Dyr

Sebrafisk ble opprettholdt ved 28,5 °C på en 14 timer på/10 timer AV lys syklus I Danieau løsning . Den kombinatoriske krystallmutanten (albb4 / b4; nacrew2 / w2; roya9 / a9) ble generert ved sekvensielt kryssing av tre forskjellige enkeltmutantstammer, nemlig nacrew2 / w2 (ref. 9), roya9 / a9 (ref. 4) og albb4 / b4 (ref. 18) mutanter. Det er viktig at både larver og voksen krystallsebrafisk er levedyktige og ikke viser synlige morfologiske, funksjonelle eller atferdsmessige abnormiteter annet enn pigmenteringsfenotypen. Casper mutanten ble oppnådd ved å krysse nacrew2 / w2 og roya9/a9 mutanter, som tidligere beskrevet4. AB-linjen ble brukt til å skaffe vill type sebrafisk. Transgene linjer som brukes i denne studien inkluderer Tg (elavl3: GCaMP5G)21 og Tg (elavl3:GCaMP6f)28. Konfokale funksjonelle imaging eksperimenter ble utført i nacre mutant. Lysark imaging eksperimenter ble utført i nacre, casper og krystall mutanter. To-foton funksjonelle imaging eksperimenter ble utført i krystall larver. FOR Å behandle sebrafisklarver med PTU fulgte vi standard prosedyrer8, spesielt larver ble oppdratt i 200 µ PTU (Sigma) i Danieau-oppløsning fra 24 timer etter befruktning (hpf). Tg (elavl3:GCaMP5G) larver brukt til konfokal funksjonell avbildning av visuelt fremkalt nevralaktivitet i optisk tektum ble behandlet med 200 µ PTU fra 24 hpf til 3 dpf og avbildet ved 4 dpf. Dette arbeidet ble godkjent av den lokale Animal Welfare And Ethical Review Body (King ‘ S College London), og ble utført i samsvar Med Animals (Scientific Procedures) Act 1986, under lisens FRA Storbritannias Hjemmekontor (PPL70/8057).

Imaging

hele dyr in vivo mikroskopi

hele dyr bilder av voksen sebrafisk ble tatt Med Et Nikon d7000 digitalt SPEILREFLEKSKAMERA utstyrt Med Et Sigma 150 mm makroobjektiv. Voksen sebrafisk ble bedøvet med 0.2% tricaine (MS222, Sigma) i fiskeanlegget vann og plassert i en 90 mm petriskål som inneholder fiskeanlegget vann. Avbildning av larver ble utført ved HJELP AV EN ZEISS Axioskop mikroskop koblet Til EXi Blå Ccd kameraer (Retiga) og Volocity oppkjøpet programvare (PerkinElmer). Larvesebrafisk ble bedøvet med 0,02% tricaine i Danieau-oppløsning og immobilisert i 1% lav smeltepunkt agarose (Sigma) på glassglass.

Confocal calcium imaging

Imaging ble utført ved HJELP AV EN ZEISS LSM 710 confocal mikroskop utstyrt med en spektral deteksjon scan hode OG EN 20X/1.0 NA vann-nedsenking mål (Carl Zeiss). Funksjonell tidsserie av visuelt fremkalte kalsiumresponser i ganglionceller i netthinnen (Rgc) ble ervervet med en hastighet på 4.1 Hz og 0.415 × 0.415 µ oppløsning (256 × 256 piksler) og 1 AU-hullsåpning. Eksitasjonslys ble levert av en 488 nm multi-line laser. Ikke-bedøvede tg(elavl3:GCaMP5G) larver ble immobilisert i 2% lavsmeltepunkt agarose (Sigma) tilberedt I Danieau-løsning og montert dorsalside opp på en hevet glassplattform som ble plassert i et skreddersydd Danieau-fylt kammer. Agarosen var tilstrekkelig til å begrense larvene slik at anestesi ikke var nødvendig. Imaging ble utført på ettermiddagen (1-8 pm).

