human celleoverflatemarkør screening

hESC-og hPSC-rpe-celler ble dissosiert i enkeltceller ved Bruk Av TrypLE i 5-10 min. Optiske vesikler ble dissosiert i enkeltceller ved Hjelp Av TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) i 10 min, etterfulgt av fysisk dissosiasjon gjennom en 20 G nål. Å tillate samtidige analyse av disse ulike populasjoner i samme prøve, hESC, hPSC-RPE celler, og optiske vesicle celler ble merket med CellTrace™ CFSE (0.25 µM) for 7 min ved 37 °C eller CellTrace™ Violet (5 µM) i 20 min ved 37 °C i henhold til produsentens protocol (Thermo Fisher Scientific). Deretter ble de tre celletypene farget ved HJELP AV Bd Lyoplate™ Screening Paneler (BD Biosciences) etter produsentens protokoll. Strekkodingen av celler tillot å skille lett mellom de tre gruppene av celler og for å minimere prøvevariabilitet under screeningen. Prøver ble analysert på 96-brønnplater på En LSRFortessa utstyrt med 405, 640, 488, 355 og 561 nm lasere (BD Biosciences) eller En CytoFLEX utstyrt med 405, 638, 488 og 561 nm lasere (Beckman Coulter). Ikke-levedyktige celler ble ekskludert fra analysen ved bruk av 7-AAD (7-aminoaktinomycin D) nukleinsyrefarge (BD Biosciences). Analyse av dataene ble utført ved Hjelp Av FlowJo v. 10-programvaren (Tree Star). Celleoverflatemarkørskjermen ble utført en gang FOR 3d optiske vesikler, og en gang for hPSC-RPE dag 60.

Cellekultur

hesc linjene HS980 OG HS983 ble tidligere avledet og dyrket under xeno-frie og definerte betingelser30 (Swedish Ethical Review Authority: 2011/745:31/3). Givere ga sitt informerte samtykke til avledning og påfølgende bruk av hesc linjene. WA09 / H9 hesc-linjen ble hentet Fra Wicell og ble tilpasset materfri kultur på hrLN-521 (10 µ/mL, Biolamina). Cellene ble opprettholdt ved klonal forplantning på hrLN-521-belagte plater I NutriStem hPSC XF medium (Biological Industries), i en 5% CO2/5% O2 inkubator, og gikk enzymatisk ved 1:10 ratio hver 5-6 dager.hiPSC-linjene CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I og CTRL-14-II ble gitt av karolinska Institutet iPSC Core facility (Swedish Ethical Review Authority).: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Givere ga sitt informerte samtykke til avledning og påfølgende bruk av hiPSC-linjene. Cellene ble opprettholdt ved klonal forplantning på hrLN-521-belagte plater (Biolamina) I NutriStem hPSC XF medium (Biologisk Industri), i en 5% CO2/5% O2 inkubator og passert enzymatisk ved 1:10 ratio hver 5-6 dager.

ved passering ble konfluente kulturer vasket to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) uten Ca2+ og Mg2+ og inkubert i 5 min ved 37 °C, 5% CO2 / 5% o2 med TrypLE Select. Enzymet ble deretter forsiktig fjernet og celler ble samlet i fersk forvarmet NutriStem hPSC XF medium ved forsiktig pipettering for å oppnå en enkeltcellesuspensjon. Cellene ble sentrifugert ved 300 × g i 4 min, pelleten resuspendert i fersk forvarmet NutriStem hPSC XF medium, og celler belagt på en ny hrLN-521-belagt tallerken. To dager etter passasje ble mediet erstattet med fersk forvarmet NutriStem hPSC XF medium og endret daglig.

