Abstrakt
Ulike teknikker er tilgjengelige for isolering Av Candida i munnhulen. Slike metoder spiller en viktig rolle i diagnosen og styringen av oral candidose. Den økende betydningen Av Candida er delvis relatert til fremveksten AV HIV-infeksjon og mer utbredt bruk av immunsuppressiv kjemoterapi. Sammen Med Candida albicans har det vært en større anerkjennelse av betydningen av nonalbicans Candida arter i oral candidosis. Identifisering av infeksjonsstammer Av Candida er viktig fordi isolater Av Candida-arter varierer mye, både i deres evne til å forårsake infeksjon og også i deres følsomhet overfor antifungale midler. Dermed gir denne gjennomgangen en oversikt over pålitelige metoder for candidal isolasjon og identifisering av isolater fra munnhulen.
1. Introduksjon
Begrepet Candida stammer fra det latinske ordet candid, som betyr hvit. Sporer Av Candida er en commensal, ufarlig form for en dimorf sopp som blir invasiv og patogen pseudohyphae når det er en forstyrrelse i florabalansen eller i forringelse av verten . oversettelsen av denne endogene kommensalen til den sykdomsfremkallende parasitten kan være forbundet med andre faktorer enn de patogene egenskapene til selve organismen, noe som er ganske unikt sammenlignet med de fleste andre smittsomme sykdommer, hvor virulensen av organismer anses å være nøkkelfaktoren i patogenesen. Derfor Er Candida-arter strengt opportunistiske. Det kan påpekes at verken overfladiske eller systemiske former For Candida-infeksjoner kunne initieres i fravær av underliggende patologi .
Det er mange Arter Av Candida (Tabell 1), men Den mest utbredte Som gjenvinnes fra munnhulen, både i kommensal tilstand og i tilfeller av oral candidose, Er C. albicans. Det er anslått at denne arten står for over 80% av alle orale gjærisolater.
Candida albicans
Candida lusitaniae
Candida lusitaniae
Candida lusitaniae
candida parapsilosis
candida tropicalis
candida kefyr
de siste årene har det vært økt interesse for infeksjoner forårsaket Av det opportunistiske patogenet Candida. Den økende betydningen Av Candida er delvis relatert til fremveksten AV HIV-infeksjon og mer utbredt bruk av immunsuppressiv kjemoterapi . Identifisering av infeksjonsstammer Av Candida er viktig fordi isolater Av Candida-arter varierer mye, både i deres evne til å forårsake infeksjon og også i deres følsomhet overfor antifungale midler . Sammen Med c. albicans har Det vært en større anerkjennelse av betydningen av ikke-albicans Candida-arter i menneskelig sykdom. C. glabrata Og C. krusei er arter som har fått oppmerksomhet på grunn av deres forbedrede motstand mot visse antifungale midler. C. dubliniensis er en nylig identifisert patogen art, først beskrevet i 1995 da Den ble koisolert Med c. albicans fra tilfeller av oral candidose hos HIV-infiserte individer .
denne anmeldelsen gir en oversikt over pålitelige metoder for candidal isolasjon og identifisering av isolater fra munnhulen.
2. Patogene Egenskaper Av Candida
Overgangen Av Candida fra en ufarlig kommensal til en patogen organisme er kompleks og er relatert til subtile miljøendringer som fører til uttrykk for en rekke virulensfaktorer (Tabell 2). Det er den kombinerte effekten av både vert og candidale faktorer som til slutt bidrar til utviklingen av oral candidose .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||
Uansett hvilken type candidose, Er Candida-artens evne til å fortsette på mukosale overflater av friske individer en viktig faktor som bidrar til dets virulens. Dette er spesielt viktig i munnhulen, hvor organismen må motstå den mekaniske vaskevirkningen av en relativt konstant strøm av spytt mot spiserøret .Ingen enkelt dominerende virulensfaktor For Candida er anerkjent selv om det er en rekke faktorer som har vært involvert i å fremme infeksjonsprosessen. Disse inkluderer egenskaper involvert I adhesjon Av Candida til orale overflater (f. eks. relativ celleoverflatehydrofobisitet og tilstedeværelse av spesifikke adhesinmolekyler), evnen til å motstå vertsimmunforsvarsmekanismer (f. eks. høyfrekvent fenotypisk bytte og morfologisk overgang) og frigjøring av hydrolytiske enzymer (f. eks., utskilles aspartylproteinaser og fosfolipaser) som kan forårsake skade på vertsceller .
