når det gjelder oppløsnings-og denaturerende proteiner før isoelektrisk fokusering og 2-d gelelektroforese, velger de fleste forskere urea. Dette er ikke overraskende siden dette milde kaotropiske stoffet helt kan forstyrre samspillet mellom proteinmolekyler og øke effektiviteten av proteaseaktivitet i proteinfordøyelse, samtidig som det effektivt forhindrer proteiner i å aggregere og / eller utfelle. I tillegg brukes urea også til renaturering av proteiner fra tidligere denaturerte prøver.

Til Tross for sin popularitet som en effektiv protein denaturant, bruker urea løsning i fordøye proteiner kommer med en spesiell utfordring-det øker risikoen for karbamylering. Hvorfor skal dette bekymre deg? Her er noen grunner til at karbamylering kan være skadelig for eksperimentet ditt, og hvorfor det bør unngås for enhver pris.Bortsett fra å blokkere De n-terminale endene av proteinmolekyler, forstyrrer karbamylering proteinkarakterisering og gjør dem utilgjengelige for videre bruk.

det angriper aggressivt sidekjedene av arginin og lysinrester og gjør proteinet uegnet til enzymatisk fordøyelse.

det hindrer den enzymatiske fordøyelsen av proteiner og påvirker identifisering og kvantifisering av proteiner i MS-analyse negativt.

det forvirrer resultatene oppnådd fra peptider med uventede retensjonstider og øker prøvekompleksiteten.

det reduserer ioniseringseffektiviteten og påvirker signalintensiteten til oppdagede topper negativt.

det induserer en endring i det isoelektriske punktet av proteiner og fører til artefaktuelle resultater.

det kan påvirke resultatene av karbamylasjonsstudier in vivo.

Hva Forårsaker Karbamylering?karbamylering refererer Per definisjon til den post-translasjonelle modifikasjonen som endrer de strukturelle og funksjonelle egenskapene til proteiner. Dette skyldes den ikke-enzymatiske reaksjonen mellom isocyansyre og de frie aminogruppene.

i vandige løsninger eksisterer urea i likevekt med ammoniumcyanat. Det er viktig å merke seg at (1) urea i oppløsning dissosierer spontant produserende cyanat-og ammoniumioner, (2) det nedbryter til isocyansyre (CNOH), formen som aktivt reagerer med proteinaminogrupper og induserer karbamylering, og (3) hastigheten der urea dissosierer og omfanget av karbamylering avhenger av temperatur, pH og inkubasjonstid.

Forebygging Av Karbamylering: Noen Nyttige Tips å Vurdere

Ingenting kan forandre det faktum at urea i nærvær av varme og proteiner alltid vil føre til karbamylering. Du kan bruke den høyeste karakteren urea tilgjengelig og fortsatt risikere karbamylering.

Heldigvis finnes Det Flere måter å beskytte peptider mot karbamylering. Her er noen effektive strategier som kan brukes til å oppnå dette målet.

• bruk alltid nyberedte ureabaserte reagenser når du utfører proteomiske prosedyrer. Bruk tørr ureabaserte, ferdigblandede og bruksklare buffere av høy kvalitet fra troverdige kilder, og vær svært forsiktig når du forbereder prøvene. Merk: Oppbevar fast materiale ved romtemperatur og hold håndteringen til et minimum.
• Fjern urea fra proteinprøven før fordøyelsen ved å bruke dialyse og / eller hurtig reversert fasekromatografi eller ved å bruke spinnkolonner.
• Opprettholde prøven ved en relativt lav temperatur for å redusere hastigheten ved hvilken urea dekomponerer. Unngå oppvarming av ureaholdige buffere over 37oC for å redusere risikoen for karbamylering.
• Avioniser urealøsningen ved hjelp av en ionebytterharpiks for å redusere cyanatkonsentrasjonen.
• Surgjør ureaoppløsning (100 mM HCl) for å hindre dannelsen av isocyansyre.
• Bruk reagenser som etanolamin, etylendiamin, metylamin og Tris-HCl for å minimere protein / peptidkarbamylering. Disse reagensene hjelper ved å rense for cyanatmolekyler og dermed gjøre dem utilgjengelige for peptider.

Riktignok har disse strategiene sine egne ulemper (dvs., indusere utfelling av lett denaturerte proteiner, og kan være uegnet for mange enzymatiske fordøyelsesteknikker), men siden enzymfordøyelser utføres i forhøyede temperaturer over en lang periode, har du ikke annet valg enn å fjerne urea fra fordøyelsesblandingen. Ellers vil du alltid risikere karbamylering. Det er en risiko du ikke vil ta.