Lys-ark imaging

hele hjernen lys-ark imaging ble utført ved HJELP AV EN ZEISS Lys-Ark Z. 1 mikroskop utstyrt med TO 10x / 0.2 NA belysning mål og en 20x / 1.0 NA vann-nedsenking deteksjon mål (Carl Zeiss). 488 nm laser eksitasjon lys ble brukt til å lokke Fram GCaMP6f fluorescens og en 505-545 BP filter ble brukt for emittert lys deteksjon. Pivot-skanneren (Carl Zeiss) ble brukt til å levere homogen belysning og derfor unngå skygger langs belysningsaksen. Tykkelsen på lysplaten var 5.39 µ i sentrum og 10.8 µ i kantene av synsfeltet. Eksponeringstiden var 29.97 ms. Størrelsen av volumetrisk bilder ble 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 piksler) med en oppløsning på 0.415 × 0.415 × 0.631 µm. 4 dpf nacre, casper og crystal tg(elavl3:GCaMP6f) larver ble først lammet i 10-15 minutter i α-bungarotoksin (1 mg/ml; Biotium) tilberedt I Danieau-oppløsning. Deretter ble larvene immobilisert i 2% lavt smeltepunkt agarose (Sigma) og plassert inne i en glasskapillær (20 µ volum, 701904; Merke). Vi ekstruderte deretter delen av agarosecylinderen som inneholdt larvens hode fra kapillæren, og orienterte larvene slik at den dorsale siden av hodet vendte mot deteksjonsmålet og øynene stod overfor de to belysningsmålene. Hele hjernen lys-ark avbildning av casper mutant larver ble utført ved hjelp av en skreddersydd lys-ark mikroskop bygget Av Dr Martin Meyer (King ‘ S College London) og utstyrt MED EN 20x / 1.0 NA vann-nedsenking XLUMPlanFLN deteksjon objektiv (Olympus).

To-foton kalsium imaging

To-foton funksjonell bildebehandling i netthinnen ble utført ved Hjelp Av Et Nikon A1R MP mikroskop utstyrt med en 4-kanals GaAsP NDD og En Apochromat 25x / 1.1 NA vann-nedsenking objektiv (Nikon). Eksitasjon ble levert Av En Kameleon Ultra II-Modus-låst titan-safir laser (Sammenhengende) innstilt til 930 nm. Tidsserier med visuelt fremkalte kalsiumresponser ble ervervet med en hastighet på 4 Hz og 0.248 × 0.248 µ oppløsning (512 × 256 piksler). Etter aktivering av laserskanning ventet vi 60 sekunder før vi startet den visuelle stimuleringen for å sikre at retina tilpasset bakgrunnslysnivået forårsaket av multi-foton laser. 4 dpf crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) larver ble først lammet i 10-15 minutter i α-bungarotoksin (1 mg/ml; Biotium) tilberedt I Danieau-oppløsning. Deretter ble larvene immobilisert i 2% lav smeltepunkt agarose (Sigma) og montert på en hevet skreddersydd glassplattform med dorsalsiden opp (45° vinkel tilt) og ett øye vendt MOT EN LCD-skjerm (se Visuell stimulering) som ble plassert under et skreddersydd Danieau-fylt kammer. Imaging ble utført på ettermiddagen (1-8 pm).

Visuell stimulering

bevegelige barer i konfokal forberedelse

bevegelige barer stimuli ble generert som tidligere beskrevet22, 33. Et diffusjonsfilter (3026, Rosco) ble bundet til den ene siden av kammeret for å tjene som en projeksjonsskjerm. Agarosen foran øyet mot projeksjonsskjermen ble fjernet, noe som ga en uhindret visning av det projiserte bildet på siden av kammeret. Larvene ble plassert 3 cm fra skjermen, og det projiserte bildet fylte et synsfelt på ~97 ° × 63°. Visuelle stimuli besto av lys (56 cd/m2) eller mørke stenger (8 cd/m2) (henholdsvis 175% og 25% av gjennomsnittlig luminans) på en gjennomsnittlig grå bakgrunn (32 cd/m2). Da ingen kvalitative forskjeller mellom lyse og mørke barer ble notert, ble data oppnådd ved hjelp av de to stimuli kombinert. Hver stolpe var 10° i bredde i bevegelse med en hastighet på 20° / s og skilt fra den foregående stolpen med 30°, noe som muliggjør mer enn en stolpe på skjermen til enhver tid. De lange aksene til stolpene var ortogonale til bevegelsesretningen. Hver av de 12 bevegelsesretningene ble presentert en gang (3 sekunder) i en pseudo-tilfeldig rekkefølge unik for hver skive i hvert dyr avbildet. Hvert inter-epokintervall var 10 sekunder for Å aktivere GCaMP5G-signaler for å gå tilbake til baseline. En tom skjerm null tilstand på 2 sekunder ble også interleaved. Visuelle eksperimenter ble generert og kontrollert ved hjelp av Spesialskrevet Labview og MATLAB-kode( MathWorks), implementert på En ViSaGe stimulus presenter (Cambridge Research Systems) og levert via EN DLP Pico Projektor (Optoma).

