incPRINT metoden for å identifisere RNA–protein komplekser
for å identifisere RNA–protein interaksjoner systematisk i levende celler, utviklet vi en metode som måler cellulære interaksjoner mellom noen merket test RNA og noen merket test protein. Prinsippet med incPRINT er det forbigående doble uttrykket AV ET MS2-merket test-RNA og ET FLAGGMERKET testprotein i HEK293T-celler som stabilt uttrykker en luciferase-detektor smeltet TIL MS2 coat-proteinet (MS2CP) fra et genomisk integrert plasmid (Fig. 1). Test-RNA er bundet til luciferase-detektoren GJENNOM MS2-MS2CP-interaksjonen; RNA-luciferase-komplekset er co-renset med FLAGG-merket testproteinimmunoprecipitated fra cellelysater av ANTI-FLAGG antistoff (Fig. 1). Indirekte rna-protein interaksjoner brodd AV DNA elimineres Ved DNase behandling etter celle lysis trinn. FOR å oppdage hver RNA–proteininteraksjon, måles RNA-MS2 co-renset med testflagget protein ved kvantifiserbar luciferase luminescens(Fig. 1). For å kontrollere for testproteinuttrykksnivåer måles overflod av testproteinene ved ELISA ved hjelp av et andre ANTI-FLAGG antistoff koblet til pepperrotperoxidase (HRP) (Fig. 1). IncPRINT-metoden er fleksibel i skala, kan brukes som en lav-eller høy gjennomstrømmingsanalyse. For å muliggjøre systematisk identifisering med høy gjennomstrømming av cellulære rna-protein-interaksjoner, genererte vi et tilpasset bibliotek med ∼3000 HUMANE FLAGGMERKEDE proteiner, inkludert ∼1500 kjente RBPs (basert på refs. 10,11), ∼1300 transkripsjonsfaktorer12, og ∼170 kromatinassosierte proteiner. Det merkede proteininnholdet kan tilpasses for å passe til ønsket eksperimentelt oppsett.
prinsipp for incPRINT-metoden. HEK293T-celler, som stabilt uttrykker Et NanoLuc luciferase-MS2CP rekombinant protein fra et integrert plasmid, ble transfisert med plasmider som koder FOR ET MS2-merket test-RNA og 3xFLAG-merkede testproteiner i et 96-brønnformat(hver brønn inneholder celler som uttrykker et merket test-RNA og et merket testprotein). Cellelysater ble påført anti-FLAGGBELAGTE 384-brønnplater for å immunrense testproteiner med deres interagerende Rna. ETTER vasking av ikke-spesifikke interaksjoner BLE MS2-RNA / FLAGGMERKEDE proteinkomplekser detektert Av NanoLuc luciferase, bundet til test-RNA gjennom MS2-MS2CP-interaksjonen. Ekspresjonsnivåene FOR DE flaggmerkede testproteinene ble detektert AV ELISA ved bruk av et andre ANTI-FLAGG antistoff koblet til pepperrotperoksidase (HRP).
incPRINT oppdager pålitelig cellulære rna–protein interaksjoner
for å etablere incPRINT, utførte vi en serie småskala eksperimenter ved hjelp av en ∼1 kb konservert region av lncRNA Xist kalt a repeat, heretter referert Til Som Xist(A)13. Fordi Flere Xist (a) – proteininteraksjoner har blitt godt etablert7, fungerte de som kontroller i våre første incPRINT-eksperimenter. Vi konstruerte en konstruksjon for å uttrykke Xist (A)-MS2 og analyserte evnen Til Xist(A)-MS2 RNA til å interagere med et valgt sett med tidligere identifiserte Xist-bindende proteiner7,14,15. Det ikke-diskriminerende poly (A)-bindende proteinet PABPC3 ble brukt til å kontrollere RNA-uttrykk og EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) ble brukt som en negativ kontroll. incPRINT luminescens oppdaget spesifikke interaksjoner Av Xist(A)-MS2 MED SPEN, RBM15, RBM15B, YTHDC1, HNRNPC, SRSF7 og RALY, MENS HNRNPU, rapportert å binde Full lengde Xist, men ikke spesifikt Xist (a) 7, og EGFP viste basal binding (Fig. 2a). Behandlingen med RNase avskaffet rna-protein interaksjonssignalet målt ved luciferase, mens ekspresjonen av testproteiner oppdaget AV ELISA forblev stort sett uendret (Fig. 2a, Supplerende Fig. 1a), som viser at samspillet mellom de merkede proteinene og luciferase-detektoren ble brodd av RNA.
