Abstract

Eksisterende chemotaxis analyser genererer ikke stabile chemotactic gradienter og dermed—over tid-funksjonelt måle bare uspesifikk tilfeldig bevegelse (chemokinesis). Til sammenligning har mikrofluidisk teknologi kapasitet til å generere et tett kontrollert mikromiljø som kan opprettholdes stabilt i lengre perioder og er derfor egnet til tilpasning for analyse av kjemotaksis. Vi beskriver her en ny mikrofluidisk enhet for sensitiv analyse av cellulær migrasjon og viser dens anvendelse for å evaluere kjemotaksen av glatte muskelceller i en kjemokingradient.

1. Introduksjon

Rettet cellemigrasjon spiller en kritisk rolle i inflammatoriske lidelser, vaskulær sykdom, sårheling og tumormetastase . En rekke in vitro-tilnærminger er utviklet for å kvantifisere cellemigrasjon, inkludert lukking av monolagssår («scratch assay») og Boyden-kammeret . Imidlertid er disse nåværende metodene relativt ufølsomme. Videre, slike tilnærminger kan faktisk måle bare chemokinesis, det vil si økt tilfeldig bevegelse, snarere enn chemotaxis-rettet cellemigrasjon.faktisk er bruken av scratch assay og Boyden chamber transwells begrenset av deres metodologiske design.

for skrapeanalysen blir et definert «sår» (riper) laget i et konfluent cellemonolag; celler på kantene av defekten fyller deretter gradvis tomrummet, og tiden for å gjenopprette konfluens blir kvantifisert. Raskere reparasjon av riper har blitt tolket for å reflektere forbedret «kjemotaksis» på grunn av cellemanipulering eller arten av oppløselige midler tilsatt til mediet. Mens forsøket er konseptuelt grei og teknisk lett å utføre, blir cellene badet i en jevn konsentrasjon av middel, og det er ingen kjemoattraktant konsentrasjonsgradient under hele forsøket; bevegelsen som fyller gapet representerer derfor bare en » tilfeldig tur.»Således er» migrasjonen » i en skrapeanalyse i stor grad en funksjon av bare økt kjemokinese. Videre, som vanligvis utføres—spesielt over flere timer med en langvarig analyse—lukking av en ripe «sår» også sannsynlig inkluderer en betydelig komponent av celleproliferasjon.