3. Oral Candidose
Samaranayake foreslo en klassifisering hvor de orale candidoselesjonene ble delt inn i to hovedgrupper: Gruppe i, eller primære orale candidoser begrenset til lesjoner lokalisert til munnhulen uten involvering av hud eller andre slimhinner; Gruppe II Eller sekundære orale candidoser, Hvor lesjonene er tilstede i orale så vel som ekstraorale steder som hud (Tabell 3). Gruppe i-lesjoner består av den klassiske triaden-pseudomembranøse, erytematøse og hyperplastiske varianter-og noen har foreslått ytterligere oppdeling av sistnevnte i plakklignende og nodulære typer .
| Primær oral candidose (Gruppe I) | Sekundær oral candidose (Gruppe II)) | |
| den»primære triaden «: | Condition | Subgroup |
| Pseudomembranous (mainly acute) | Familial chronic mucocutaneous candidosis | 1 |
| Erythematous (acute/chronic) | Diffuse chronic mucocutaneous candidosis | 2 |
| Hyperplastic (mainly chronic) | Candidosis endocrinopathy syndrome | 3 |
| (i) Plaque-like | Familial mucocutaneous candidosis | 4 |
| (ii) Nodular/speckled | Severe combined immunodeficiency | 5a |
| Candida-associated lesions | Di George syndrome | 5b |
| Denture stomatitis | Chronic granulomatous disease | 5c |
| Angular cheilitis | Acquired immunodeficiency syndrome | 6 |
| Median rhomboid glossitis | — | — |
| Linear gingival erythema | — | — |
4. Diagnose Av Oral Candidose
diagnose av oral candidose kan Ofte gjøres på arten av de kliniske presentasjonsfunksjonene, selv om mikrobiologiske prøver bør tas om mulig for å både identifisere Og kvantifisere Candida som kan være tilstede og gi isolater for antifungal sensitivitetstesting.
5. Isolasjonsmetoder
Teknikker som er tilgjengelige for isolering Av Candida i munnhulen inkluderer bruk av et smear, en vanlig vattpinne , en avtrykkskultur , samling av hele spytt , konsentrert oral skylling og slimhinnebiopsi. Hver metode har spesielle fordeler og ulemper, og valget av prøvetakingsteknikk styres primært av arten av lesjonen som skal undersøkes (Tabell 4). Når en tilgjengelig og definert lesjon er tydelig, foretrekkes en direkte prøvetakingsmetode som bruk av en vattpinne eller et avtrykk, da dette vil gi informasjon om organismene som er tilstede ved selve lesjonen. I tilfeller der det ikke er noen åpenbare lesjoner eller i tilfeller der lesjonen er vanskelig å få tilgang til, er en indirekte prøve basert på dyrking av spyttprøver eller en oral skylling mer akseptabel.
|
||||||||||||||||||||||||||||||
6. Direkte Mikroskopi
Morfologiske egenskaper Av Candida-arter (Tabell 5) må undersøkes for identifikasjon. En smøre er av verdi i å skille mellom gjær og hyphal former, men er mindre følsom enn kulturelle metoder . Kaliumhydroksid (KOH) preparering av prøven avslører ikke-pigmentert septathyphae med karakteristisk dikotom forgrening (i en vinkel på omtrent 45°). I KOH-Calcofluor fluorescerende-flekkmetode vil soppegenskaper som hyphae, gjærceller og andre soppelementer fluorescere .
|
||||||||||||||||||||||
en smøre tatt fra lesional området er festet på mikroskop lysbilder og deretter farget enten ved gram flekken eller ved periodisk syre Schiff (PAS) teknikk. Ved hjelp av disse metodene vises candidal hyphae og gjær enten mørkblå (Gram-flekk) eller rød/lilla (PAS) .
ved kronisk hyperplastisk candidose er en biopsi av lesjonen nødvendig for senere påvisning av invaderende Candida ved histologisk farging ved bruk av ENTEN PAS eller Gomori ‘ s metenamin sølv flekker. Demonstrasjon av sopp elementer i vev er gjort som de er farget dypt av disse flekkene. Tilstedeværelsen av blastosporer og hyphae eller pseudohyphae kan gjøre det mulig for histopatologen å identifisere soppen Som En Art Av Candida og, gitt tilstedeværelsen av andre histopatologiske egenskaper, foreta en diagnose av kronisk hyperplastisk candidose .
7. Laboratoriekultur
7.1. Vattpinne
en vattpinne av et lesional sted er en relativt enkel metode for å oppdage vekst og semiquantitative estimering Av Candida kan oppnås. Prøvetakingsmetoden innebærer forsiktig å gni en steril bomullspinne over lesional vevet og deretter inokulere et primært isolasjonsmedium som Sabouraud ‘ s dextrose agar (SDA) .
7.2. Konsentrert Oral Skylling
teknikken for oral skylling innebærer at pasienten holder 10 mL steril fosfatbufret saltvann (0,01 M, pH 7,2) i munnen i 1 minutt. Oppløsningen konsentreres deretter (10 ganger) ved sentrifugering og et kjent volum, vanligvis 50 µ, inokuleres på et agarmedium ved hjelp av et spiralplateringssystem. Etter 24-48 timers inkubasjon ved 37°C, vurderes veksten ved opptelling av kolonier og uttrykkes som candidal kolonidannende enheter per mL (cfu mL-1) skylling .