incPRINT måler cellulære rna-protein interaksjoner. En Interaksjonsintensitet detekteres mellom Xist (A) – MS2 og de indikerte faktorene, med og uten rnase-behandling. Data fra to biologiske replikater er presentert som gjennomsnittlig ± s. d.; RLU er relative lysenheter. B Interaksjonsintensiteter Mellom Xist (A) – MS2 og de angitte faktorene. In-celle interaksjon verdier ble målt i en standard incPRINT eksperiment. In vitro-interaksjonsverdier resulterte fra separate transfeksjoner av de merkede proteinene Og Xist(A) – MS2 RNA, som ble kombinert for interaksjonsanalyser etter at cellene ble lysert. Data fra to biologiske replikater for hvert eksperiment er presentert som gjennomsnittlig ± s. d.; RLU er relative lysenheter. C Spredningsplott som viser korrelasjonen Av xist (A) – MS2 interaksjonsintensiteter bestemt Av NanoLuc luciferase luminescens fra to biologiske replikater. Vist er median-normaliserte verdier. Kvadrert Pearson korrelasjonskoeffisient er indikert. D Scatter plot viser korrelasjonen AV FLAGG-merket protein uttrykk nivåer bestemmes av ANTI-FLAGG ELISA fra to biologiske replikater. Vist er median-normaliserte verdier. Kvadrert Pearson korrelasjonskoeffisient er indikert. E Spredningsplott som viser RNA – proteininteraksjonsintensiteter og proteinuttrykksnivåer. RLU er relative lysenheter.
For å optimalisere ANTALL MS2 stamsløyfer som brukes til å merke det testede RNA, ble Xist(A) smeltet sammen med to, fire, seks, ti ELLER 24 MS2 stamsløyfer, og deres interaksjoner med et sett med kontrollproteiner ble testet i et lite incPRINT-eksperiment. En økning i luminescens intensitet direkte korrelert med et økt antall MS2 stem sløyfer opp til ti stem sløyfer uten markert økning i binding TIL EGFP kontroll (Supplerende Fig. 1b). Derfor, i alle etterfølgende incPRINT-eksperimenter, Ble Rna-ene merket med ti MS2-stammeløkker.For å avgjøre om RNA-proteininteraksjonene oppdaget av incPRINT faktisk forekom i celler eller oppsto bare in vitro etter cellelysis16,17 ,18, ble luminescenssignalet fra to uavhengige eksperimenter målt og sammenlignet. I det første forsøket ble Xist(A)-MS2 RNA og FLAGG-merkede testproteiner transfisert i samme cellepopulasjon som beskrevet ovenfor. I det andre forsøket ble Xist(A)-MS2 RNA og FLAGG-merkede testproteiner transfisert separat i to forskjellige cellepopulasjoner og samlet sammen bare etter cellelysetrinnet, og tillot dannelsen av RNA–proteinkomplekser utelukkende in vitro (Supplerende Fig. 1c). Vi fant at interaksjoner ble fortrinnsvis oppdaget når Xist (A) – MS2 RNA og DE FLAGGMERKEDE proteinene ble transfisert (standard incPRINT tilstand; Fig. 2b). Disse resultatene antyder at når et interaksjonssignal ble detektert av incPRINT, stammet det fra RNA-proteinkompleksene dannet i celler, mens forening av RNA–proteinkomplekser etter cellelyse dukket opp som ubetydelig bakgrunn under incPRINT-spesifikke forhold (Fig. 2b). Samlet sett fastslår disse forsøkene at incPRINT måler cellulære RNA-proteininteraksjoner ved hjelp av en luminescensavlesning.
