Utnyttelse AV ATP-analoger ved konstruerte CDKs
vi genererte mutante ‘Shokat’ – Cdker som inneholder aminosyreutveksling ved en konservert stor rest i DERES ATP-bindingslommer. FOR CDK2 og CDK3 var dette en fenylalanin til alanin-utveksling i posisjon 80, betegnet CDK2 (F80A). Vi syntetiserte også 12 ATP-analoger for å avgjøre om de konstruerte Cdkene kan bruke disse analogene til fosforylat rekombinant Retinoblastom (Rb) protein in vitro, og fant at De utnyttet N6-(2-fenyletyl)-ATP (PE-ATP) mest effektivt (Figur 1a, og data ikke vist). Selv om både wild-type OG cyclin E-CDK2 (F80A) brukte normal ATP til fosforylatglutation-S-transferase (GST)-Rb-protein, kunne BARE F80A-kinasen bruke PE-ATP. Lignende resultater ble oppnådd med cyclin E-CDK3, men i dette tilfellet kunne f80a mutanten ikke lenger bruke normal ATP, selv om det strukturelle grunnlaget for denne observasjonen er uklart (Figur 1a). Disse studiene bekreftet at villtype og konstruerte kinaser viser de ønskede ATP-spesifikasjonene.
Karakterisering av de konstruerte Cdkene. (A) Cyklin E-CDK2/3-komplekser, eller DERES f80a-konstruerte motstykker (indikert med stjerner), ble immunopresipitert fra transfiserte u2os-cellelysater via HA-tag på CDK-underenheten og utsatt for in vitro-kinaseanalyser med 10 µ av enten normal ATP-eller PE-ATP-analog. Fosforylering AV GST-Rb ble overvåket ved immunoblotting med et fosfospesifikt anti-pS780 – Rb antistoff (New England Biolabs). Wild-type kinaser kan ikke bruke PE-ATP. (B) Tynnsjiktskromatografi-analyse avslører hydrolyse AV ATP i cellelysat og overføring til akseptornukleotider (venstre). Posisjonene til fritt fosfat og ATP er indikert. ATP-γ-S hydrolyseres derimot ikke i cellelysater (til høyre). (c) Kinaseanalyser ble utført ved bruk av villtype-og cyklin A-CDK2-komplekser (F80A) renset fra E. coli og GST-Rb i nærvær av 200 µ ATP, ATP-γ-S og PE-ATP-γ-s ved romtemperatur i 2 timer. Kinasereaksjoner ble analysert VED sds gelelektroforese og visualisert ved Coomassie-farging. Omfanget AV gst-rb fosforylering ble overvåket av elektromobilitet skift AV GST-Rb.
mens mutant CDKs effektivt brukte PE-ATP til fosforylat Rb in vitro, mislyktes lignende eksperimenter ved bruk av radiomerket PE-ATP i cellelysater fordi det merkede fosfatet ble spaltet FRA PE-ATP ved En atpaseaktivitet i lysatene (data ikke vist). Vi byttet derfor til TIOFOSFATFORMEN AV ATP-analogen (PE-ATP-γ-S), som ikke ble hydrolysert av lysater (Figur 1b). Selv om kinaser ofte bruker ATP-γ-S mindre effektivt enn NORMALT ATP, har tiofosforylering flere fordeler i denne sammenheng. For det første er tiofosfater mer stabile og resistente mot fosfataser . For det andre, siden det ikke er noen eksisterende tiofosforyleringshendelser i cellene, gir tiofosfatmerking unike markører for proteiner fosforylert av mutantkinasen. Endelig har tiofosfatgruppen lignende kjemiske egenskaper som sulfhydrylgruppen og er egnet til kjemiske modifikasjoner. Vi uttrykte og renset oppløselige villtype-og cyklin A-CDK2-komplekser (F80A) fra bakterier og utførte en lignende rb-kinase-analyse for å teste deres evne TIL Å bruke PE-ATP-γ-S. Som vist i Figur 1c, selv om BEGGE kinaser kan bruke ATP eller ATP-γ-S til å fosforylere GST-Rb-protein (som indikert ved dets elektromobilitetsskifte), kan BARE f80a-mutanten bruke PE-ATP-γ-S. VI brukte DERMED PE-ATP-γ-S til alle våre etterfølgende studier.
