E+ kolleger (Fig . 3 A og B Og Tabell S1). Med lavere effektivitet kunne enkelt A+E+ – celler til og med danne kuler når de ble belagt med klonal tetthet (en celle per brønn) i 96-brønnplater (Tabell S1). Ingen Av de E-cadherin-negative befolkningene viste betydelig sfæreformende kapasitet. Når dyrket over en 5-til 7-dagers periode, viste pankreatosfærer avledet Fra a+ E + celler sterkt uttrykk For E-cadherin (Fig. 3C), bekrefter deres epitelial identitet, og individuelle celler i kulene begynte å akkumulere betydelige mengder av enten amylase eller insulin Og insulin C-peptid (Fig. 3 D og E). Etter 5 dager viste ≈50% av pankreatosfærene uttrykk for amylase, mens rundt 30% viste immunoreaktivitet overfor insulin C-peptid. Individuelle sfærer var generelt positive for enten insulin eller amylase, men ikke begge. Små undergrupper av celler innenfor sfærene opprettholdt ALDH1-ekspresjon i kulturperioden, og viste også nukleært uttrykk For Sox9-protein(Fig. 3 F Og G), noe som tyder på mulig vedlikehold av et selvfornyende stamfederbasseng. Denne tilsynelatende evnen til selvfornyelse ble ytterligere støttet av det faktum at pankreatosfærer generert Av Aldefluor ( + ) sentroacinar / terminale duktale celler kunne bli utsatt for seriell enzymatisk dissosiasjon, og opprettholde sin sfæreformende kapasitet over minst tre sekvensielle passasjer med 7-dagers intervaller. I tillegg var celler innenfor sfærer svært proliferative, vurdert ved over natten inkorporering Av EdU tilsatt enten i begynnelsen eller slutten av kulturperioden (Fig. 3H).

Basert på den distinkte stamcellekapasiteten som Vises Av a+ E + – celler, undersøkte vi videre sorterte cellepopulasjoner for ekspresjon Av Ngn3, en markør for endokrine stamceller (Fig. S2B). I samsvar med tidligere studier (7) var vi ikke i stand til å påvise signifikant ekspresjon Av Ngn3 i hverken total voksen bukspyttkjertel eller noen av de nysorterte cellepopulasjonene. Men når a+ E + – cellene ble plassert i kultur, begynte de å generere detekterbar ekspresjon Av Ngn3 umiddelbart før utbruddet av insulinuttrykk, noe som ytterligere bekreftet den endokrine stamkapasiteten TIL ALDH1-uttrykkende sentroacinar og terminale duktale epitelceller.

Pankreatosfærer Avledet Fra Aldefluor ( + ) Terminal Ductal / Centroacinar Celler Vise Glukose-Responsive Insulin Sekresjon.

påvisning av celler som uttrykker insulin Og insulin c-peptid i dyrkede pankreatosfærer førte til vurdering av om disse cellene var i stand til glukose-responsiv insulinsekresjon, et kjennetegn ved funksjonelle β-celler. Som en positiv kontroll brukte Vi Ins-1-celler (klon 832/13) en immortalisert β-cellelinje som vanligvis brukes til studier av insulinsekresjon som respons på fysiologiske konsentrasjoner av glukose. Etter inkubasjon over natten av enten pankreatosfærer eller Ins-1-celler i 0, 5 og 11 mM glukose, ble både kulturmedier supernatanter og cellelysater høstet og analysert for utskilt og cellulært insulin C-peptid ved BRUK AV EN ELISA – basert analyse. Pankreatosfærer avledet Fra Aldefluor ( + ) centroacinar / terminale duktale celler utskilt C-peptid på en glukoseavhengig måte, med glukosefølsomhet lik Den som vises Av Ins-1-celler (Fig. 3I).