deteksjon Med høy gjennomstrømming av rna–protein-interaksjoner
for å teste skalerbarheten til incPRINT for systematisk identifisering av rna-protein-interaksjoner, har vi avhørt vårt tilpassede bibliotek med ~3000 FLAGGMERKEDE humane proteiner (inkludert ∼1500 kjente RBPs10, 11, ∼1300 transkripsjonsfaktorer12 og ∼170 kromatinassosierte proteiner), Med Xist(A)-MS2. For å styrke tilliten til incPRINT-identifiserte rna-protein-interaksjoner, ble alle interaksjoner analysert i biologisk duplikat, og genererte to luminescens (RNA–protein interaksjonsintensitet) og to elisa (testproteinuttrykk nivå) verdier for hvert testet RNA–protein par. Etter å ha filtrert ut proteinene uttrykt ved utilstrekkelige nivåer (se Avsnittet ‘Metoder’), ble interaksjonsdata analysert for 2405 proteiner. incprints reproduserbarhet ble vurdert ved å beregne korrelasjonsresultatene for biologiske duplikater for både luminescensen(Fig. 2c; R2 = 0.87) OG ELISA signaler (Fig. 2d; R2 = 0,99). Spesielt ble det ikke påvist noen korrelasjon mellom luminescens og ELISA-verdier, noe som indikerer at interaksjonsintensitetene ikke bare var en refleksjon av proteinuttrykksnivåene (Fig. 2e). Oppsummert viser våre data at incPRINT er en skalerbar høy gjennomstrømningsmetode som reproduserbart måler RNA–proteininteraksjoner i cellen.
incPRINT identifiserer proteom av lavt uttrykte Rna
Deretter forsøkte vi å teste om incPRINT robust kan identifisere proteiner som interagerer med transkripsjoner uttrykt ved lave endogene nivåer. Identifisering av proteiner assosiert med lav kopi nummer Rna er generelt utfordrende ved BRUK AV rna affinitetsfangst-MS tilnærminger på grunn av den typisk lave effektiviteten AV RNA-rensninger og den store mengden materiale som kreves for massespektrometri. Fordi Firre er en funksjonelt viktig lncRNA som modulerer høyere orden kjernefysisk arkitektur over kromosomer19 og er av en ganske lav endogen overflod (∼20 molekyler per celle basert PÅ RNA-Seq data på tvers av forskjellige mus vev), vi vurdert SIN RBP-interactome med incPRINT. Full-lengde Firre transkripsjon merket MED MS2 ble uttrykt ∼40 ganger høyere enn endogen FIRRE i HEK293T celler som brukes for incPRINT (Supplerende Fig. 2a). Som rapportert for endogen transkript19, Firre-MS2 var fortrinnsvis lokalisert til kjernen (Supplerende Fig. 2b). Avhør vårt bibliotek av ~3000 proteiner, incprint identifisert et sett av spesifikke proteiner Som Firre interactors(Fig. 3a, røde prikker; Supplerende Data 1), mens flertallet av proteinene ikke interagerte Med Firre (Fig. 3a, grå prikker; Supplerende Data 1). Det er viktig at incPRINT identifiserte både kjente og nye Firre-interagerende proteiner. CTCF og HNRNPU, tidligere rapportert av to uavhengige studier for å binde Firre og være viktig for funksjonen19, 20, ble også identifisert av incPRINT(Fig . 3a). For å validere binding av nye Firre interactors, analyserte vi KODE eCLIP data21. ECLIP-dataene, tilgjengelig for syv incPRINT-identifiserte Firre-interagerende RBPs, bekreftet deres binding Til Firre i k562-cellelinjen, ytterligere validering av incPRINT-metoden (Supplerende Fig. 2c; Supplerende Data 2). I samsvar Med Firres rolle i kjernefysisk organisasjon19 var et sett Med Firre-interaktorer identifisert av incPRINT kromatinassosierte proteiner inkludert CHD1, POU5F1, JARID2, EPC1, SATB1, MECP2, AEBP2 og CTCF (Tilleggsdata 1). Proteindomeneanalyser viste at Firre-interagerende proteiner ble signifikant beriket for RNA-gjenkjenningsmotivet (Rrm) (Fig. 3b; Supplerende Data 3).