Enkeltrinns rensing av tiofosforylerte peptider
bruken Av konstruerte Cdk-er og ATP-analoger muliggjør svært spesifikk substratfosforylering: den neste utfordringen er hvordan man identifiserer dem i et komplekst lysat. Vi søkte å utnytte tiofosfatkodene for å kovalent fange og berike tiofosforylerte peptider etter fosforylering og fordøyelse av lysatene. Et sentralt problem var imidlertid å kjemisk skille mellom tiofosfopeptider og cysteinholdige peptider. Selv om en kjemoselektiv metode for berikelse av tiofosfopeptider er beskrevet, gjør den overveldende overflod av cysteinrester i en kompleks proteinblanding denne tilnærmingen vanskelig . Vi brukte en enkel fangstmetode for å selektivt isolere tiofosforylerte peptider i trypsiniserte cellelysater (Figur 2a). Proteiner i lysatet ble fosforylert in vitro med cyklin A-CDK2 (F80A) og PE-ATP-γ-S. proteinblandingen ble deretter fordøyd og de resulterende peptidene ble blandet Med Tiopropylsefarose 6B, en aktivert disulfidharpiks som fanger opp både cysteinholdige peptider og tiofosfopeptider gjennom en disulfidutvekslingsreaksjon. Fordi tradisjonell dithiothreitol (DTT) eluering frigjør begge typer bundet peptider, benyttet vi de kvalitative forskjellene mellom harpiksbundne tiofosfatpeptider og cysteinholdige peptider ved henholdsvis fosforotiolatesulfidbinding og alkyldisulfidbinding. Ved høye pH-verdier hydrolyseres fosforotiolatsulfidbindingen og alkyldisulfidet forblir intakt . Behandling av harpiksen med en sterk base (som natriumhydroksid) frigjør spesifikt tiofosfopeptider (og omdanner dem også til normale fosfopeptider), men ikke de cysteinholdige peptidene, ved hydrolysering av fosforotiolatesulfidbindingen (Figur 2b). Fordi peptider bundet via cystein ikke elueres i det siste trinnet, kan vi ikke gjenopprette cysteinholdige tiofosfopeptider. Videre resulterer elueringen i tap av tiofosfatsignaturen ved å omdanne tiofosfopeptidet til et fosfopeptid. Vår thiophosphopeptide isolasjonsmetode skiller seg beskjedent Fra Blethrow et al. ved at vi fanger tiofosfopeptidene ved hjelp av disulfidutvekslingskemi (disulfidharpiks) i stedet for alkylering (iodoacetamidharpiks), og vi selektivt eluerer dem med basehydrolyse i stedet for oksidasjon.
enkeltrinns rensing av tiofosfopeptider. (A) Generell ordning for tiofosfospeptidisolasjon. Proteiner ble merket med cyklin A-CDK2 (F80A) OG PE-ATP-γ-S og utsatt for tryptisk fordøyelse. De resulterende peptidene ble blandet med disulfidperler, som fanger både tiofosfopeptider og cysteinholdige peptider. Perlene ble deretter behandlet med basisk oppløsning for selektivt å frigjøre bare fosfopeptidene. (b) kjemien som ligger til grunn for tiofosfopeptidselektiviteten. Både tiofosfat-og cysteingrupper inneholder reaktive tiolgrupper som kan fanges kovalent av disulfidperler. Ved høye pH-verdier hydrolyseres fosforotiolatesulfidbindingene (nær den øvre pilen) for å tillate frigjøring av de perlebundne peptidene mens alkyldisulfidbindingene (nær den nedre pilen) er stabile og dermed holdes peptider på perlene. Legg merke til at under hydrolysen av fosforotiolatetsulfidbinding, tiofosfat omdannes til normalt fosfat.
