Sopp vert

Filamentøse sopp kan tjene som verter for en mikrobiell karminsyrecellefabrikk, da de har kapasitet til å levere en god tilførsel av acetyl-CoA Og malonyl-CoA byggeklosser for syntesen av polyketide stillaset.. De tilbyr også den nødvendige cellulære infrastrukturen for å imøtekomme er-membranbundet C-glukosyltransferase UGT28. Siden a. nidulans har en velutviklet genteknisk verktøykasse, valgte Vi denne arten som utgangspunkt for utviklingen av en soppkarminsyrecellefabrikk. Som de fleste filamentøse sopp er a. nidulans i stand til å produsere en mengde biosyntetisk mangfoldige sekundære metabolitter, inkludert et betydelig antall aromatiske polyketider. Chiang et al. har tidligere vist at sletting av genklyngene som er ansvarlige for dannelsen av de store endogene pks-produktene I a. nidulans11, forbedret potensialet Til A. nidulans som en cellefabrikk for heterolog produksjon av polyketider. På denne måten økes bassengene av acetyl-CoA og malonyl-CoA byggeklosser, og de påfølgende kjemiske analysene for dannelsen av nye produkter forenkles. Som et første skritt mot en soppcellefabrikk for karminsyreproduksjon, eliminert vi derfor biosyntetiske veier for de dominerende aromatiske polyketider som potensielt kan forstyrre karminsyreproduksjon og komplisere analysen og nedstrøms rensing. Spesielt ble genklyngene for produksjon av asperthecin, monodiktyphenon og sterigmatocystin eliminert, så vel som genene som er ansvarlige for grønn conidia pigmentdannelse, wA og yA, ble eliminert i en ikke-homolog endjoining deficient a. nidulans bakgrunn. Foruten den forventede mangelen på konidialpigmenter viste DEN resulterende stammen, NID2252, ingen synlige effekter på morfologi Og kondisjon (Supplerende Fil, Fig. 1). VI brukte DERFOR NID2252 som referansestamme og som grunnlag for bygging av en soppcellefabrikk for karminsyreproduksjon.

Utforming av en semi-naturlig vei for flavokermesic acid anthron dannelse

den store veisperring for bygging av en mikrobiell carminic syre cellefabrikk var mangel på en naturlig PKS som syntetiserer flavokermesic acid anthron, den første antatte mellomliggende i veien. For å omgå denne begrensningen forfulgte vi en alternativ biosyntetisk rute for produksjon av denne polyketiden. Octaketide flavokermesic acid anthrone, med Sin c7-C12, C5-C14 og C2-C15 cyclisation mønster, kan i teorien dannes i et enkelt trinn av en sopp ikke-reduserende type i iterative PKS som besitter et egnet produkt mal domene (Fig. 1 venstre). Imidlertid er ingen slike enzymer ennå beskrevet i litteraturen. En alternativ mekanisme for å danne flavokermesic syre anthron er via en to-trinns reaksjon hvor EN PKS syntetiserer en ikke-redusert lineær oktaketidkjede, som deretter blir syklet inn i den ønskede struktur ved trans-virkende cyclases / aromatases (Fig. 1 høyre). Reaksjoner av denne typen finnes i naturen i f. eks actinorhodin (Act) vei I Streptomyces coelicolor12. I dette tilfellet syntetiseres octaketide-ryggraden av et MULTI-subenhet bakteriell type II pks-system, KSa, KSß og ACP (act minimal PKS), som reduseres av actKR i posisjon C9 og deretter foldes av aromatase/cyclase, actoro/CYC og cyclase actCYC2, for å gi den trisykliske forbindelsen 3,8-dihydroksy-1-metylanthraquinon-2-karboksylsyre (DMAC)7. DMAC viser samme fold som flavokermesic acid anthrone, men er redusert På c9 posisjon.