flytte rister i to-foton forberedelse

Flytte rister stimuli i to-foton forberedelse ble generert og kontrollert Ved Hjelp PsychoPy39, og levert gjennom EN LCD-skjerm (SKD5VA-3, GoodWell Technology) plassert under en skreddersydd Perspex kammer. Et long-pass rødt glassfilter (FGL610, Thorlabs) ble plassert mellom LCD-skjermen og kammeret for å muliggjøre samtidig avbildning og visuell stimulering. Larvene ble plassert 2 cm fra skjermen, og BILDET på LCD-skjermen fylte et synsfelt på ~140 ° × 100° (gjennomsnittlig bakgrunnsluminans 30,4 cd/m2). Visuelle stimuli besto av firkantbølgegitter(100% kontrast, romlig frekvens 1,66 sykluser / cm, tidsmessig frekvens 1 sykluser / s). Hver gitterstang var 8,5° i bredde og de lange aksene til stengene var ortogonale til bevegelsesretningen. Hver av de 12 retninger av bevegelse ble presentert en gang (6 sekunder) med og inter-epoke intervall på 10 sekunder for Å aktivere GCaMP6f signaler for å gå tilbake til baseline. En tom skjerm null tilstand på 6 sekunder ble også interleaved. TTL utløser (0-5-0 Volt) for å registrere epoch time hendelser der generert gjennom En LabJack USB DAQ enhet (U3-LV, LabJack Corporation). Etter aktivering av laserskanning ventet vi 60 sekunder før vi startet den visuelle stimuleringen for å sikre at retina tilpasset bakgrunnslysnivået forårsaket av multi-foton laser.

Optomotorisk responsanalyse

Individuelle 5 dpf-larver ble plassert i en 35 mm petriskål som inneholdt Danieau-oppløsning. LCD-skjermen på en iPhone 5 (Apple) styrt Av En MacBook Pro (Apple) Via Duet-Skjerm (Kairos Technologies) ble brukt til å vise svarte og hvite firkantbølgegitter (85% kontrast, romlig frekvens 0,33 sykluser/mm, tidsmessig frekvens 3,5 sykluser/s) som beveger seg i 4 retninger (90° vinkelavstand) nederst på petriskålen. Visuelle stimuli ble generert I Keynote (Apple). Hver larve ble testet 5 ganger totalt (hver prøve varte 6 s etterfulgt av 10 s statiske rister) og scoret i henhold til forsøkene den reagerte på(dvs. fisk svinger og svømmer i retning av de bevegelige ristene). Larvenes oppførsel ble visuelt overvåket ved hjelp Av et m165 FC stereomikroskop (Leica).