for å teste muligheten for denne tilnærmingen fosforylerte VI GST-Rb MED cyclin A-CDK2 (F80A) og PE-ATP-γ-S, og brukte vår renseprosedyre til en trypsin-fordøyelse av reaksjonsblandingen. De isolerte peptidene ble analysert ved elektrospray tandem massespektrometri (ESI-MS/MS) ved hjelp av et ionfelle massespektrometer. Peptider ble identifisert ved å matche tandem massespektra til en human protein sekvens database (MED GST-Rb sekvens lagt til) ved HJELP AV SEQUEST programvare . Gst-rb-substratet inneholder fem cysteines samt syv SP / TP-steder, som er favoriserte FOR CDK-fosforylering . Vi gjenvunnet flere fosfopeptider som bare inneholdt og alle forventede fosforyleringssteder (Tabell 1). Videre gjenvunnet vi ingen cysteinholdige peptider og svært få ikke-spesifikke peptider. Dette ga et proof-of-prinsipp for våre store analyser.
Identifikasjon av humane syklin A-CDK2 substrater i cellelysater
Vårt mål var å identifisere potensielle syklin a-cdk2 substrater på proteom bred skala. For å redusere prøvekompleksiteten fraksjonerte VI hele cellelysatet AV HEK293-celler i 11-fraksjoner ved bruk av ionbytterkromatografi og ammoniumsulfatutfelling (Tilleggsdatafil 1). Vi utførte deretter in vitro kinase-analyser på hver fraksjon. Som en positiv kontroll la vi også en liten MENGDE GST-Rb til hver reaksjon. Etter å fordøye reaksjonsblandingen med trypsin, brukte vi vår rensingsprotokoll for å isolere tiofosfopeptidene fra peptidblandingene. De gjenvunnede peptidene ble utsatt for væskekromatografi-MS / MS-analyse og databasesøk. Vi gjenvunnet varierende antall peptider og minst Ett rb-fosfopeptid fra hver av lysatfraksjonene (Tilleggsdatafil 2).CDKs fosforylatproteiner på en prolin-rettet måte på enten serin eller treonin, og mange studier støtter ideen om at motivet S / T-P-X-R / K representerer CDK konsensusmotivet. Fra fosfopeptidene identifiserte vi totalt 203 proteiner: 180 kandidater ble fosforylert innenfor SP-eller TP-motiver (prolin-rettet; Tilleggsdatafil 3). Disse kandidatsubstratene representerer et bredt spekter av biologiske prosesser, inkludert cellesykluskontroll, dna-og RNA-metabolisme, oversettelse og cellulære strukturer (Figur 3). Totalt 96 av 222 (43%) av de prolin-rettede stedene var i samsvar med DEN kjente CDK-konsensusen (med en positivt ladet rest i +3-posisjonen). Interessant nok inneholdt omtrent 24% av de prolin-rettede nettstedene (53/222) en positivt ladet rest i enten +4 eller + 5-stillingene, noe som tyder på at DETTE motivet også kan favoriseres AV CDK2. Faktisk, Blethrow et al. også bemerket at et betydelig antall cyclin B-CDK1 substrater inneholder ikke-konsensussteder. For peptidene som inneholdt ikke-konsensussteder, fant vi at omtrent 50% av de tilsvarende proteinene hadde minst Ett K / RXLφ eller K/RXLXφ motiv (hvor φ er en stor hydrofob rest og X er en hvilken Som helst aminosyre) distalt for fosforyleringsstedene, og nesten alle hadde minst ett minimalt RXL motiv (tilleggsdatafil 3). Dette er i tråd med den veletablerte ideen om at disse motivene fremmer cyclin A-CDK2 binding til underlag . I tillegg til å velge fosforyleringer med CDK-konsensusmotiver, identifiserte vi 28 proteiner som tidligere har vært involvert SOM CDK-substrater (merket med fet skrift i Tilleggsdatafil 3). Dermed har nesten 15% av våre kandidater tidligere blitt funnet SOM CDK-mål, noe som ytterligere støtter ideen om at våre metoder fanget og beriket FOR CDK2-underlag. Til slutt har 43% av fosforyleringene vi fant tidligere blitt identifisert i storskala, in vivo fosfoproteomanalyser, noe som indikerer at disse fosforyleringene ikke er begrenset til våre lysatforhold .