den andre vanligste metoden for å måle «kjemotaksis» innebærer bruk Av Boyden chamber transwells. Ulike konsentrasjoner av spesifikke kjemokiner plasseres i det nedre rommet av enheten, mens cellene som skal evalueres, inkuberes i den øvre innsatsen; en mikroporøs membran skiller de to kamrene og danner en støtte for cellevekst og en delvis barriere for migrasjon. Celler som telles ved membranets nedre flate, eller som akkumuleres i det nedre kammeret, vurderes vanligvis ved et enkelt fast endepunkt. Denne analysen har fordelen av en tilsynelatende rettet migrasjon, det vil si fra øvre til nedre kammer, men er fortsatt problematisk. For det første er det ingen «gradient» av kjemokiner fra topp til bunn, men bare en enkelt trinns funksjon fra lave til høye konsentrasjoner. For det andre er det ingen måte å opprettholde kjemokin differensial fra topp til bunn kamre . Til å begynne med er kjemokin-konsentrasjonen i det nedre kammeret større, men i løpet av minutter til timer utjevnes konsentrasjonene på grunn av diffusjon, hvor spesifikk kjemotaksis opphører. I stedet reflekterer langsiktige målinger mer sannsynlig et betydelig element i kjemokinese. Videre, når celler faller gjennom membranen og inn i det nedre kammeret, er det ingen mulighet for omvendt migrasjon. Endelig Er Boyden-kammeret også begrenset fordi celletelling krever avslutning av forsøket; et tidskurs krever derfor flere enheter.Mikrofluidisk teknologi kan overvinne disse begrensningene ved å generere en langsiktig stabil og kontrollerbar gradient av oppløselige faktorer som kontinuerlig kan overvåkes over tid . Ved å bruke celler som har blitt behandlet for å blokkere proliferasjon, tillater en slik enhet en sann løpende vurdering av kjemotaksis versus kjemokinese. Figur 1 viser en slik anordning hvor kilde-og vaskekonsentrasjonene opprettholdes ved å skape tilsvarende brønner hvis volumer er store i forhold til diffusiv flux gjennom forbindelseshydrogelkanalen . Ved steady state dannes en lineær konsentrasjonsgradient mellom disse to brønnene. Selv om interstitiell strømning gjennom hydrogelområdet kan forstyrre gradienten hvis det hydrostatiske trykket i de to brønnene ikke er like, elimineres trykkgradienter ved å koble kilde-og vaskebrønnene med flere kanaler og reservoarer som tjener som lavmotstandsveier for væskestrøm og trykklikevekt. Gradienter kan dermed opprettholdes i flere dager og brukes til å studere cellemigrasjon på en sensitiv og spesifikk måte med en rekke celletyper . Arbeidet som presenteres her beskriver bruken av slike enheter for å vurdere kjemotaksis for primære kulturer av glatte muskelceller og å sammenligne det med scratch og Boyden kammerteknikker for følsomhet.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (a) de nedre 3 brønnene er celle-og/eller kildebrønner for kjemokiner, og de øvre 3 brønnene tjener som reservoarer for å opprettholde tilsvarende trykk i de nedre brønnene. Avhengig av eksperimentell design kan sidebrønnene eller den sentrale brønnen tjene som kildebrønner; celler i en sentral brønn kan migrere mot forskjellige kjemokin stimuli på hver side, eller forskjellige cellepopulasjoner i sidebrønnene kan migrere mot en sentral kjemokin stimulus. (b, c) Konsentrasjonsgradienter vises skjematisk etter tilsetning av en fluorescerende fargestoffindikator med lav molekylvekt til kildebrønnen og kildebeholderen, enten 2 timer (b) eller 72 timer (c). (D) Grafisk visning av konsentrasjonsgradienter fra 0 time til 72 timer etter fluorescerende fargestofftilsetning til kildebrønn og reservoar.

2. Materialer og Metoder

2.1. Primær Glatt Muskelceller (SMC) Kultur

Aortas ble høstet fra 8 uker Gamle c57 / B6 mus (Charles River, Wilmington, MA) med steril dissekere saks. Adherent fett ble fjernet, og aortas ble inkubert i 20 minutter ved 37°C i Dulbeccos modifiserte Eagle ‘ s medium (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) som inneholdt 1% penicillin/streptomycin, 2% føtalt bovint serum og 5 mg / mL kollagenase TYPE II (Invitrogen). Aortas ble skyllet i kaldt DMEM og adventitia ble nøye dissekert bort; de ble deretter kuttet i små biter og inkubert i 30 min ved 37°C I DMEM inneholdende 1 mg / mL kollagenase type i (Invitrogen) og 0,125 mg/mL elastase TYPE III (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Etter gjentatt pipettering for å dissosiere vevet, ble den resulterende celleblandingen suspendert i fersk «SMC medium» (DMEM med 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin / streptomycin; 2% ikke-essensielle aminosyrer, 1% l-glutamin; alle reagenser fra Invitrogen) og dyrket ved 37°C i en 5% CO2 inkubator på plater belagt med 1 mg/mL fibronektin i 30 minutter. Når cellekulturen er etablert (vanligvis etter den første passasjen), dyrkes SMC på ubelagte plastflasker (Corning Incorporated, Corning, NY).

SMC ble brukt fra passasjer 2 til 7 og var 99.5% ren som vurdert ved flowcytometri etter farging for glatt muskel α-actin. For farging blir celler høstet og festet med 1% paraformaldehyd (Sigma-Aldrich)i fosfatbufret saltvann (PBS). FITC-konjugert antismooth muscle α-actin antistoff (Sigma-Aldrich) ved 1 : 100 fortynning I 10X bd perm / vask buffer (Bd Pharmingen, San Jose, California) ble brukt i 10 min ved romtemperatur. Cellene vaskes to ganger med 1% føtalt bovint serum i PBS og en gang med 1% føtalt bovint serum i PBS som inneholder 1% formaldehyd og analyseres umiddelbart ved flowcytometri (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). FITC – konjugert Mus IgG1 isotype (Bd Pharmingen) brukes som en isotypekontroll. Celler for kjemotaktiske analyser ble høstet da de hadde oppnådd sammenløp.