Analyse

Funksjonsanalyser

in vivo kalsiumavbildningsdata ble analysert som tidligere beskrevet22,33. Oppsummert ble funksjonelle tidsserier behandlet før analysen som følger: tidsseriebilder fra hvert eksperiment ble korrigert for bevegelse med en stiv kroppsalgoritme (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/), median filtrert med en kjernestørrelse på 1 voxel for å fjerne mørk og skutt støy, og romlig glattet med EN 2d Gaussisk kjerne = 2 voxel for å forbedre signal-til-støy. En baseline (B) som korrigerer for lavfrekvente fonner ble bestemt ved hjelp av en kubikk-spline algoritme ekstrapolere mellom knop gjennomsnitt fra 5 s av inter-epoke intervall data. Både relativ signalintensitet endres (HRYVNASF = F-B; Hvor f = rå fluorescens) og normaliserte signalintensitetsendringer ble beregnet ved hver voxel. Δ ble brukt til populasjonsfunksjonsdata (voxel-analyse), mens %Δ/F0 ble brukt for manuelt definerte interesseområder (ROIs). For hver voxel ELLER ROI ble integralresponsen over epokintervallet beregnet for å gi en enkelt responsmåling for hver presentert retning av stimulusbevegelse. Integralet i hvert epokevindu er en sammendragsmåling som er mer motstandsdyktig mot metningseffekter av kalsiumproben enn maksimal signalendring. En terskel for hver voxel i en bildesekvens for anskaffelse ble bestemt ut fra VARIANSEN TIL Δ-endringer i mellomepokintervallene og nullbetingelsen, terskel = 5 × SDs. Alle voxels som var overterskel innen minst to visuelle presentasjonsepoker ble ansett som visuelt responsive og utsatt for ytterligere karakterisering.for å analysere retning og orientering selektivitet av visuelt responsive voxels retning-og orientering-selektive indekser (DSI og OSI)40, basert på monterte von-Mises eller Gaussiske profiler41, ble beregnet sammen Med et estimat For deres godhet av passform, R2. DSI ble definert som (Rpref-Rnull)/(Rpref + Rnull), Hvor Rpref, responsen på den foretrukne retningen, var integralresponsen over den foretrukne retningen epokintervallet. Rnull ble på samme måte beregnet som integralresponsen fremkalt av retningen motsatt den foretrukne retningen. OSI ble definert som (Rpref-Rorth)/(Rpref + Rorth), Hvor Rpref, responsen på den foretrukne orienteringen, var integralresponsen over det foretrukne orienteringsepokintervallet. Rorth ble tilsvarende beregnet som integral respons fremkalt av ortogonale orientering. For å minimere kryss snakk og over-montering forbundet MED dsi og OSI beregninger, en streng tilnærming ble gjennomført. FOR at en voxel skal betraktes som retningsselektiv (DS) eller orientering-selektiv (OS), ble gjensidig eksklusive kriterier brukt: DS if DSI > 0.5 og OSI < 0.5; OG OS hvis OSI > 0.5 og DSI < 0.5. I begge tilfeller måtte godheten til fit (R2) for HENHOLDSVIS dsi og OSI være > 0,8; dermed forklarte de monterte kurvene minst 80% av de integrerte responsene. En enkelt von-Mises-distribusjon ble brukt til å tilpasse RESPONSENE TIL DS voxels og estimere deres foretrukne bevegelsesvinkel fra midten av den monterte kurven. Summen av to von-Mises (180° vinkelavstand fra hverandre) ble brukt til å passe TIL SVAR FRA OS voxels og estimere deres foretrukne orientering av bevegelsesvinkler fra sentrene til de monterte kurvene. Sirkulær varians ble også beregnet for sammenligning som en alternativ metrisk av orienteringsselektivitet (Sirkulær varians < 0,4) 41.

Morfologiske Analyser

for å bestemme hjernevolumet avbildet i 4 dpf nacre, casper Og krystall Tg (elavl3:Gcamp6f) larver, beregnet vi antall GCaMP6f + voxels i hvert volumetrisk bilde ved å bruke juster>terskelfunksjon etterfulgt av analyse>histogram>listekommando I ImageJ42. Deretter ble de oppnådde verdiene multiplisert med volumet av en enkelt voxel (0.415 × 0.415 × 0.631 µ3 = 1.086 × 10-1 µ3).

Statistiske Analyser

Statistiske testresultater er rapportert I Tall og figurlegender. Statistiske analyser og tester ble utført ved Hjelp Av Prism 6 (GraphPad) eller MATLAB R2014b (MathWorks). Før statistiske tester ble utført, ble deskriptiv statistikk (f. eks. normalitetstester for å se om verdiene kommer Fra En Gaussisk fordeling eller F-test for å sammenligne avvik) brukt til å velge riktig statistisk test (rapportert i Figurlegender sammen med testresultater). Kriteriet for statistisk signifikans ble satt til p < 0,05 .