Klassifisering av proteiner etter funksjonell kategori. Tall indikerer identifiserte proteiner i hver kategori.
både våre studier og de som er rapportert Av Blethrow et al. brukte lignende fosfopeptidisolasjonsordninger og relaterte cyklin-CDKs, og vi forventet at det kunne være betydelig overlapping i substratene avslørt av begge studiene. Faktisk fant vi nesten 50% (30/68)av cyclin B-CDK1 substrater i vår liste over cyclin A-CDK2 kandidater; dermed er disse metodene robuste og reproduserbare (Ekstra datafil 4). Det er imidlertid også betydelige forskjeller mellom de to listene, og disse skyldes sannsynligvis mange faktorer, inkludert prosedyreforskjeller, forskjellige celletyper, ufullstendig peptididentifikasjon ved MS og substratspesifisitet gitt av syklin-og / eller kinase-underenhetene. Noen av disse forskjellene kan også gjenspeile de forskjellige biologiske funksjonene til cyclin A-CDK2 og cyclin B-CDK1. For eksempel fant vi ni proteiner involvert i proteinoversettelse og / eller ribosomfunksjon, men ingen av disse proteinene ble funnet med cyclin B-CDK1, til tross for deres relativt høye overflod.
Selv om vi identifiserte et antall KJENTE CDK2-substrater, identifiserte vi ikke NOEN TIDLIGERE beskrevne CDK2-substrater. Noen av faktorene nevnt ovenfor kan også forklare at vi ikke har funnet KJENTE CDK2-substrater i våre analyser. I tillegg ville substrater som allerede er fosforylert av endogene Cdk-er ikke vært tiofosforylert in vitro. Det er også mulig at noen proteiner ikke ble løseliggjort under klargjøring av lysat og / eller sonikeringstrinnet og ekskludert fra våre analyser. Endelig er det mulig at store proteinkomplekser kan ha blitt forstyrret av fraksjoneringsprosedyrene før kinasereaksjonen, og at proteiner som fosforyleres AV CDK2 bare i sammenheng med disse kompleksene, kanskje ikke oppdages av våre metoder.
vi gjenvunnet også fire fosfopeptider som tilsvarer cyklin A OG CDK2 og 27 ekstra fosfopeptider med ikke-prolinstyrte steder (Tilleggsdatafil 5). Vi mistenkte at disse fosfopeptidene skyldtes autofosforylering av cyklin A-CDK2 og bakgrunnsfosforylering av andre kinaser, og andre har rapportert lignende bakgrunnsfosforylering . For å teste disse mulighetene utførte vi en kontrollkinasereaksjon ved bruk av cyklin A-CDK2 (F80A) og PE-ATP-γ-s uten tilsatt cellelysat og gjenvunnet tre av de fire cyklin A-CDK2 peptidene (tilleggsdatafil 5). Videre, da vi utførte en lignende ‘kinase-only’ reaksjon i nærvær av γ-32P-ATP, observerte VI 32P inkorporering i begge disse proteinene på en doseavhengig måte (Tilleggsdatafil 6). Disse forsøkene bekreftet at det var bakgrunn auto-fosforylering av cyclin A-CDK2 i de opprinnelige analysene.