2.2. Mitomycin – C Behandling

Celler ble trypsinisert (0,25% trypsin-EDTA; Invitrogen) i 2 minutter ved 37°C, vasket MED SMC medium, og deretter inkubert som en enkeltcellesuspensjon i 40 µ / mL mitomycin-C (MMC; Sigma-Aldrich)I SMC medium i 30 min ved 37°C. etter to ekstra vasker i PBS ble celler vurdert for levedyktighet, proliferasjon eller migrerende kapasitet. FOR sårheling (scratch) – analysen ble MMC-behandling utført etter SMC-plating og når cellene var 100% konfluente; celler ble inkubert i 40 µ / mL MMC I SMC medium i 30 min ved 37°C og deretter vasket to ganger i PBS før analyse.

2.3. Smc Proliferasjon Hemming Assay

ETTER MMC behandling eller kontroll inkubasjon I SMC medium, SMC ble dyrket i 6-brønnplater (Corning Incorporated). Celler ble gjenvunnet etter 1 h, 24 h eller 48 h ved trypsinisering, og celletall og levedyktighet ble vurdert ved å telle ved hjelp av et hemocytometer og trypanblå ekskludering.

2.4. Sårheling / Skrapeanalyse

SMC ble dyrket i 12-brønnplater (Corning Inkorporert) til konfluent og deretter behandlet MED MMC. Etter vask ble friskt SMC-medium tilsatt og cellemonolaget ble riper på en reproduserbar måte ved hjelp av en steril 200 µ pipettespiss. Ulike konsentrasjoner av blodplatederivert vekstfaktor (PDGF ); R &D Systems, Minneapolis, Mn) I SMC media ble lagt til hver brønn. Avstanden mellom kantene på ripefeilen ble målt og i gjennomsnitt fra fem separate punkter ved 3, 6 og 9 h, eller til sårfeilen var lukket.

2.5. Boyden Chamber Transwell Assay

100 µ av SMC–suspensjoner ved 1.0–1.5 × 105 celler/mL (1.0-1.5 × 104 totale celler) ble lastet inn i de øvre transwell-innsatsene (Costar, Corning Incorporated) og 600 µ SMC-medier som inneholdt forskjellige konsentrasjoner AV PDGF ble plassert i det nedre rommet. Etter 6 h, 12 h eller 24 h inkubasjon ble transwell-membranen farget Med Hoechst 33342 (Invitrogen) i henhold til produsentens anbefaling, og transmigrerte celler på undersiden ble telt på et fluorescensmikroskop ved Hjelp Av MetaMorph NX Mikroskopiautomatisering og Bildeanalyseprogramvare (BioCompare, South San Francisco, CA). Ingen celler ble noen gang identifisert i mediet i det nedre kammeret. I eksperimenter for å vurdere om cellemigrasjon representerte kjemotaksis eller tilfeldig kjemokinese i fravær av en konsentrasjonsgradient, ble blodplateavledet vekstfaktor-BB (PDGF) tilsatt til det nedre kammeret, bare toppinnsats, eller både toppinnsats og nedre kammer.

2.6. Microfluidic Device Assay

microfluidic enheter (Figur 1 (a) -1 (c)) er utarbeidet som beskrevet andre steder . Som vist i Figur 1(d) er gradienter av tilsatte reagenser stabile i minst 72 h. Avhengig av eksperimentell protokoll plasseres celler som skal evalueres i den sentrale brønnen og forskjellige kjemotaktiske gradienter utvikles fra de to sidebrønnene. Alternativt kan migreringen av to forskjellige populasjoner av celler evalueres fra sidebrønnene, opplever identiske konsentrasjonsgradienter generert av reagenser plassert i den sentrale brønnen. Cellekonsentrasjonene var alltid 4-5 × 105 / mL og 40 µ av cellesuspensjonene (1,6–2,0 × 103 celler) ble lastet inn i testbrønner.