hpsc-RPE monolayer differensiering

en trinnvis protokoll som beskriver differensieringsprotokollen kan bli funnet På Protocol Exchange36. hESC eller hiPSC ble belagt med en celletetthet på 2,4 × 104 celler / cm2 på laminindrasjerte retter (20 µ/mL) ved Bruk Av NutriStem hPSC xf medium. Rhokinasehemmer (Y-27632, Millipore) med en konsentrasjon på 10 µ ble tilsatt i løpet av de første 24 timene, mens celler ble oppbevart ved 37 °C, 5% CO2/5% O2. Etter 24 timer ble hPSC medium erstattet med differensiering medium NutriStem hPSC XF uten grunnleggende fibroblastvekstfaktor (bFGF) og transformerende vekstfaktor-β (TGFß) (Biologisk Industri) og celler ble plassert på 37 °c, 5% CO2 / 21% O2. Fra dag 6 etter plating ble 100 Ng/mL Activin A (R&D-Systemer) lagt til media. Cellene ble matet tre ganger i uken og holdt i 30 dager. Monolag ble deretter trypsinisert ved Hjelp Av TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) i 10 minutter ved 37 °C, 5% CO2. Enzymet ble forsiktig fjernet og cellene ble samlet i fersk forvarmet NutriStem hPSC XF medium uten bFGF og TGFß ved skånsom pipettering for å oppnå en enkeltcellesuspensjon. Cellene ble sentrifugert til 300 hryvnias g i 4 min, pelleten ble resuspendert, passert gjennom en cellesil (ø 40 µ, BD Biovitenskap), og celler ble seedet på laminindrasjerte retter (hrLN-111 og hrLN-521 ved 20 mg/mL) med forskjellige celletettheter fra 1,4 × 106 til 1,4 × 104 celler/cm2. Replikerte celler ble matet tre ganger i uken i løpet av de påfølgende 30 dagene med NutriStem hPSC xf medium uten bFGF og TGFß. For hPSC-RPE in vitro differensiering I 3d suspensjon EBs, fulgte vi vår tidligere publiserte protocol10. Kort sagt ble pluripotente stamceller dyrket for å samvirke på rhLN-521 og manuelt skrapt for å produsere EBs ved hjelp av en 1000 µ pipettespiss. EBs ble deretter dyrket i suspensjon i lave festeplater (Corning) med en tetthet på 5-7 × 104 celler/cm2. Differensiering ble utført i skreddersydd NutriStem hESC XF medium hvor bFGF og TGFß er eliminert med medieskift to ganger i uken. Ti mikromoler Av Rho-kinaseinhibitor (Y-27632, Millipore) ble tilsatt til suspensjonskulturer bare i løpet av de første 24 h. etter 5 ukers differensiering ble pigmenterte områder mekanisk kuttet ut Av EBs ved hjelp av en skalpell. Cellene ble deretter dissosiert Ved Hjelp Av TrypLE Select, etterfulgt av spyling gjennom en 20 G nål og sprøyte. Celler ble sådd gjennom en cellesil (ø 40 µ, BD Biovitenskap) på LN-belagte retter med en celletetthet på 0.6-1, 2 × 104 celler / cm2 og matet to ganger i uken med samme differensieringsmedium som nevnt ovenfor. Lyse feltbilder ble tatt med Et Nikon Eclipse TE2000-s-mikroskop og Et Canon sx170 IS-kamera ble brukt til å fange pigmentering fra toppen av brønnene.

Kvantitativ sanntids PCR

Totalt RNA ble isolert ved Hjelp Av Rneasy Plus Mini Kit og behandlet Med Rnase-Fri DNase (begge Fra Qiagen). Komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert ved bruk av 1 µ av totalt RNA i 20 µ reaksjonsblanding, inneholdende tilfeldige heksamerer OG Hevet III revers transkriptase (Gibco, Invitrogen), i henhold til produsentens instruksjoner.

Flowcytometri

cellesortering ble utført på hpsc-rpe-kulturer etter 21 eller 30 dagers differensiering. Celler ble inkubert med de nevnte konjugerte antistoffene på is i 30 min. FMO-kontroller ble inkludert for hver tilstand for å identifisere og gate-negative og positive celler. Fargede celler ble deretter sortert ved HJELP AV EN BD FACS Aria Fusion Cell Sorter (BD Biosciences) ved Hjelp Av FACSDiva Sofware v8. 0. 1.

rett etter sortering ble 70 000 celler fortynnet i 100 µ på 2% FBS og 1 mM EDTA (Sigma) cytospinned i 5 min ved 400 omdreininger per minutt på glassglass. Lysbildene ble igjen tørket over natten ved romtemperatur, etterfulgt av fiksering med 4% metanolfri formaldehyd ved romtemperatur i 10 min og immunfluorescensfarging.