incPRINT identifiserer Firre-samvirkende proteiner. En Normalisert Firre-protein interaksjonsintensiteter i gjennomsnitt fra to biologiske replikater, sortert i økende rekkefølge. Den horisontale stiplede linjen representerer interaksjonsintensitets cutoff brukt til klassifisering Av Firre interactors. Røde prikker Er Firre-interagerende proteiner; grå prikker er proteiner som ikke binder Seg Til Firre. Proteiner enten kjent for å binde Seg Til Firre eller de som interaksjonen ble validert I ENCODE eCLIP data21 er indikert. Se Delen ‘Metoder’ for data normalisering. RLU er relative lysenheter. B Plott som viser antall incPRINT Firre-samspillende partnere som inneholder et Bestemt Pfam-domene vs.-log10 (P) av domenets berikelse. P-verdier ble beregnet ved hjelp av proporsjonstesten. Vist i blått er domener representert minst tre ganger i den nedtrekkte fraksjonen som har en korrigert P < 0.05. RRM-1 refererer Til Pfam-domenet PF00076. For alle Analyserte Pfam domener, se Supplerende Data 3.
for å avgjøre OM rna-overuttrykk var nødvendig for at incPRINT kunne identifisere proteiner som bindes TIL RNA med lave endogene nivåer, ble et sett med proteiner testet med forskjellige konsentrasjoner Av Firre-MS2 som spenner fra Overuttrykk som beskrevet ovenfor til nivåene sammenlignbare med endogen FIRRE i HEK293T-celler (Supplerende Fig . 2d, e). MENS rna overuttrykk resulterte i høyere interaksjon score slik at deres bedre separasjon fra bakgrunnen score, luciferase signalet var robust detekterbar over bakgrunnssignalet når fortynninger Av Firre-MS2 ble brukt (Supplerende Fig. 2d). Det er viktig at dette signalet ikke var forbundet med testproteinuttrykksnivåene(Supplerende Fig. 2e). Sammen viser disse dataene nytten av incPRINT ved å identifisere proteiner assosiert med transkripsjoner uttrykt ved lave endogene nivåer.
incPRINT identifiserer RNA-regionspesifikke interaksjonspartnere
Fordi mange lncrna fungerer som modulære stillas, slik at binding av spesifikke RBPs til diskrete RNA-domener1, 5, søkte vi å teste om incPRINT tillater identifisering AV RNA-domenespesifikke interaksjoner. Et ideelt proof-of-prinsippet molekyl er lncRNA Xist, gitt sin viktige rolle i pattedyr X-kromosom inaktivering (XCI)22,23, og dens modulære struktur og funksjon. Den ∼17 kb Lange Xist-transkripsjonen inneholder flere konserverte sekvensregioner (kalt gjentar A Til F) som utfører forskjellige funksjoner under xci-prosessen, inkludert initiering av gendeaktivering (a – gjentakelsen), vedlikehold Av x-inaktiv tilstand (F – og B-gjentakelsene) og riktig kromosomal lokalisering og fokalakkumulering Av Xist (C-og e-gjentakelsene)13,24,25,26,27,28,29,30,31,32 (Fig. 4a). Videre har flere uavhengige studier tidligere identifisert og validert et sett med funksjonelle proteininteraksjoner Med Full lengde Xist7,14,15,26,28,33,34,35. Vi søkte å bruke incPRINT til tre konserverte områder av mus Xist, dvs. Xist (A), Xist (F) og Xist (C) (Fig. 4a). Når det uttrykkes I HEK293T-celler brukt for incPRINT, viste Hvert Xist-MS2-fragment et annet uttrykksnivå sammenlignet med endogent Xist, som varierte fra en ∼60 ganger økning For Xist (A) til et nær endogent uttrykksnivå For Xist(C) (Supplerende Fig. 3a). Alle individuelle xist-MS2-fragmenter ble fortrinnsvis lokalisert til kjernen, på samme måte som deres endogene motstykke i full lengde (Supplerende Fig. 3b). Hvert Xist-område (dvs., Xist(A), Xist(F) og Xist (C)) ble forhørt med vårt bibliotek med ~3000 proteiner. For å sammenligne signaler på tvers av individuelle xist-regioner uttrykt på forskjellige nivåer (Supplerende Fig. 3c) ble interaksjonscorene for Hver Xist-region normalisert ved BRUK AV MS2 RNA-bindingsdata (Supplerende data 4). For normalisering ble et sett med 200 proteiner med topprangerte luciferase-score I MS2 RNA-datasettet definert som vanlige bindemidler av ALLE MS2-merkede Rna. De vanlige bindemidler ble deretter identifisert i hvert datasett og deres median interaksjon score ble beregnet for hver testet RNA og brukes til å normalisere rå luminescens intensiteter i hvert datasett (se ‘Metoder’ seksjon). SPESIELT, MS2 data ble ikke brukt SOM en bindende spesifisitet kontroll, så mange RBPs gjenkjenne lav kompleksitet RNA motifs36 stede også INNENFOR MS2 tag, og siden proteinbinding TIL MS2 ikke utelukke en potensiell funksjonell interaksjon med en test RNA. På samme måte Som Firre fant vi at flertallet av proteiner ikke bundet til noen Av de testede Xistfragmentene(Fig. 4b-d, grå prikker; Supplerende Data 4), mens spesifikke sett med proteiner ble identifisert for å interagere med hver enkelt Xist-region (Fig. 4b-d, røde prikker; Supplerende Data 4). Det er viktig at blant de incPRINT-identifiserte Xist-interaksjonsproteinene, fant vi kjente interaksjonspartnere Av Xist identifisert i tidligere studier for å binde full lengde transkript7,14,15 (angitt I Fig. 4b-d, Supplerende Tabell 1). Sammenligning av settene med incPRINT-identifiserte proteiner og deres interaksjonsskår for hver forhørt Xist-region (Supplerende Data 4), fant vi at hvert Xist-fragment interagerte med et sett med proteiner som er spesifikke for den tilsvarende regionen, med en mindre brøkdel Av RBPs-binding til alle Tre Xist-regionene(Fig. 4e). Dermed, bruke incPRINT til tre konserverte områder Av Xist aktivert identifikasjon og tildeling til bestemte RNA regioner Av RBPs tidligere bestemt for å binde Full lengde Xist transkript7,14, 15 (Fig . 4e; kjente xist-interagerende proteiner er angitt til høyre). IncPRINT identifiserte FOR eksempel SPEN som En Xist (A)-spesifikk interaktor (Fig. 4e), bekrefter tidligere funn 7, 8. PÅ samme måte ble RBM15, RBM15B og YTHDC1 identifisert av incPRINT for å samhandle spesifikt med Xist(A) Og Xist (F), men ikke Xist(C), og bekreftet deres rapporterte binding til 5′ slutten Av Xist7,9 (Fig. 4e). Videre identifiserte Vi En xist (C)-spesifikk interaksjon MED HNRNPU (OGSÅ KJENT SOM SAF-A) som tidligere har vist seg å være involvert I xist-lokalisering7,14,33 (Fig. 4e, Supplerende Tabell 1). FOR å validere Rna-regionspesifikke xist-protein-interaksjoner, KODE eCLIP data21 tilgjengelig for 14 incPRINT-identifiserte proteiner, hvorav flere er nye Xist-interagerende Rpber, bekreftet deres binding TIL XIST I k562-linjen (Supplerende Fig . 3d; Supplerende Data 2), ytterligere bekrefter spesifisiteten av vår metode. En funksjonell forskjell mellom proteininteraktomene i de tre xist-regionene ble bekreftet Av gene Ontology (GO) term anrikningsanalyser. I samsvar med differensialfunksjonene rapportert for de enkelte xist-regionene, Ble xist(A)- og Xist(F)-assosierte proteiner beriket for RBPs involvert i RNA-prosessering, mens C-repeat-regionen fortrinnsvis interagerte med DNA-bindende proteiner involvert i transkripsjonell regulering (Supplerende