7.3. Imprint Kultur
imprint metoden benytter en steril skumpute av kjent størrelse (typisk 2,5 cm2), tidligere dyppet i et passende flytende medium, som Sabouraud ‘ s buljong, umiddelbart før bruk. Puten plasseres deretter på målstedet (slimhinne eller intraoral protese) i 30 sekunder og overføres deretter til en agar for kultur .
8. Kulturmedier
det mest brukte primære isolasjonsmediet For Candida er Sda som, selv om Det tillater Vekst Av Candida, undertrykker veksten av mange arter av orale bakterier på grunn av sin lave pH. Inkorporering av antibiotika i SDA vil ytterligere øke selektiviteten . VANLIGVIS inkuberes sda aerobisk ved 37°C i 24-48 timer. Candida utvikler seg som krem, glatt, deigaktig konvekse kolonier PÅ SDA og differensiering mellom arter er sjelden mulig . Det er anslått at Mer Enn En Candida-art forekommer i ca 10% av orale prøver, og de siste årene har evnen til å oppdage nonalbicans-arter blitt stadig viktigere .
I de senere år har det blitt utviklet andre differensielle medier som gjør det mulig å identifisere Visse Candida-arter basert på koloniutseende og farge etter primærkultur. Fordelen med slike medier er at tilstedeværelsen av Flere Candida-arter i en enkelt infeksjon kan bestemmes som kan være viktig ved valg av etterfølgende behandlingsalternativer . Eksempler på Disse inkluderer Pagano-Levin agar eller kommersielt tilgjengelige kromogene agarer, Nemlig CHROMagar Candida, Albicans ID, Fluroplate eller Candichrom albicans .
Pagano-Levin agar skiller Mellom Candida-arter basert på reduksjon av trifenyltetrazoliumklorid. Mediet produserer blekfargede kolonier Av c. albicans, mens kolonier av Andre Candida-arter viser varierende grad av rosa farge. Pagano-Levin agar har en lignende følsomhet FOR SDA, men er overlegen for påvisning av mer enn en art i prøven, CHROMagar Candida identifiserer c. albicans, C. tropicalis, og c. krusei basert på koloni farge og utseende, Mens Albicans ID OG Fluroplate har vist seg gunstig for presumptive identifisering Av c. albicans . Spesifisiteten av identifikasjon er rapportert å være 95% For CHROMagar Candida og 98,6% For Albicans ID og Fluroplate agar . Bruken Av CHROMagar Candida som en primær isolasjon agar har blitt sitert som en tilnærming som tillater diskriminering av den nylig beskrevne c. dubliniensis Fra c. albicans. På CHROMagar Candida utvikler c. dubliniensis seg som mørkere grønne kolonier sammenlignet med C. albicans . Derimot, diskriminering mellom disse to artene bruker CHROMagar ser ut til å avta på subkultur og lagring av isolater. Unnlatelse Av C. dubliniensis å vokse på agar media ved forhøyet inkubasjonstemperatur på 45°C har nylig blitt foreslått som en alternativ test for å diskriminere mellom disse to artene .
9. Identifikasjon av Candida-Arter
Identifikasjon av gjær basert på primærkulturmedier kan bekreftes gjennom en rekke supplerende tester som tradisjonelt er basert på morfologiske (Tabell 5) og fysiologiske egenskaper hos isolatene.
9.1. Morfologiske Kriterier
bakterie-rør-testen er standard laboratoriemetode for å identifisere c. albicans. Testen innebærer induksjon av hyphal utvekster (kimrør) når de er subkulturert i hesteserum ved 37°C i 2-4 timer. Omtrent 95% av c. albicans isolater produserer kimrør, en eiendom som også deles Av C. stellatoidea og C. dubliniensis .C. albicans og c. dubliniensis kan også identifiseres fra andre arter basert på deres evne til å produsere morfologiske egenskaper kjent som chlamydospores. Chlamydospores er refraktile, sfæriske strukturer generert ved termini av hyphae etter kultur av isolater på et ernæringsmessig dårlig medium som maismel agar. Isolater inokuleres i et krysslukemønster på agar og overlaid med en steril deksel. Agarer inkuberes i 24-48 timer ved 37°C og undersøkes deretter mikroskopisk for chlamydospore-tilstedeværelse .