Celler ble inkubert i enhetene for ulike tidspunkter og deretter farget Med Hoechst 33342 (Invitrogen). Plasseringen av hver celle ble bestemt ved hjelp av fluorescensmikroskopi (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), og avstanden migrert ble vurdert ved Hjelp Av Matlab-programmet (MathWorks, Natick, MA). «Total migrasjon» er definert som summen av avstandene migrert av alle celler utover et opprinnelig startsted; denne migrasjonsindeksen brukes til statistisk analyse (Figur 2).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)

(h)

figur 2

vurdering av cellemigrasjon i mikrofluidiske enheter. Cellene ble belagt i den sentrale nedre brønnen til en mikrofluidisk enhet, med 50 ng / mL PDGF i SMC medium plassert i venstre nedre brønn og SMC medium alene plassert i høyre nedre brønn, etterfulgt av inkubasjon ved 37°C i 48 timer. (a, b) Fasekontrast bilde av cellekjemotakse fra den sentrale kanalen i retning av 50 ng / mL PDGF i venstre kanal; bildene deles langs kanalen mellom vasken og kildebrønnene, slik at kanalens fulle lengde kan vises med en forstørrelse som er tilstrekkelig til å tillate cellulær oppløsning. (c, d) Fase kontrast bilde av celle chemokinesis fra den sentrale kanalen i retning AV SMC medium bare. (e, f) Lav-effekt fluorescens bilde av venstre (e) eller høyre; (f) kanal ved 48 h etter farging Med Hoechst 33342. (g) høy effekt fluorescens bilde av venstre kanal i panel (e); den svarte firkanten uten celler nær høyre side av bildet (stjerne) er et strukturelt innlegg som markerer startpunktet for overføringen. Eksempel på migrasjonsanalyse. En vertikal rød linje betegner startpunktet; avstanden fra startpunktet til midten av hver cellekjerne måles, og summen av alle disse individuelle målingene blir den totale migreringsavstanden ved Hjelp Av Matlab.Kollagen type I (Invitrogen) brukes til å fylle kanalen mellom sentrale og sidebrønner, og er substratet gjennom hvilket celler migrerer. Både 1 mg/mL og 2 mg/mL kollagen kan brukes. Selv om 1 mg/mL kollagen resulterer i noe høyere ikke-spesifikk bakgrunnscellekemokinese og gelbelastning er teknisk vanskeligere enn med 2 mg/mL kollagen, tillater den lavere kollagenkonsentrasjonen større migrasjon av primære kulturer AV SMC, og analysefølsomheten er bedre. Med mindre annet er angitt, var konsentrasjonen av kollagen i migrasjonskanaler 1 mg / mL for alle eksperimenter.

2,7. Statistisk Analyse

Statistiske sammenligninger ble gjort Ved Hjelp Av Student-test ELLER enveis ANOVA. Betydningen ble definert på nivået.

3. Resultater og Diskusjon

som vist i Figur 3 (a), er celleproliferasjon blokkert VED MMC-behandling. DET er ingen signifikant forskjell i celleviabilitet mellom MMC-behandlet SMC (%) og ubehandlet SMC (%) i opptil 48 timer etter behandling. Således representerer celleakkumulering i de forskjellige migrasjonsanalysene sann cellebevegelse uten noen komponent av celleproliferasjon. Dette er viktig fordi uten MMC-behandling kan migrasjonsindekser fra langsiktige inkubasjoner bli forvirret av sammenfallende celleproliferasjon.

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

i scratch analyser (Figur 3(b)) med primære smc kulturer, celler tilfeldig migrert (chemokinesis) for å fylle ut defekter på sammenlignbare priser uavhengig AV PDGF konsentrasjon, inkludert i fravær av noen kjemotaktisk middel. Uten MMC-behandling har sårfeil en tendens til å lukke litt tidligere, noe som tyder på et element av celleproliferasjon.