vi utførte også kontrollkinasereaksjoner ved bruk av lysatfraksjonene, GST-Rb ‘spike-in’ og PE-ATP-γ-S uten tilsetning av cyklin A-CDK2. Disse’ no-kinase ‘ – kontrollreaksjonene fosforylerte 7 av de 27 ikke-prolinstyrte fosfopeptidene på vår liste (Tilleggsdatafil 5), noe som tyder på at de fleste, om ikke alle, av disse fosfopeptidene skyldes bakgrunnsfosforylering av kinaser som i begrenset grad kan bruke ATP-analogen. For eksempel inneholder de fleste av disse peptidene sure reststyrte fosforyleringssteder som er kaseinkinase 2-motiver. Kasein kinase 2 er unik ved at den kan utnytte GTP samt ATP; dermed kan det aktive stedet imøtekomme de store ATP-analogene, slik SOM PE-ATP . Det er viktig at vi ikke gjenvunnet Noen rb-fosfopeptider fra disse kontrolleksperimentene, noe som indikerer at det ikke var noen uspesifikk CDK-aktivitet i våre analyser. Vi gjenvunnet også 44 umodifiserte peptider, hvorav 12 inneholdt cysteinrester. De fleste av disse peptidene stammer fra flere lysatfraksjoner (Ekstra datafil 2). Vi mistenker at disse skyldtes lavnivå ikke-spesifikk binding av peptider til harpiksen til tross for strenge vaskeforhold, og i tilfelle av cysteinholdige peptider, fra en liten mengde hydrolyse av alkyldisulfidforbindelsen under elueringstrinnet. Oppsummert var våre metoder svært selektive, og våre studier identifiserte en overraskende stor gruppe kandidat cyclin A-CDK2 substrater, hvorav de fleste ikke tidligere er identifisert SOM CDK-mål.
Validering av kandidatsubstrater som cyclin A-CDK2 mål
vi benyttet flere strategier For å validere noen av de nye kandidatene i vår liste som cyclin A-CDK2 substrater. Fordi våre proteinidentifikasjoner var basert på peptidsekvenser, begynte vi med å bekrefte at cyclin A-CDK2 fosforylerte tre full lengde og innfødte kandidater som ble immunoprecipitert via epitop-koder fra transfiserte 293 celler (EF2, TRF2 og RAP1). Fordi disse proteinene ikke var tilstede på cyclin B-CDK1-listen, bestemte vi om de også fosforyleres av cyclin B-CDK1. HVER CDK2-kandidat ble fosforylert av både cyklin A-CDK2 og cyklin B-CDK1, SELV OM EF2 ble fosforylert i mindre grad enn enten TRF2 eller RAP1 (Figur 4a). VI uttrykte OGSÅ TRF2, RAP1 og det ribosomale proteinet RL12 som gst-fusjoner og renset dem fra Escherichia coli. Når vi brukte cyklin A-CDK2 til fosforylat TRF2 og RAP1 in vitro, ble proteinene sterkt fosforylert, OG MS-analyser viste at disse fosforyleringene skjedde på de samme stedene vi først identifiserte (Figur 4b). Vi brukte også cyclin A-CDK2 og cyclin B-CDK1 til fosforylat GST-RL12, og fant at Begge Cdkene også fosforylert RL12 in vitro (Figur 4c). Disse studiene bekrefter dermed at peptidene identifisert i vår skjerm representerer proteiner som kan fosforyleres av cyklin A-CDK2, i det minste in vitro. Selv om vi fant kvalitative forskjeller i evnen til cyclin A-CDK2 og cyclin B-CDK1 å fosforylere spesifikke proteiner, ble kandidatene i hvert tilfelle fosforylert av begge Cdk-ene. Fordi enzympreparatet vi brukte i disse studiene inneholdt et overskudd av FRI CDK2 (F80A), vurderte vi muligheten for at noen substratfosforyleringer kan skyldes foreningen av endogene sykliner med CDK2 (F80A) som enten var monomere eller som kan ha dissosiert fra syklin A under analyseforholdene. Vi fant at mengden cyclin B-CDK2 (F80A) aktivitet i disse ekstraktene var ubetydelig sammenlignet med cyclin A-CDK2 (F80A), og vi kunne ikke oppdage noen cyclin E-CDK2 (F80A) aktivitet (Ekstra datafil 7). Ikke desto mindre kan vi ikke utelukke muligheten for at noen peptider kan ha blitt fosforylert AV CDK2 (F80A)i kompleks med et endogent syklin, og spesifisiteten til et hvilket som helst kandidatsubstrat for syklin a versus andre sykliner som aktiverer CDK2, må valideres som beskrevet nedenfor.
