Laboratorienotater FOR BIO 1003

© 30 August 1999, John h. Wahlert & Mary Jean Holland

ENZYMER

Proteiner Som Virker Som katalysatorer

(klikk her for: materialer, temaer, webressurser)

celler har ikke muligheter for varme og kraftig omrøring for å øke hastigheten på kjemiske reaksjoner ved å få atomer og Molekyler Til Å Støte på Hverandre oftere og med mer kraft. I stedet lager de proteinkatalysatorer kalt enzymer som gir overflater på hvilke reaktanter møter hverandre i riktig retning, og enzymene kan til og med svekke bindinger som skal brytes. Enzymer har høy spesifisitet-bare spesifikke reaktanter vil passe på overflatene og balansere de lokale overflateavgiftene på stedet som kalles det aktive stedet. Det spesielle settet av reaktanter for et enzym kalles dets substrat(er). Enzymer, som alle katalysatorer, endres ikke av reaksjonen de katalyserer; således, når alle reaktantene er omdannet til produkter, forblir de opprinnelige enzymmolekylene.

Enzymfunksjonen avhenger av miljøet der reaksjonen oppstår. Slike faktorer som temperatur og pH kan i stor grad påvirke et enzyms evne til å gjøre jobben sin. Følgende serie eksperimenter illustrerer prinsippene for enzymatisk katalyserte reaksjoner i biologiske systemer. Vi skal bruke enzymet katekolase (eller katekoloksidase) som er vanlig i planter; det er til stede i ferskpresset potet juice som har blitt gitt. Substratene for katekolase er katekol og oksygen. Substratene reagerer med hverandre i det aktive stedet av enzymet. Produktene dannet av denne reaksjonen er benzokinon og vann; siden benzokinon har en brun farge, kan du se at reaksjonen har funnet sted. Dette kalles fruktbruningsreaksjonen. Benzoquinon hemmer veksten av mikroorganismer og forhindrer skadet frukt fra rotting. I ubeskadigede celler lagres katekolase i vesikler og interagerer ikke med katekol.

i nærvær av enzymet katakolase:

catechol + HRYVO2 benzoquinone + H2O

i alle forsøkene nedenfor blandes ingrediensene som angitt, og rør blandingen med en virvelgenie eller ved å trykke på siden av røret nær bunnen; inkuber blandinger ved 40 grader C, med mindre annet er spesifisert.

hvis du tvilte på renheten av enzymet, hvordan kunne du finne ut om det er noe annet i potetekstraktet i tillegg til katekolase?

I. Dannelse og Deteksjon Av Benzokinon

dette eksperimentet etablerer standarder for utseende når reaksjonen har eller ikke har funnet sted. Bruk destillert vann der H2O er angitt.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment)
10 drops potato extract with 10 drops H2O (control)
10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (kontroll)

hvordan vil du definere begrepene en kontroll og et eksperiment?

II. Enzymspesifisitet

Hydrokinon er strukturelt lik, men ikke det samme som katekol. I dette eksperimentet vil vi se om enzymet også kan konvertere det til benzokinon, eller hvis enzymet bare er for spesifikt i sin utforming for å interagere med det lignende, men ikke identiske molekylet.

Mix	Initial color	Color change (after 5 min)
10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol
10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone
10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (kontroll)

kan enxymen konvertere hydrokinon til benzokinon? Hvordan kom du til denne konklusjonen?

MERK: GRUPPEN DIN VIL GJØRE ENTEN III ELLER IV—IKKE BEGGE deler.
Spør din lab instruktør om gruppen vil GJØRE III temperatur eller IV pH.

III. Effekt Av Temperatur På Enzymaktivitet

Enzymer er utformet for å fungere innenfor et bestemt temperaturområde. Du kan gjøre noen gjetninger om utfallet for følgende temperaturer under. Husk at strukturene som produserer enzymet er frukt og potet; På Celsius temperaturskala 0 grader fryser, 22 grader er romtemperatur, og 100 grader koker. Jo varmere det er, jo raskere molekyler vibrerer og beveger seg. Kollisjoner av vannmolekyler med enzymet kan angre sin brettede struktur som holdes i posisjon av hydrogenbindinger; når dette skjer, sies molekylet å ha blitt denaturert. Hva ville skje med det aktive nettstedet i dette tilfellet? Ved lave temperaturer beveger molekylene seg veldig sakte, og sjansen for at de kolliderer og reagerer med hverandre er svært lav. Legg merke til at potetekstraktet har blitt holdt på is. Hvorfor?

Skriv ned hypotesen om effekten av temperatur på enzymaktivitet:

Sett opp 6 par reagensrør med 10 dråper potetekstrakt i ett sett og 10 dråper 1% katekol i den andre. Inkuber dem i 5 minutter, ett par i hvert av de 5 temperaturmiljøene som er angitt nedenfor. Bland deretter potetekstrakt og katekol sammen; ta opp den opprinnelige fargen, og sett det røret tilbake i de kontrollerte temperaturmiljøene. Ta opp fargen igjen etter 5 minutter.

Temperatur	innledende farge	fargeendring (5 min. after adding catechol)
0 degrees C
22 degrees C
40 degrees C
60 degrees C
80 grader C
100 grader c

støtter resultatene din opprinnelige hypotese?

hvilke temperaturer denaturerer enzymet slik at det ikke kan gjenopprette.

Hva er det hvite bunnfallet som dannes ved 100 grader C?

IV. Effekt av pH På Enzymaktivitet

ph-skalaen måler antall hydrogenioner (hver med en +1 ladning) tilstede i oppløsning. Skalaen i biologiske systemer går fra 0 (sterkt surt) til 14 (sterkt grunnleggende). 7, det nøytrale punktet, er pH i rent vann. Husk at den brettede strukturen av proteinmolekyler i stor grad skyldes hydrogenbinding mellom motsatt ladede deler av polypeptidkjeden. Andre ioner i løsningen kan erstatte matchende deler av kjeden, og gjøre det komme ugjort. Når dette skjer, hva blir av det aktive nettstedet?

Skriv ned hypotesen din om effekten av ph-området på enzymaktivitet:

Sett opp 7 reagensrør med 40 dråper av en annen bufret pH-løsning i hver. Tilsett 10 dråper potet ekstrakt til hver og rør. Deretter tilsettes 10 dråper 1% katekol til hver og rør.

pH	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
pH 2
pH 4
pH 6
pH 7
pH 8
pH 10
pH 12

Do the results support your hypothesis?

ved hvilken ph eller område av pH-verdier fungerer enzymet best?

hvorfor setter sitronsaft på fersk skiver frukt retard sin bruning?

V. Nødvendighet Av Kofaktorer for Enzymaktivitet

Mange enzymer virker bare hvis det er en kofaktor forbundet med dem. Katekolase krever kobber som kofaktor. PTU ER et kjemikalie som har en høyere affinitet for kobber enn katekolase, og det tar kobberet bort fra enzymet. Du kan observere hva som skjer med enzymets funksjon når kofaktoren er fjernet. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.

Mix	Initial color	Color change (5 min after adding catechol)
Tube A 10 drops potato extract 5 crystals PTU and mix. After 5 minutes add 10 drops 1% catechol.
Tube B 10 drops potato extract. etter 5 minutter legg 10 dråper 1% katekol.

Hvilket rør, A Eller B, er kontrollen i dette eksperimentet?