Figur 3 (c) viser migreringsresultatene FOR SMC ved Hjelp Av Boyden chamber transwell assay. Det tidlige (12 timer) tidspunktet viser liten, men signifikant økt migrasjon som respons på 10-50 ng / mL PDGF versus ingen kjemokin i bunnbrønnen. Derimot, det var ingen skjelnes forskjell i migrasjon over en 10 fold konsentrasjonsområde AV PDGF, noe som tyder på at analysen er relativt ufølsom, i hvert fall for primære SMC kulturer. Videre er det etter 24 timer ingen forskjeller mellom noen av konsentrasjonene av kjemokiner (inkludert mediumkontrollen) som tyder på at migrasjon på dette tidspunktet er uspesifikk når cytokinkonsentrasjonene har begynt å balansere mellom topp-og bunnbrønnene.

FOR å formelt demonstrere at migrasjon over membranen i øvre brønn ikke nødvendigvis skyldes rettet kjemotaksis, BLE PDGF tilsatt til øvre brønn, med ELLER uten PDGF i nedre kammer. SELV i fravær av en kjemokingradient førte PDGF i det øvre kammeret til markert økt transmigrasjon( Figur 3 (d)); dette kan bare tilskrives økt kjemokinese.transwell-eksperimentene antyder således at selv om innledende PDGF-konsentrasjonsforskjeller kan indusere en viss grad av økt cellemigrasjon mot høyere konsentrasjoner i de nedre brønnene, fører etterfølgende PDGF-diffusjon til tilfeldig kjemokinese.

til sammenligning viser doseresponseksperimenter ved bruk av mikrofluidiske enheter (Figur 4) signifikant kjemotaksis ved konsentrasjoner så lave som 2.5 ng/mL PDGF (Figur 4 (b)), og viser en doseavhengig økning i kjemotaksis med en topp på omtrent 25-50 ng/mL (Figur 4 (a)). Interessant nok fører høyere konsentrasjoner AV PDGF (f. eks. 100 ng/mL) til mindre migrasjon, i samsvar med en høydose kjemotaksisarrest (18). Merk, uten TIDLIGERE MMC-behandling, er migrasjonsindeksen større (Figur 4 (a)), og fremhever det ikke-ugjendrivelige bidraget av spredning til «tilsynelatende» kjemotaksis som forekommer med lengre analysetider. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or «gold standard» Boyden chamber approaches.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figure 4

Microfluidic device assay. (A) Doseresponskurver med OG uten TIDLIGERE MMC-behandling. MMC-behandlet OG ikke-behandlet SMC ble plassert i sidecellebrønner, med forskjellige konsentrasjoner AV PDGF (5 ng/mL, 10 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL og 100 ng/mL) i de sentrale kildebrønnene. Migrasjon ble målt Etter Hoechst 33342 farging og fluorescens mikroskopi etter 48 timer, Ved Hjelp Av Matlab program for å beregne total migrasjon. Kontroller (KUN SMC medium) og hver KONSENTRASJON AV PDGF ble evaluert i tre eksemplarer. Signifikante forskjeller kan ses fra 5 ng / mL TIL 100 ng/mL PDGF sammenlignet med kontroll (). (B) Chemokinesis versus chemotaxis i microfluidic enheter. MMC-behandlet SMC med eller uten 2,5 ng / mL PDGF ble belagt i den sentrale cellebrønnen; 2,5 ng / mL eller 50 ng / mL PDGF ble tilsatt til sidekildebrønnene. UTEN PDGF tilstede i den sentrale cellebrønnen, viser analysen signifikant større total migrasjon etter 48 timer med 50 ng / mL i kildebrønnen («0-50») mot 2,5 ng / mL i kildebrønnen («0-2.5»). Tilstedeværelsen av 2,5 NG / mL PDGF i den sentrale cellebrønnen fører til betydelig større total migrasjon når det er en konsentrasjonsgradient («2,5–50»; ) tilskrives en lokal chemokinesis effekt. I fravær av en gradient («2.5–2.5»), er det en chemokinesis-assosiert migrasjon som er betydelig mindre enn migrasjonen sett når en gradient er tilstede («0-2.5»; ). (c) time-course eksperiment utført som panel (b).