Aldefluor ( + ) Voksne Terminale Duktale / Sentroacinarceller Kan Bidra Til Embryonale Endokrine Og Eksokrine Linjer.

som en enda strengere test for bukspyttkjertelprogenitoraktivitet, mikroinjiserte vi isolerte Aldefluor ( + ) og Aldefluor ( – ) celler i mikrodissiserte dorsale bukspyttkjertelknopper isolert fra e12. 5 musembryoer, og analyserte for en evne til produktivt å bidra til å utvikle endokrine og eksokrine linjer (Fig. 4). Denne tilnærmingen ble nylig brukt til å dokumentere stamfar aktivitet For Ngn3-uttrykke celler som oppstår etter bukspyttkjertelkanal ligering (7). For å spore linjen av voksne avledede donorceller og skille dem fra deres embryo-avledede kolleger, isolerte Vi Aldefluor ( + ) og Aldefluor ( – ) celler fra bukspyttkjertelen hos mus som bærer en allestedsnærværende uttrykt pCAG:mCherry transgen, som skjematisk avbildet I Fig. 4A (pCAG: mcherry-mus ble vennlig levert Av Michael Wolfgang, Johns Hopkins University). Sammenlignet Med Aldefluor ( – ) – celler, Hadde Aldefluor ( + ) – celler et dramatisk forbedret potensial for å bidra til nye endokrine linjer i de modne dorsale knoppene, som demonstrert ved samtidig uttrykk for mCherry med Enten C-peptid(Fig . 4 B-E) eller glukagon (Fig. 4 F-I). Ved å bruke overlagret e-cadherin-merking for å tillate telling av individuelle mcherry-positive celler, evaluerte vi kvantitativt evnen til voksne Aldefluor ( + ) og Aldefluor ( − ) celler til å gå inn i embryonale linjer. Syv dager etter mikroinjeksjon Av Aldefluor ( + ) celler I E12.5 dorsale knopper, ekspresjon av glukagon ble observert i 11,7% av gjenværende mCherry-positive celler, med insulin C-peptiduttrykk observert i ytterligere 11,6% (Fig. 5N). I motsetning til dette uttrykte 2,4% av gjenværende Mcherry-positive Aldefluor − celler glukagon, og bare 0,2% uttrykte insulin C-peptid. Interessant nok viste Aldefluor (+) og Aldefluor ( – ) – populasjonene tilsvarende evner til å inngå ikke-endokrine epitellinjer, noe som kanskje gjenspeiler det faktum at det meste Av Aldefluor ( – ) – populasjonen besto av allerede differensierte akinarceller. Lignende frekvenser Av e-cadherin, amylase og pna-positivitet ble observert i gjenværende mcherry-positive celler avledet fra Enten Aldefluor ( + ) eller Aldefluor ( – ) populasjoner (Fig. 4 J-N).

Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.

for å evaluere in vivo atferden TIL ALDH1-ekspresjonende sentroacinar-og terminale kanalceller, vurderte VI ALDH1-ekspresjonsmønstre ved kronisk inflammasjon og regenerativ metaplasi indusert ved sekvensiell administrering av lavdose caerulein. Som tidligere rapportert (15) induserte behandling av voksne mus med tre injeksjoner med caerulein (50 µ/kg) per uke i 3 sammenhengende uker en tilstand av kronisk pankreatitt etterfulgt av nesten fullstendig regenerering og reparasjon. Denne prosessen er preget av inflammatoriske infiltrater, stromal ekspansjon og dannelse av regenerative metaplastiske tubulære komplekser, som inkluderer type-1 tubulære komplekser som tidligere er vist å være akinarcellederiverte, og type-2 tubulære komplekser (TC2), tidligere vist å være nonacinar-avledet og antagelig oppstår fra prolifererende terminale kanalceller (15). I motsetning til DEN relativt lave mengden AV ALDH1-ekspresjons terminal kanal og sentroacinar celler observert i normal voksen bukspyttkjertel (Fig. 5 a og B), ALDH1-uttrykke terminal kanal (Fig. 5 C og D) og centroacinar (Fig. 5 e og F) cellene ble markert utvidet i forbindelse med caerulein-indusert kronisk pankreatitt. Av notatet, type-2 rørformede komplekser besto hovedsakelig AV ALDH1-uttrykke celler (Fig. 5H), mens type-1 rørformede komplekser ikke viste tegn PÅ ALDH1-uttrykk (Fig. 5G).