Immunfluorescens

Histologi og vev immunosta

Umiddelbart Etter eutanasi ved intravenøs injeksjon av 100 mg/kg pentobarbital (Allfatal vet. 100 mg/mL, Omnidea), øynene ble enucleated og bleb injeksjonsområdet merket med grønt Vev Merking Fargestoff (TMD) (Histolab Produkter). En intravitreal injeksjon av 100 µ fikseringsløsning (FS) bestående av 4% bufret formaldehyd (Solvenco AB) ble utført før fiksering I FS i 24-48 timer, og innebygging i paraffin. Fire mikrometer serielle seksjoner ble produsert gjennom TMD-merket område og hver fjerde seksjoner ble farget med hematoksylin-eosin.

for immunisering ble lysbilder deparaffinisert i xylen, dehydrert i graderte alkoholer og skyllet med ddH2O Og Tris-bufret Saltvann (TBS, pH 7,6). Antigenhenting ble oppnådd i 10 mM citratbuffer (trisodiumsitratdihydrat, Sigma-Aldrich, pH 6,0) med 1:2000 Tween-20 (Sigma-Aldrich) ved 96 °C i 30 min, etterfulgt av 30 min avkjøling ved romtemperatur. Slides ble vasket MED TBS og blokkert i 30 min med 10% normalt eselserum (Abcam) fortynnet i TBS inneholdende 5% (w/v) IgG og proteasefritt bovint serumalbumin (Jackson Immunoresearch) i et fuktet kammer. Primære antistoffer fortynnet i blokkeringsbuffer ble inkubert over natten ved 4 °c: humant nukleært mitotisk apparatprotein (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Bioteknologi sc-432) og CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Bioteknologi sc-7326, klon ) (Tilleggsdata 2). Sekundære antistoffer (esel anti-kanin IgG (H + L) Alexa Fluor 555 A31572 Og esel anti-mus IgG (H + L) Alexa Fluor 647 A31571, begge fra Thermo Fisher Scientific) (Supplerende Data 2) fortynnet 1: 200 i blokkeringsbuffer ble inkubert 1 time ved romtemperatur. Seksjoner ble montert med vector Vectashield MED DAPI ((4′,6-diamidino-2-fenylindol)) monteringsmedium (Vector Laboratories) under en 24 × 50 mm2 dekkglass.

for immunhistokjemi ble lysbilder deparaffinisert etterfulgt av antigen henting (er2 løsning, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) og farging (IHC Protokoll F) For CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Bioteknologi sc-432) og CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Bioteknologi sc-7326, klon ) antistoffer (Supplerende Data 2) På Bond RXm instrument (Leica Biosystems).Bildene ble tatt Med Olympus Ix81 fluorescens invertert mikroskop Eller Zeiss LSM710-NLO punkt skanning confocal mikroskop. Etter oppkjøpet analyse av bildene ble utført ved Hjelp Av ImageJ programvare.

Fagocytose analyse

Fluorescein isotiocyanat-merket bovin POSs ble isolert og vennlig gitt Av Dr. Ef Nandrot Fra Institut de La Vision, Paris37. hpsc-rpe-celler ble dyrket på transwell membran (0,33 cm2, Corning) belagt med hrLN-521 20 µ / mL i 1 måned etter sådd. Cellene ble inkubert ved henholdsvis 37 °C eller 4 °C i 16 timer med 2,42 × 106 tint POS/Transwell fortynnet i DMEM (Dulbecco ‘s modifiserte Eagle’ s medium) eller CO2-uavhengige medier (begge fra Thermo Fisher Scientific). Etter inkubasjon ble celler slukket med Trypanblå Løsning 0.2% (Gibco, Invitrogen) i 10 min ved romtemperatur, fast med 4% metanolfri formaldehyd (Polysciences) ved romtemperatur i 10 min, og permeabilisert med 0,3% Triton X-100 I D-PBS i 15 min. Rhodamin phalloidin farging (1: 1000, 20 min ved romtemperatur, Biotinum 00027) (Supplerende Data 2) ble brukt til å visualisere cellegrensene. Kjerner ble farget Med Hoechst 33342 (1:1000, 20 min ved romtemperatur, Invitrogen).