ikke bare kan microfluidic enheten brukes til å måle kjemotaksis, men også det kan spesifikt skille bidragene fra kjemokinese og kjemotaksis til migrasjon(Figur 4 (b)). Dermed, i fravær av en kjemokin gradient (f.eks 2.5 ng/mL PDGF i både senter-og sidebrønner) reflekterer migrasjonsindeksen kjemokinese. Til sammenligning, uten PDGF i senterbrønnen og 2,5 ng/mL i sidebrønnen, reflekterer migrasjonsindeksen rettet kjemotaksis. Den mikrofluidiske enheten kan også vurdere kjemotaksis i nærvær av eksisterende kjemokinese, som når senterbrønnen inneholder 2,5 ng / mL PDGF og sidebrønnen inneholder 50 ng / mL. Det er en liten, men statistisk større migrasjon når stimulansen er en kjemotaktisk gradient i stedet for enkel kjemokinese.siden kjemokin-gradienten er etablert innen 2 timer (17), og er stabil i flere dager, kan celler kontinuerlig migrere opp konsentrasjonsgradienten over tid (Figur 4(c)). Til sammenligning har andre klassiske metoder enten ingen konsentrasjonsgradient (skrapeanalyse) eller bare en forbigående kjemokingradient, slik at kjemokinese—snarere enn rettet kjemotaksis—i økende grad bidrar.mikrofluidic enheten rapportert i dette arbeidet er overlegen i en rekke henseender sammenlignet med andre in vitro tilnærminger tidligere brukt til å studere kjemotaksis. Spesielt Har Boyden-kammeret-som involverer en kjemokin-gradient over en porøs membran—vært en standard kjemotaktisk analyse siden 1950-tallet. denne enheten har imidlertid betydelige begrensninger ved at gradienter ikke er stabile eller lineære, med en innledende skarp konsentrasjonstrinn som gradvis forverres over tid. Mer nylig ble mikroelektromekaniske systemer (MEMS) teknologier utviklet som bruker mikrofluidiske biochips for å etterligne in vivo-forhold; i disse enhetene blir celler kontinuerlig utsatt for skjærkrefter under kontrollert strømning. Den kontinuerlige strømmen av disse enhetene gir imidlertid en utfordring for vedlikehold av stabile kjemokingradienter. Selv om hydrogeler mellom kilde-og vaskekanalen kan skape lineære konsentrasjonsgradienter, kan subtile variasjoner i brønnene og kanalene skape trykkgradienter som forstyrrer gradientene gjennom interstitial strømning ; videre har den kontinuerlige strømmen av enhetene en tendens til å fortynne eventuelle kjemoattractanter utskilt av cellekilder. I romanen microfluidic enheten beskrevet tidligere og validert for glatt muskel celle migrasjon i dette papiret, stort volum kilde og vask brønner opprettholde stabile chemokine gradienter i koble hydrogel; noen interstitiell strømning elimineres ved å koble kilden og vask brønner med flere kanaler og reservoarer som fungerer som en motstand-kondensator krets. Konsentrasjonsgradientene er således stabile og lineære i flere dager. Det nåværende arbeidet har ytterligere raffinert søknaden, inkorporert mitomycin-C-behandling for å redusere eventuelle forvirrende bidrag av spredning og demonstrere hvordan kjemotaksis og kjemokinese kan vurderes i samme eksperimentelle oppsett.

Interessekonflikt

forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Takk

dette arbeidet ble støttet Av Et Tilskudd FRA Bwh-BRI Fund For Å Opprettholde Forskningskvalitet-Bridge Research Grant. Chen Zhang ble støttet Av China Scholarship Council i 18 måneder. Ovid C. Amati Og Richard T. Lee ble støttet delvis AV NSF Science And Technology Center CBET-0939511.