in vitro validering av SELEKTIVE kandidat CDK2 substrater. (A) HEK293-celler ble transfektert forbigående med vektorer som uttrykte FLAGGMERKEDE EF2, TRF2 og RAP1. Antiflag-antistoffimmunoprecipitater ble in vitro fosforylert med cyklin A-CDK2 eller cyklin B-CDK1 i nærvær av γ-32p-ATP (øvre venstre panel). I parallelle reaksjoner ble histon H1 fosforylert som en kontroll for å normalisere aktivitetene til cyklin A-CDK2 og cyklin B-CDK1 (høyre panel). ‘C ‘ betegner’ kun kinase ‘reaksjoner uten transfiserte substrater (venstre panel) og ‘ingen kinase’ reaksjon (høyre panel). Proteinprøver ble separert AV SDS-SIDEN og gelene ble overført til PVDF-membraner. Fosfosignaler ble visualisert ved autoradiografi. Membranen ble deretter undersøkt med Anti-FLAGG antistoff (Sigma-Aldrich) for å bekrefte identiteten til fosfosignalbåndet (nedre venstre paneler). Stjernen representerer et ikke-spesifikt bånd fra det kommersielle cyclin B-CDK2-preparatet. (B) Kinasereaksjon ble utført ved bruk av γ-32P-ATP og GST-TRF2, GST-RAP1, gst-RB (positiv kontroll) og gst (negativ kontroll) som substrater i nærvær eller fravær av villtype cyklin A-CDK2 kinase. Reaksjoner ble visualisert AV SDS SIDE etterfulgt Av Coomassie farging og autoradiografi (venstre panel). En lignende kinase-analyse ble utført ved bruk av villtype cyklin A / CDK2 og ATP-γ-S, og deretter underkastet et fosfopeptidisoleringsskjema. MS analyse bekreftet AT TRF2 OG RAP1 ble hver fosforylert på de nøyaktige stedene vi identifiserte fra skjermen med ett ekstra nettsted FOR RAP1 (høyre panel). (c) Kinaseanalyse ble utført ved bruk av γ – 32P-ATP, cyklin A-CDK2 eller cyklin B-CDK1 med økende mengder renset GST-RL12. Prøver ble separert AV SDS-SIDEN og gelen ble farget Med Coomassie (nedre panel) etterfulgt av autoradiografi (øvre panel). ‘C ‘ betegner’ kun kinase ‘ reaksjoner uten transfiserte substrater.