Fig. 3e, f). I samsvar MED GO-analysen viste proteindomeneanalysen At Xist (A)-interagerende proteiner ble beriket for SPOC (Spen paralog Og ortholog C-terminal) og RRM-proteindomener, Xist(F) – interagerende proteiner ble beriket FOR RRM-domenet og Xist(C) – interagerende proteiner viste ingen spesiell berikelse (Fig. 4f; Supplerende Data 3), ytterligere fremhever spesifisiteten av incPRINT-identifisert protein sett for Hver Xist region. I sammendraget hentet incPRINT vellykket kjente xist-proteininteraksjoner og avdekket nye RBPs. Ved å identifisere spesifikke sett med proteiner som interagerer med individuelle konserverte regioner i en modulær lncRNA, har vi vist at incPRINT muliggjør regionspesifikk tildeling AV RNA-proteininteraksjoner.
Proteiner identifisert for å interagere med forskjellige regioner av lncRNA Xist. En Skjematisk fremstilling av mus Xist transkripsjon og Dens a-Til F-konserverte gjenta regioner. Eksoner er angitt som bokser, introner som linjer. Et zoombilde av 5 ‘ – regionen I Xist viser posisjonene Til xist-fragmenter langs xist-transkripsjonen. Fragmentene 0,9 kb, 2 kb og 1,7 kb for Henholdsvis xist(a), xist(F) og xist(C) som brukes i incPRINT-eksperimentene, er avgrenset av horisontale fargede streker. B Normalisert Xist (A)-proteininteraksjonsintensiteter i gjennomsnitt fra to biologiske replikater, sortert i økende rekkefølge. Den horisontale stiplede linjen representerer interaksjonsintensitets cutoff som brukes til klassifisering Av xist (A) interaktorer. Røde prikker Er Xist (A)-interagerende proteiner; grå prikker er proteiner som ikke binder Seg Til Xist (A). Utvalgte proteiner kjent for å binde Seg Til Xist er indikert. Se Delen ‘Metoder’ for data normalisering. RLU er relative lysenheter. c Som i (b), for Xist (F). d Som i (b), for Xist (C). E Heatmap viser interaksjonsintensiteter Mellom Xist (A), Xist (F) og Xist (C). Tidligere oppdagede Xist-interagerende proteiner er angitt til høyre. RLU er relative lysenheter. f Som I Fig. 3b, for xist(A), Xist(F) og xist (C) interaksjonspartnere. SPOC refererer Til Pfam-domenet PF07744.
incPRINT identifiserer funksjonelle rna–protein-interaksjoner
Fordi Xist har en godt karakterisert cellulær funksjon i gendeaktivering under XCI, søkte Vi å teste om Noen Av Xist-protein-interaksjonene avdekket ved hjelp av incPRINT er funksjonelt relevante. Fokuset var PÅ zzz3-proteinet, som interagerer med alle tre testede xist-regioner, og RBM6, som viser mer spesifikk binding Til xist(A) og Xist (F) – regionene (Fig. 4e). Først bekreftet vi samspillet Mellom Xist og RBM6 og ZZZ3 under endogene forhold ved å teste xist co-nedbør med begge proteiner i musembryonale stamceller. Proteinene BLE HA-merket i polymorfe TX1072 ES cellelinje som muliggjør doxycycline-indusert Xist uttrykk, utløser XCI i fravær av differensiering31,37,38, 39. Rna-immunopresipitasjon (RIP) etter doksycyklininduksjon Av Xist og UV-kryssbinding av celler etterfulgt av qrt-PCR-analyser identifiserte en signifikant anrikning Av xist-transkripsjonen med rbm6-og ZZZ3-proteiner, som bekrefter deres interaksjon in vivo (Fig . 5a, b). Spesielt identifiserte incPRINT OGSÅ RBM6 som samspill med Firre. RIP qRT-PCR oppdaget en spesifikk interaksjon Av Firre med Rbm6, men ikke MED ZZZ3, og bekreftet Dermed Firre-RBM6-bindingen under endogene forhold og ytterligere validering av våre incPRINT-resultater (Fig. 5a, b).