Bildene ble kjøpt Med Zeiss LSM710-NLO punkt skanning confocal mikroskop. Etter oppkjøpet analyse av bildene ble utført Ved Hjelp Av Imaris (Bitplane) OG POS quantifications ble gjort Med CellProfiler 2.1.1 programvare. Moduler som brukes: LoadImages, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, MeasureObjectSizeShape, SaveImages og ExportToSpreadsheet. Objekter ble identifisert med en typisk diameter på 10-40 piksel enheter ved Hjelp Av To Klasser, Global, Otsu, Vektet varians terskel metode med 0,01 og 1,0 nedre og øvre grenser, og 2,1 korreksjonsfaktor, med klumper objekter preget av intensitet.

Enzymbundet immunosorbentanalyse

hpsc-rpe-celler ble dyrket På Transwellmembraner (0,33 cm2, Millipore) belagt med forskjellige substrater. Supernatanter fra både hPSC-rpe apikale og basale sider (som betyr henholdsvis øvre og nedre rom i transwell) ble samlet 60 h etter at mediet ble endret. PEDF sekresjonsnivåer ble målt i triplikater for hver tilstand med kommersielt tilgjengelige HUMANE PEDF ELISA-Sett (BioVendor RD191114200R) ble brukt, i henhold til produsentens instruksjoner, etter 60 dager med kultur. Den optiske tettheten Sreadings ble målt Ved Hjelp Av SpectraMax 250 Mikroplate Leser (Molekylære Enheter). Resultatene presenteres som middelmådig sem.

TEER målinger

Transepitelial elektrisk motstand RPE celler belagt På Transwells (0.33 cm2, Millipore) ble målt ved Hjelp Av Millicell Elektrisk Motstand system volt-ohm meter (Millicell ERS-2, Millipore), i henhold til produsentens instruksjoner. Sixty-dagers kulturer ble equilibrated utenfor inkubatoren ved romtemperatur i 15-20 min før forsøket. Målinger ble utført i uendret kulturmedier i tre eksemplarer for hver tilstand, ved tre forskjellige posisjoner i hver brønn. Gjennomsnitt ble brukt til videre analyse. Bakgrunnsmotstanden ble bestemt fra en tom kulturinnsats i samme media belagt med det tilsvarende substratet, men uten celler, og trukket fra den respektive eksperimenttilstanden. Målinger rapporteres som motstand i ohm ganger arealet i kvadratcentimeter (Ω × cm2). Resultatene presenteres som middelmådig sem.

skanningelektronmikroskopi

hpsc-rpe-celler ble dyrket på transwellinnlegg belagt MED LN521 (20 µ / mL) i 60 dager. De ble løst ved nedsenkning i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 m fosfatbuffer, pH 7,4. Transwell membranen ble kuttet ut og vasket I MilliQ vann før trinnvis etanol dehydrering og kritisk punkt-tørking ved hjelp av karbondioksid (Leica EM CPD 030). Innsatser ble montert på prøvestubber ved hjelp av karbonlimtapper og sputter belagt med et tynt lag platina (Quorum Q150T ES). Skanningelektronmikroskopibilder ble anskaffet ved Hjelp Av Et Ultra 55 feltutslippsskanningelektronmikroskop (Zeiss, Oberkochen, Tyskland) ved 3 kV og SE2-detektoren.