9.2. Fysiologiske Kriterier / Biokjemisk Identifikasjon
Biokjemisk identifikasjon Av Candida-arter er i stor grad basert på karbohydratutnyttelse. Tradisjonell testing ville ha involvert kultur av testisolater på en basal agar som mangler en karbonkilde. Karbohydratløsninger vil da bli plassert i brønner av den frøede agar eller på filterpapirskiver plassert på agaroverflaten. Vekst i nærheten av karbonkilden vil indikere utnyttelse. Kommersielle systemer er basert på samme prinsipp, men testkarbohydrater er plassert i plastbrønner plassert på en teststrimmel. Veksten i hver brønn leses av endringer i turbiditet eller fargeendringer i enkelte settsystemer. Numeriske koder hentet fra testresultatene brukes til å identifisere testorganismen basert på databasesammenligning .
9.3. Serologi
Serologiske tester brukes ofte for å fastslå Den kliniske betydningen Av Candida-arter isolater. Stigende titere av lgg-antistoffer mot c. albicans kan reflektere invasiv candidiasis hos immunkompetente individer. Påvisning av Iga og IgM antistoffer er viktig for å identifisere en akutt infeksjon. Immunsupprimerte individer viser ofte variasjon i antistoffproduksjon, og i så fall anbefales bruk av en antigen-deteksjonstest. Tester som enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) og radio immuno assay (ria) for påvisning av candidial antigen, enten celle-vegg mannan eller cytoplasmatiske bestanddeler er nå tilgjengelig i utviklede land .
Serologisk diagnose blir ofte forsinket, og testene mangler fortsatt følsomhet og spesifisitet. Videre er antistoffproduksjon hos immunkompromitterte pasienter variabel, noe som gjør diagnosen komplisert . Dette skyldes det faktum at soppantigener og metabolitter ofte fjernes raskt fra sirkulasjonen, og tilstedeværelsen av antistoffer betyr ikke alltid En Candida-infeksjon, spesielt hos pasienter med alvorlig underliggende sykdom eller som tar immunosuppressive stoffer .
Serologiske tester er normalt ikke et diagnostisk verktøy for oral candidose. Imidlertid kan slike tester være et prognostisk instrument hos pasienter med alvorlig oral candidose som reagerer dårlig på antimykotisk terapi .
9.4. Molekylærbaserte Identifikasjonsmetoder
Identifikasjon ved analyse av genetisk variabilitet er en mer stabil tilnærming enn å bruke metoder basert på fenotypiske kriterier. For identifisering Av Candida basert på genetisk variasjon er analyser av elektroforetiske karyotype forskjeller og begrensning fragment lengde polymorfismer (rflps) ved hjelp av gel elektroforese ELLER DNA – dna hybridisering .
Artsspesifikke PCR-tilnærminger har også blitt brukt for Å Identifisere Candida-arter. Flere målgener har blitt rapportert for Candida-artsdiskriminering, selv om de hyppigst forsterkede er sekvensene av ribosomal rna-operon. Identifikasjon kan oppnås basert PÅ PCR – produktstørrelser oppnådd etter oppløsning av gelelektroforese, ELLER PCR-produktsekvensvariasjon bestemt enten ved direkte sekvensering eller ved bruk av restriksjonsfragmentanalyse etter kutting AV PCR-sekvenser med restriksjonsendonukleaser .Fluorescens in situ hybridisering med peptid nukleinsyre metode (Pna Fisk) er en ny deteksjonsteknikk som mål svært konserverte artsspesifikke sekvenser i rikelig rRNA av levende c. albicans. Individuelle celler kan detekteres direkte uten behov for forsterkning . Denne teknikken oppnår en følsomhet på 98,7-100%, med en spesifisitet på 100%, noe som muliggjør diskriminering Av C. albicans fra fenotypisk lignende C. dubliniensis . Molekylærbasert teknologi kan også brukes til å identifisere Stammer Av Candida-arter, selv om bruk av teknikker som Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) analyse og repeat sequence amplification PCR (REP) i stor grad er reservert for epidemiologiske undersøkelser i forskning av oral candidose .
10. Konklusjon
de siste årene har det blitt lagt større vekt på pålitelig identifisering Av Candida-arter fra humane kliniske prøver. En skjematisk fremstilling for candidal isolasjon og identifikasjon er presentert I Figur 1. Siden Candida er bosatt mikroflora, er det nødvendig med passende isolasjonsmetoder for å fastslå tilstedeværelsen i munnen sammen med deres nummer. Det er også viktig å identifisere Infeksjonsstammer Av Candida fordi isolater Av Candida-arter varierer mye, både i deres evne til å forårsake infeksjon og også i deres følsomhet overfor antifungale midler. Ulike fenotypiske teknikker er tilgjengelige for å identifisere isolert Candida, inkludert bruk av morfologiske kulturtester, differensielle agarmedier og biokjemiske assimilasjonstester. Disse metodene er supplert med nyere molekylære teknikker i stor grad reservert for epidemiologiske undersøkelser.