RBM6 OG ZZZ3 kreves for XCI in vivo. en RNA immunoprecipitation (RIP) AV HA-merket RBM6 protein. Venstre panel, western blot FOR RMB6. Høyre panel, rna nivåer av de angitte transkripsjoner i inngangen og i immunoprecipitated eluates. Alle anrikninger normaliseres TIL GAPDH mRNA og til inngangsprøven. HVERT RIP-eksperiment ble utført på to uavhengige biologiske replikater. Data er presentert som gjennomsnitt s. d.; uparede t-tester: * * P < 0,01. b rna immunoprecipitation (RIP) AV HA-merket zzz3 protein. Venstre panel, western blot FOR ZZZ3. Høyre panel, rna nivåer av de angitte transkripsjoner i inngangen og i immunoprecipitated eluates. Alle anrikninger normaliseres TIL GAPDH mRNA og til inngangsprøven som beskrevet i ‘Metoder’ – delen. HVERT RIP-eksperiment ble utført to ganger på uavhengige biologiske replikater. Data er presentert som gjennomsnitt s. d.; uparede t-tester: **P < 0,01; *P < 0,05, ikke signifikant (ns). Full blotter er gitt som En Kilde datafil. C Representative RNA-FISKEBILDER Av xist-induserte celler ved uttømming av de indikerte proteinene. Xist vises i rødt og Den x-koblede genlampen2 i grønt. Den stiplede linjen avgrenser cellekjerner. Stjerner indikerer Lamp2-uttrykk fra det aktive X-kromosomet. Pilspisser indikerer Lamp2 uttrykk fra det inaktive X-kromosomet som unnslipper XCI. Skala barer, 5 µ. D Kvantifisering av celler med bi – Allelisk Lamp2 uttrykk vurdert MED RNA FISK og uttrykt som fold ratio over RLuc kontroll. Data fra tre uavhengige eksperimenter er representert som gjennomsnitt s. d.; Studentens T-tester: ** P< 0,01; *P < 0,05; ikke signifikant (ns). Stiplede linjen avgrenser nivået Av RLuc.
For å teste OM RBM6 OG ZZZ3 har innvirkning PÅ XCI, brukte vi enkeltcelle rna fluorescerende in situ hybridisering (RNA FISK)for å vurdere uttrykket av endogen Lamp2, Et x-bundet gen som normalt blir tavlet under XCI-initiering40. Ved doksycyklinindusert xist-uttrykk, uttømming Av Rbm6, Zzz3 og Positiv kontroll (Supplerende Fig. 4a, b) førte til redusert lyddemping Av Lamp2, mens DET xci-induserte mono-alleliske uttrykket forble uendret ved uttømming Av Thap7, som ikke interagerte Med Xist og ble brukt som en negativ kontroll (Fig. 5c, d; Supplerende Fig. 4c; Supplerende Tabell 2). I fravær Av Xist (-doksycyklin-tilstander) forble Lamp2-ekspresjonen uendret ved uttømming av proteinene ovenfor (Supplerende Fig. 4d; Supplerende Tabell 2). Viktigere, defekter I x-kromosom silencing ble ikke utløst av endret ekspresjon Av Xist / Tsix ved uttømming av de enkelte proteiner(Supplerende Fig. 4e). I sammendraget viser identifikasjonen av funksjonelt viktige interaktorer blant incPRINT-identifiserte RBPs incPRINT potensial for oppdagelse.