transmisjonselektronmikroskopi

hpsc-rpe-celler ble dyrket på transwellinnlegg belagt MED LN521 (20 µ / mL) i 60 dager. De ble løst ved nedsenkning i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 m fosfatbuffer, pH 7,4. Transwellmembranen ble skåret ut og i tynne strimler, skyllet i 0,1 m fosfatbuffer, etterfulgt av postfiksering i 2% osmiumtetroksid i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4, ved 4 °C i 2 timer. Membranstrimlene ble utsatt for trinnvis etanol dehydrering og til slutt flat innebygd I LX-112. Ultratynne seksjoner (~50-60 nm) ble fremstilt ved Bruk Av En Leica EM UC7 og kontrastert med uranylacetat, etterfulgt av blysitrat. Overføring elektronmikroskop avbildning ble gjort På En Hitachi HT7700 overføring elektronmikroskop (Hitachi High-Technologies) drives på 80 kV og digitale bilder ble kjøpt ved Hjelp Av En Veleta CCD kamera (Olympus Soft Imaging Solutions).

encellede rna-sekvenserende bioinformatiske analyser

Seksti-dagers hpsc-RPE-celler ble dissosiert ved Hjelp Av TrypLE Select og passert gjennom en cellesil (ø 40@m, Bd Biovitenskap). De ble resuspendert med en konsentrasjon på 1000 celler/µ i 0,04% BSA i PBS. Cellene ble transportert ved 4 °C til Det Eukaryotiske Enkeltcellegenomiske Anlegget (ESCG, SciLifeLab, Stockholm, Sverige) hvor et 3 ‘ cDNA-bibliotek ble forberedt for encellet RNA-sekvensering med 10x Genomics-plattformen (10x Genomics) ved Hjelp Av NovaSeq 6000-programvaren. Cell Ranger 2.1.1 (10x Genomikk) rørledning ble brukt til å konvertere Illumina base call filer til fastq format, justere sekvensering leser til HG19 transkriptome ved HJELP AV STAR aligner38, og generere funksjon-strekkode matriser. Cell Ranger kvalitetskontroll filtrerte celler (718, 810, 931, og 1129 celleholdige dråper ble tatt For CD140b+GD2 -, CD140b+CD184−, replated 1:20 og hESC prøver, henholdsvis) ble analysert i r versjon 3.5.1 (R Core Team)39, ved Hjelp Av Seurat suite versjon 2.3.440, 41. Som en ytterligere kvalitetskontroll tiltak, RPE celler med unikt uttrykk av gener (≥2000 ≤5000), UMIs (≥10.000 for å ≤30,000) og prosentandel av UMI kartlegging for å MT gener (≥0.025 ≤0.10) ble valgt. På samme måte, hESC med unikt uttrykk av gener (≥2000 ≤8000), UMIs (≥10.000 for å ≤80,000), og andelen av UMI kartlegging for å MT gener (≥0.025 ≤0.10). Dette filtreringstrinnet resulterte i endelig datasett av 616, 725, 779 og 905 celler for Henholdsvis CD140b+GD2−, CD140b+CD184−, replated 1:20 og hESC-prøver. Før dimensjonalitet reduksjon av hovedkomponent (PC) analyse, celle-celle variasjon i genuttrykk drevet Av UMIs, mitokondrie genuttrykk, og celle-syklus stadier ble regressed ut under data skalering process42. Variable gener i rpe-prøver ble valgt ut fra deres normaliserte gjennomsnittlige uttrykk og dispersjon (expression cut-off = 0.0125–5, og bottom dispersion cut-off = 0.5). FOR PC-valg ble funn av Pucheatmap, jackStraw, PC-standardavvik og Clustree-analyse evaluert43. De første 15 Pcene ble brukt til tSNE-projeksjonen44 og clustering analyse(oppløsning = 0,1, forvirring = 40).

Celleklynger ble analysert ved to tilnærminger. Toppdifferensielle gener ble først identifisert for hver klynge ved Hjelp Av Wilcoxons rank-sum-test. Sekundær, signaturgenuttrykk (modulpoeng) ble beregnet for utifferentiert hESC og flere celletyper tilstede i human retina. Celler som uttrykker mesoderm markører ble manuelt delt inn i en egen klynge ved hjelp av interaktive plotting funksjoner Av Seurat. Data lastes opp I ArrayExpress(EMBL-EBI) – se detaljer nedenfor.