av spesiell interesse for denne studien, Er ZhuI cyclase Og zhuj aromatase Fra Streptomyces sp. R1128, som katalyserer to sekvensielle sykliseringsreaksjoner av ikke-reduserte lineære polyketider i folder som ligner på flavokermesinsyre en trone13. Spesielt Er zhui cyclase ansvarlig for å lukke den første ringen, C7-C12, Og zhuj aromatase for å lukke Den andre ringen, C5-C14. Den tredje ringen, C2-C15, dannes spontant. ZhuI Og ZhuJ har tidligere vært co-uttrykt I S. coelicolor med oktaketiddannende TYPE II virker minimal PKS som resulterer i dannelse av flavokermesinsyre, kjent som 3,6,8-trihydroksy-1-metylanthraquinon-2-karboksylsyre (TMAC) i bakteriell litteratur14. Dessverre kan en identisk strategi være vanskelig å implementere I a. nidulans, da type II minimal PKSs ikke er vellykket implementert i heterologe verter utenfor Streptomyces-slekten til tross for flere forsøk15. Og faktisk våre forsøk på å rekonstituere act miniPKS I a. nidulans Og Saccharomyces cerevisiae på samme måte viste seg mislykket (data ikke vist). En alternativ måte å danne det nødvendige ikke-reduserte oktaketidet på er å stole på type III pks-enzymer, som har blitt uttrykt i gjær, f. eks. i forbindelse med flavonoidbiosyntese16. Av spesiell interesse Er Aloe arborescens oktaketidsyntase (OKS), som har blitt beskrevet for å produsere ikke-reduserte oktaktider som spontant bretter seg INN I SEK4 og SEK4b i vitro17 (Fig . 2a). I Aspergillus forblir Det imidlertid uprøvd om produktene AV TYPE III PKSs, som ER ACP-uavhengige enzymer som frigjør karboksylsyrer, kan foldes av zhui-typen syklase som er beskrevet for å virke PÅ ACP-bundne substrater. I den nåværende studien satte vi oss derfor for å teste kompatibiliteten til plantetype III OKS med syklaser / aromataser fra bakterielle TYPE II PKS-systemer, med sikte på å utvikle en kunstig de novo biosyntetisk vei for dannelse av flavokermesic acid anthron forløper for dannelse av karminsyre.

Produksjon av polyketide forløpere for karminsyreproduksjon I a. nidulans

for å teste in vivo-ytelsen TIL OKS i en soppvert, satte VI OKS kontrollert av A. nidulans gpdA-promotoren som en enkelt kopi til et definert locus (integrasjonssted 5, IS5) i a. nidulans genome18. To stammer ble konstruert, en som uttrykte den innfødte OKS-kodingssekvensen og en som uttrykte en kodonoptimalisert versjon for uttrykk I a. nidulans. Etter syv dager med inkubasjon på fast vekstmedium, se Metodeseksjonen for detaljer, begge stammer viste en sterk rødbrun farging av myceliet (Fig. 2b). Metabolsk profilering AV hplc-HRMS av stammene ikke avsløre noen spor av en ikke-redusert oktaketid, men heller forventet SEK4 Og SEK4b sammen med flavokermesic syre og tre andre rikelig forbindelser av ukjent identitet (Fig. 2c), som ikke var til stede I NID2252 referansestammen. SEK4 og SEK4b ble identifisert basert på grundig hplc-HRMS/MS analyse (Supplerende Fil, Fig. 2) og var i samsvar med tidligere rapporterte verdier19 mens flavokermesinsyre ble sammenlignet med en autentisk referanse isolert fra d. coccus9 (Supplerende Fil, Fig. 3). Metabolitten eluerer ved 13,0 min. hadde en pseudomolekylær ion + av m / z 303.0867, som svarer TIL en molekylformel AV C16H14O6, i samsvar med det kjente oktaketidshuntproduktet mutaktin, tidligere beskrevet i Streptomyces – baserte eksperimenter Med Act-genklyngen7. Denne identifikasjonen ble bekreftet gjennom detaljert analyse AV UV-spektret, og støttet av retensjonstiden i FORHOLD TIL SEK4 og SEK4b(Supplerende Fil, Fig. 4). De to andre metabolittene MED molekylære formler AV C16H12O6 (- m/z 299.0566) indikerte oktaketidprodukter, men korresponderte imidlertid ikke med et felles shuntprodukt (Tilleggsfil, Fig. 5). Derfor ble metabolittene isolert og strukturelysering basert PÅ 1d OG 2D NMR-eksperimenter identifiserte dem som dehydro-SEK4 (også kjent Som B26 i bakteriell litteratur) og dehydro-SEK4b20 (Supplerende Fil, Figs 6-11). Dannelsen av de seks nye polyketidene observert I oks-stammen kan forklares med tre forskjellige spontane første ringlukkingsreaksjoner: C7-C12( SEK4, dehydro-SEK4 og flavokermesinsyre), C10-C15 (SEK4b og dehydro-SEK4b) og C7-C12 etter c9 ketonreduksjon (mutaktin) (Fig. 2a Og Supplerende Fil, Fig. 12). Av disse tillater bare den første ringlukkingstypen (C7-C12) den påfølgende dannelsen av den ønskede flavokermesinsyreantronen via en andre c5-C14 og tredje c2-C15 ringlukking. SEK4 og SEK4b har tidligere blitt rapportert å dehydrere spontant for å danne henholdsvis dehydro-SEK4 og dehydro-SEK4b, mens dannelsen av mutaktin avhenger av enzymatisk reduksjon Av c9-posisjonen til polyketidkjeden før folding21. Dannelsen av flavokermesinsyre, et kjent mellomprodukt i karminsyreveien (Fig. 1), var uventet da denne metabolitten ikke er rapportert å dannes spontant fra ikke-reduserte oktaketidkjeder. Dette antyder at a. nidulans naturlig produserer en rekke cyclaser / aromataser som fremmer ønsket foldemønster. Metabolittprofileringen av DE TO OKS-pumpestammene viste ingen vesentlige forskjeller i produksjonsnivåer, og vi bestemte oss for å fokusere på stammen som uttrykker den opprinnelige versjonen AV OKS som grunnlag for videre utvikling av en soppcellefabrikk for karminsyreproduksjon.