Validering AV RL12 som et in vivoCDK2-substrat
studiene ovenfor validerte flere nye kandidater identifisert i vår skjerm som CDK2-substrater in vitro. For å avgjøre om et nytt substrat også fosforyleres av CDK2 in vivo, utførte vi imidlertid en mer omfattende analyse av det ribosomale proteinet RL12. Vi blandet først immunoprecipitater av epitop-merket cyklin A-CDK2 og RL12 uttrykt i humane celler i nærvær av γ-32P-ATP og fant at cyklin A-CDK2 fosforylerte RL12 in vitro (Figur 5a). Fosforyleringen ble i stor grad avskaffet i en mutant RL12 hvor den identifiserte fosfoserin S38 ble erstattet med en alanin, og den ble gjenopprettet da S38 ble erstattet med en treonin (Figur 5b). Vi brukte deretter fosfopeptidkartlegging for å identifisere peptidet som inneholder S38, og bekreftet at DET var direkte fosforylert AV CDK2 in vitro (Figur 5c). For å teste OM RL12 også fosforyleres in vivo PÅ EN CDK2-avhengig måte på samme sted, merket vi metabolisk celler MED 32P-ortofosfat og immunoprecipitert villtype eller rl12-S38A fra celler som overuttrykker enten cyklin E-CDK2, katalytisk inaktiv cyklin E-CDK2 eller CDK-inhibitoren p21 (for å hemme endogene CDKs) . Fordi vi ikke kan studere endogen rl12 fosforylering på grunn av mangel på et egnet anti-RL12 antistoff, undersøkte disse studiene fosforyleringen av ektopisk RL12 in vivo (disse transfeksjonsbetingelsene førte til en omtrent fem til ti ganger overuttrykk AV rl12 mRNA (Tilleggsdatafil 8). Vi fant at villtype RL12, men IKKE rl12-S38A, var fosforylert in vivo (Figur 5d). Denne fosforyleringen ble forbedret i celler som overuttrykker cyklin E-CDK2, men ikke inaktiv cyklin E-CDK2, og ble redusert i celler som overuttrykker P21 CDK-hemmeren (som hemmer endogene cyklin-CDKs; Figur 5d). Til slutt brukte vi fosfopeptid kartlegging og fosfoaminosyre analyser AV RL12 protein immunoprecipitated fra de merkede celler og bekreftet AT rl12 fosforylering av cyclin E-CDK2 in vivo også forekom På S38 (Figur 5e). Rl12 s38 fosforylering in vivo er også rapportert i fosfoproteomstudier .
Fosforylering AV RL12 in vitro og in vivo. (A) HA-merket RL12 eller vektorkontroll (‘vec’) ble transienttransfisert TIL U2OS-celler og immunoprecipitert ved BRUK AV 12ca5 antistoff. Cyklin A-CDK2-komplekser ble også forbigående uttrykt separat I u2os-celler og immunoprecipitert ved bruk av et antistoff mot cyklin A. Kinaseanalyser ble utført ved BRUK AV rl12 (eller kontroll) immunoprecipitat med eller uten cyklin A-CDK2 immunoprecipitat i nærvær av γ-32p-ATP. (B) Lignende analyser ble utført ved bruk av cyklin A-CDK2 og rl12 immunoprecipitater inneholdende villtype (wt) og de indikerte rl12 fosfosittmutantene. Stjernen betegner lyskjeden av antistoffet. (c) Fosfopeptid kartlegging og fosfoaminosyreanalyse av radiomerket villtype (venstre panel) OG s38t mutant (høyre panel) AV RL12. (D) Villtype RL12, RL12-S38A eller vektorkontroll ble transiently ko-transfektert med cyclin E-CDK2, katalytisk inaktiv (dn) cyclin E-CDK2 eller p21. Alle celler ble utsatt FOR 32p ortofosfatmerking. RL12 ble immunoprecipitert fra cellelysater og visualisert av SDS PAGE etterfulgt av autoradiografi. (e) Fosfopeptid kartlegging analyse ble også utført på radiomerket RL12 vist i (d). Den nederste pilen viser et andre og mindre fosforyleringssted oppdaget in vivo.
selv om vi har validert hver av de nye kandidatene som vi har testet så langt ved å vise at full-lengde proteiner er fosforylert AV CDK2, noen kandidater på vår liste vil trolig vise seg ikke å være fysiologisk relevante cyclin A-CDK2 substrater. For eksempel ble kinasereaksjonene utført i lysater, og in vivo subcellulær compartmentalization kan begrense TILGANGEN AV CDK2 til noen kandidater. Videre er det mulig at andre cellulære kinaser enten er overflødige med ELLER viktigere ENN CDK2 med hensyn til individuelle substrater in vivo. Det er derfor viktig at kandidatene blir grundig vurdert i en så fysiologisk kontekst som mulig. Mot dette formål bruker vi i pågående studier en genmålrettingsmetode for å mutere en delmengde av disse fosforyleringsstedene i de endogene gener for å studere deres fysiologiske betydning.