Dyr

etter godkjenning Fra Northern Stockholm Animal Experimental Ethics Committee (DNR N25/14) ble det brukt 10 Newzealandske hvite albinokaniner (levert Av Lidkö kaninfarm, Lidkö, Sverige) i alderen 5 måneder, som veide 3,5 til 4,0 kg i denne studien. Alle eksperimenter ble utført i samsvar med Erklæringen om Bruk Av Dyr i Oftalmisk Og Visjonsforskning.

Subretinal transplantasjon

hpsc-rpe monolag ble vasket MED PBS, inkubert Med TrypLE, og dissosiert til enkeltcellesuspensjon. Cellene ble talt i Et Neubauer hemocytometerkammer ved bruk av 0,4% Trypanblått (Thermo Fisher Scientific Corp.), sentrifugert ved 300 × g i 4 min, og cellepellet ble resuspendert i nyfiltersteriliserte PBS til en endelig konsentrasjon på 1000 celler / µ. Cellesuspensjonen ble så aseptisk aliquotert til 600 µ enheter og holdt på is til kirurgi.

Dyr ble satt under generell anestesi ved intramuskulær administrering av 35 mg/kg ketamin (Ketaminol, 100 mg / mL, Intervet) og 5 mg/kg xylazin (Rompun vet. 20 mg/mL, Bayer Animal Health) og pupillene ble utvidet med en blanding av 0,75% cyklopentolat / 2,5% fenylefrin (APL). Mikrokirurger ble utført på begge øyne ved hjelp av en 2-port 25 G transvitreal pars plana teknikk (Alcon Accurus, Alcon Nordic)som beskrevet tidligere45. Cellesuspensjonen ble trukket inn i en 1 mL sprøyte koblet til et forlengelsesrør og EN 38g polytipkanyle (MedOne Surgical Inc). Uten tidligere vitrektomi ble kanylen satt inn gjennom den øvre temporale trokaren. Etter riktig spissposisjonering, fastslått av en fokal retinal flare, ble 50 µ av cellesuspensjon (tilsvarende 50 000 celler) injisert sakte subretinalt ~6 mm under den dårligere marginen til optisk nervehodet, og dannet en jevn bleb som var tydelig synlig under operasjonsmikroskop. Det ble tatt vare på å opprettholde spissen i bleb under injeksjonen for å minimere refluks. Etter instrumentfjerning ble det påført lett trykk på de selvforseglende suturfrie sclerotomiene. To mikrogram (100 µ) intravitreal triamcinolon (Triescence, Alcon Nordic) ble administrert 1 uke før operasjonen, og det ble ikke gitt postkirurgiske antibiotika.

Statistikk og reproduserbarhet

for statistiske analyser ble toveisanalyse av varians og post hoc multiple sammenligninger ved Bruk Av Tukeys testkorreksjon utført for å vurdere in vitro-forskjellene i de ulike tetthetene som ble vurdert og sortert versus replerte forhold i teer-og PEDF-sekresjonsanalyser.

alle kvantifiseringer ble utført avblindet. Statistiske parametere inkludert definisjoner og eksakte verdien av n (f. eks totalt antall eksperimenter, replikasjoner, etc.), avvik, p-verdier og typene av de statistiske testene er rapportert i tallene, de tilsvarende figurlegendene, og i denne delen. Statistisk analyse ble utført ved Hjelp Av Prism 7 (GraphPad Software, versjon 7.0 c). I alle tilfeller ble statistisk analyse utført på data fra minst tre biologisk uavhengige eksperimentelle replikater. Sammenligninger mellom grupper ble planlagt før statistisk testing og måleffektstørrelser var ikke forhåndsbestemt. Feilfelt som vises på grafer, representerer gjennomsnittlig sem av minst tre uavhengige eksperimenter. Alle micrographs vist er representative bilder av tre uavhengige eksperimenter, med mindre annet er angitt (F.Eks Fig. 1c).

Rapporteringssammendrag

Ytterligere informasjon om forskningsdesign er tilgjengelig I Nature Research Reporting Summary knyttet til denne artikkelen.