Prosjektering foldeveien til ikke-reduserte oktaketider

den promiskuøse foldingen av den ikke-reduserte oktaketiden reduserer utbyttet av ønskelig flavokermesinsyre. Vi så derfor for oss at produksjonen av flavokermesinsyre kunne økes ved å effektivisere foldeprosessen i ønsket retning ved å uttrykke kodonoptimaliserte versjoner Av ZhuI og ZhuJ. For å undersøke Om ZhuI og ZhuJ forstyrrer Den opprinnelige metabolismen Av a. nidulans, konstruerte vi først stammer som uttrykker ZhuI og ZhuJ individuelt og i kombinasjon fra definerte genomiske loci (IS6 OG IS7) I A. nidulans NID2252 referanse stamme. Metabolsk profilering AV HPLC-HRMS av de tre stammene avdekket ikke noen påviselige metabolske forskjeller (Fig. 3b). Vi konstruerte deretter en stamme co-expressing OKS Med ZhuI, som koder for syklaser som katalyserer dannelsen Av C7-C12 første ringlukking (Fig. 3a). Sammenlignet med stammen som bare uttrykker OKS, viste denne stammen henholdsvis 2,5-, 2,2-og 2,1-ganger økning i flavokermesinsyre, SEK4 og dehydro-SEK4 nivåer. I samsvar Med zhui guiding folding i ønsket retning, ble disse metabolske endringene ledsaget av reduserte nivåer av metabolitter som inneholder de uønskede første ringfoldene (Fig. 3b Og Tabell 1). En stamme som uttrykker OKS Og ZhuJ, som koder for aromatasene som katalyserer C5-C14 andre ringlukking (Fig. 3a), produsert en 2,7 ganger økning i flavokermesic syre nivåer. Denne økningen ble ledsaget av en reduksjon I nivåene av metabolitter Med en c7-C12 første ringfold (SEK4 OG dehydro-SEK4), mens som forventet var nivået av metabolitter med den uønskede c10-C15 første ringfold (SEK4b og dehydro-SEK4b) ikke påvirket (Fig. 3b Og Tabell 1). Endelig viste analyse Av stammen som uttrykker ZhuI, ZhuJ Og OKS en 4,1 ganger økning i produksjonen av flavokermesinsyre sammenlignet med NÅR OKS ble uttrykt alene. Videre er denne økningen 60% høyere enn det som ble observert med stammer som uttrykker OKS i kombinasjon med Henholdsvis ZhuI eller ZhuJ (Tabell 1). Dette resultatet indikerer at syklasen og aromatasen på en additiv måte er i stand til å øke fluxen i den kunstige de novo-banen mot det ønskede produkt, flavokermesinsyre (Fig. 3b).

Overraskende, og veldig oppmuntrende, videre metabolsk analyse av stammen co-uttrykke OKS, zhui Og ZhuJ viste at den økte dannelsen av flavokermesic syre ble ledsaget av produksjon av kermesic syre (Fig . 4). Derfor A. nidulans gir den nødvendige monooksygenasen for å omdanne flavokermesinsyre til kermesinsyre, som kan tjene som det endelige mellomproduktet i karminsyreveien (Fig. 1).